丙氨酰—谷氨酰胺二肽合成工藝研究進(jìn)展

石昌榮 唐果 莊榮強(qiáng) 趙玉芬

摘 要 目的：為丙氨酰-谷氨酰胺二肽（Ala-Gln）類藥物的進(jìn)一步研究和生產(chǎn)提供參考。方法：以“丙氨酰-谷氨酰胺二肽”“合成工藝”“谷氨酸水解法”“D-氯（溴）代丙酸法”“N-羧基內(nèi)酸酐法”“活化酯法”“三苯基膦/六氯乙烷縮合法”“Ala-Gln peptides drugs”“Synthetic process”“Appel condensation method”等為關(guān)鍵詞，組合查詢?cè)谥袊W(wǎng)、Web of Science等數(shù)據(jù)庫中收錄的1987年1月-2017年12月發(fā)表的相關(guān)研究文獻(xiàn)，進(jìn)行歸納和總結(jié)。結(jié)果與結(jié)論：共檢索到相關(guān)研究文獻(xiàn) 678篇，其中有效文獻(xiàn)25篇。Ala-Gln以往的合成方法主要有谷氨酸水解法、D-氯（溴）代丙酸法、N-羧基內(nèi)酸酐法、活化酯法、酶催化合成法等，這些方法存在步驟煩瑣、反應(yīng)成本高、帶有毒性、合成路線長、大批量生產(chǎn)的產(chǎn)率難以控制等缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約了其推廣應(yīng)用。三苯基膦/六氯乙烷縮合法具有合成成本低、可行性好、穩(wěn)定性高、合成周期短等突出優(yōu)點(diǎn)，為推動(dòng)Ala-Gln類藥物大規(guī)模的生產(chǎn)和應(yīng)用提供了可能。

關(guān)鍵詞 丙氨酰-谷氨酰胺二肽；合成工藝；三苯基膦/六氯乙烷縮合法

中圖分類號(hào) R914 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）14-1999-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.28

谷氨酰胺（Glutamine，Gln）是人體的非必需氨基酸，是合成核酸和谷胱甘肽等的前體物質(zhì)，其生理功能具有多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，Gln在保護(hù)肝臟功能、治療胃腸疾病、改善患者營養(yǎng)狀況等方面起著重要的作用[1-3]。其主要機(jī)制為：（1）Gln作為氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)劑，可逆轉(zhuǎn)脂質(zhì)過氧化過程，恢復(fù)谷胱甘肽含量，通過過氧化氫誘導(dǎo)的谷胱甘肽過氧化物酶以增強(qiáng)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶的活性，增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而對(duì)抗氧自由基對(duì)肝臟的氧化損傷[4-5]；（2）手術(shù)、創(chuàng)傷、嚴(yán)重感染等應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)導(dǎo)致患者營養(yǎng)不良，提高Gln在血液中的濃度，可促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成、降低其分解，改善患者營養(yǎng)狀況[6]。大量研究表明，在人類腫瘤（如三陰性乳腺癌、肺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤等）中，Gln的代謝途徑處于異常激活狀態(tài)，其機(jī)體需要量大大超過了機(jī)體自身合成Gln的能力[7-8]。Lieberman BP等[9]利用18F-（2S，4R）-4-氟代谷氨酰胺探針對(duì)腫瘤內(nèi)Gln分解途徑進(jìn)行監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)了活體層面的腫瘤正電子發(fā)射斷層掃描（PET）成像，發(fā)現(xiàn)Gln作為代謝的關(guān)鍵營養(yǎng)因子具有用作示蹤代謝指示劑的可能，為Gln的研究開辟了新的思路。另有研究發(fā)現(xiàn)，Gln可以調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)通路，而巨噬細(xì)胞在腫瘤的發(fā)展和免疫抑制等方面起著重要的作用，也預(yù)示著Gln在介導(dǎo)腫瘤的免疫治療中有著巨大的潛力[10]。然而有關(guān)Gln理化性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，其水溶性?。ㄈ芙舛戎挥?6 g/L），以水溶液形式長期儲(chǔ)存時(shí)化學(xué)穩(wěn)定性不足，且高溫消毒時(shí)易生成有毒的焦谷氨酸和氨等[11]，這些缺點(diǎn)限制了Gln在臨床上的使用。因此，合成既不改變Gln原有功能、又能克服單體Gln已知缺點(diǎn)的Gln類似物成為推動(dòng)Gln應(yīng)用的關(guān)鍵。有研究通過合成的丙氨酰-谷氨酰胺二肽 （Ala-Gln） 作為 Gln的替代品，以彌補(bǔ)Gln的不足：Ala-Gln具有高熱穩(wěn)定性，水溶性達(dá)到586 g/L，其在體內(nèi)可以快速地被代謝成Ala和Gln，具有很好的生物利用度，口服后僅有1%～2%的二肽從尿液中被排出體外，因此其在臨床上被廣泛用作Gln的替代品[11]。周燕萍等[12]在對(duì)64例臨床病例的研究中發(fā)現(xiàn)，在胃腸道術(shù)后應(yīng)用Ala-Gln是安全和有效的。目前，文獻(xiàn)中報(bào)道的Ala-Gln合成方法主要有酸酐法、酰鹵法和活化酯法[13-14]。為利于該類藥物的后續(xù)研究和生產(chǎn)，筆者以“丙氨酰-谷氨酰胺二肽”“合成工藝”“谷氨酸水解法”“D-氯（溴）代丙酸法”“N-羧基內(nèi)酸酐法”“活化酯法”“三苯基膦/六氯乙烷縮合法”“Ala-Gln peptides drugs”“Synthetic process”“Appel condensation method”等為關(guān)鍵詞，組合查詢?cè)谥袊W(wǎng)、Web of Science等數(shù)據(jù)庫中收錄的1987年1月-2017年12月發(fā)表的相關(guān)研究文獻(xiàn)（共檢索到相關(guān)研究文獻(xiàn) 678篇，其中有效文獻(xiàn)25篇），進(jìn)行了歸納和總結(jié)。

1 Ala-Gln合成方法

1.1 谷氨酸水解法

由于谷氨酸比較穩(wěn)定，Yasutsugu S等[15]利用芐氧羰基保護(hù)的Ala（Cbz-Ala）和谷氨酸甲酯通過二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）縮合反應(yīng)合成二肽，可用催化氫解脫去氨基的Cbz保護(hù)基，得到丙氨酸谷氨酸γ-羧基甲酯，該甲酯經(jīng)濃氨水氨解后，即可得到Ala-Gln（見圖1）。

該方法采用了價(jià)格便宜的谷氨酸替代Gln，實(shí)現(xiàn)了Ala-Gln的合成，但反應(yīng)過程中需要對(duì)氨基酸進(jìn)行保護(hù)和脫保護(hù)，步驟較為煩瑣，同時(shí)也增加了反應(yīng)成本。另外，貴金屬鈀的高成本和殘留以及反應(yīng)生成難除盡的二環(huán)己基脲（DCU）帶來的毒性制約了該方法的應(yīng)用，故不適于規(guī)?；a(chǎn)。

1.2 D-氯（溴）代丙酸法

Yasutsugu S等[15]利用手性的D-氯（溴）代丙酸經(jīng)二氯亞砜活化，形成酰氯，然后滴加到Gln的氫氧化鈉水溶液中，保持pH在10左右，反應(yīng)中間體經(jīng)氨解后生成Ala-Gln（見圖2）。

該合成方法操作較簡便、步驟短，但手性原料貴，大大增加了合成成本。該合成過程使用到水作為溶劑，而反應(yīng)物酰氯又容易水解，因此該方法會(huì)產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物從而導(dǎo)致偶聯(lián)產(chǎn)率較低。此外，D-2-溴丙?；?L-Gln的氨解需要升高溫度，亦導(dǎo)致副產(chǎn)物的增加，尤其是導(dǎo)致氨基酸的消旋化，最終得到的Ala-Gln的光學(xué)純度較低，比如產(chǎn)物中可能混有D-Ala-L-Gln、D-Ala-D-Gln、L-Ala-D-Gln等消旋體。產(chǎn)率低問題成為限制該合成工藝發(fā)展的主要因素。肖湘等[16]報(bào)道，將 2-（氯代）丙?；扰cGln反應(yīng)，然后再氨解，通過兩步反應(yīng)能簡便而有效地獲得Ala-Gln，且保持溶液在堿性條件（pH為9～10.5）時(shí)，產(chǎn)品收率可達(dá)到 52%，但其純化水平距離大規(guī)模生產(chǎn)要求還有很長一段路。

1.3 N-羧基內(nèi)酸酐法

丙氨酸與光氣反應(yīng)生成N-羧基內(nèi)酸酐，隨后將N-羧基內(nèi)酸酐緩慢滴加到Gln的水溶液中，通過添加氫氧化鈉使溶液的pH保持在10.2，反應(yīng)完成后酸化，即可得到Ala-Gln[17]（見圖3）。

該方法合成步驟短，避免了使用保護(hù)基，合成成本較低。但該方法缺點(diǎn)也非常明顯：一方面由于N-羧基內(nèi)酸酐活性非常高，無法保存；另一方面，N-羧基內(nèi)酸酐與Gln反應(yīng)時(shí)，容易生成三肽、四肽等副產(chǎn)物，其副產(chǎn)物的總量很大，導(dǎo)致該方法的產(chǎn)率較低，且對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的純化較為困難。同時(shí)，光氣為有毒物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)不完全時(shí)可能對(duì)人體產(chǎn)生毒性。陳然等[18]報(bào)道用鄰苯二甲?；鳛楸Ｗo(hù)基，采用混合酸酐法將鄰苯二甲?；Ｗo(hù)的丙氨酸與 L-Gln縮合成鄰苯二甲酰基保護(hù)的Ala-L-Gln，最后采用水合肼脫除鄰苯二甲酰基，并按中試規(guī)模制備了目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln，以L-Ala計(jì)總摩爾收率為34.4%。較高的收率在一定程度上推動(dòng)了該方法用于大規(guī)模生產(chǎn)的進(jìn)程。但由于水合肼腐蝕性強(qiáng)，在大規(guī)模生產(chǎn)過程中需要特殊設(shè)備，也增加了生產(chǎn)成本，且目前產(chǎn)物的收率和雜質(zhì)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)也限制了其工業(yè)化應(yīng)用。

1.4 活化酯法

潘和平等[19]利用叔丁氧羰基保護(hù)的丙氨酸，與N-羥基琥珀酰亞胺在DCC縮合下，形成穩(wěn)定的活化酯，再將活化酯滴加到谷氨酸甲酯飽和的碳酸氫鈉溶液中，反應(yīng)完成后酸化，得到叔丁氧羰基保護(hù)的丙氨酰-谷氨酸甲酯二肽，產(chǎn)物經(jīng)不飽和脂肪酸脫去叔丁氧羰基保護(hù)基，再經(jīng)濃氨水氨解后，即可得到Ala-Gln（見圖4）。

該合成方法操作較簡便，且隨著其工藝的成熟，合成過程中的雜質(zhì)也更易于控制，因此是目前各廠家合成Ala-Gln的主要工藝。但其不足之處是合成路線長，導(dǎo)致最后一步無法獲得較多的合格產(chǎn)品，且其副產(chǎn)物DCU很難完全除去，加之原料N-羥基琥珀酰亞胺價(jià)格貴，也限制了其進(jìn)一步大規(guī)模推廣應(yīng)用。

1.5 三苯基膦/六氯乙烷（Appel）縮合法

本課題組采用亞磷酸酯保護(hù)的丙氨酸與三苯基膦和六氯乙烷先在有機(jī)溶劑中反應(yīng)生成活化酯，再與Gln于有機(jī)溶劑中進(jìn)行反應(yīng)，而后在酸溶液中脫去N端保護(hù)基團(tuán)，最終得到Ala-Gln（見圖5）。

該合成方法具有操作較簡便、用時(shí)短、產(chǎn)率高、合成成本低等優(yōu)點(diǎn)，適宜大規(guī)模生產(chǎn)，獲得了中國專利：CN1683391[20]，國際專利公開號(hào)：WO03/106481A1。該方法優(yōu)化了Ala-Gln合成反應(yīng)條件，通過了中試，驗(yàn)證了小試工藝技術(shù)的可行性、穩(wěn)定性，為Ala-Gln合成的國產(chǎn)化推廣奠定了基礎(chǔ)。本課題組利用中試產(chǎn)品已申報(bào)3類原料藥，并獲受理（閩新藥受理號(hào)：20030021）。

1.6 酶催化合成法

Tabata K等[21]報(bào)道了通過大腸桿菌來生產(chǎn)Ala-Gln的發(fā)酵工藝，該大腸桿菌上表達(dá)有L-氨基酸α-連接酶，可三磷酸腺苷依賴性地合并Ala和Gln，從而催化Ala-Gln的形成。Yokozeki K等[22]篩選了能夠催化Ala-Gln合成反應(yīng)的971種微生物菌株，發(fā)現(xiàn)短穩(wěn)桿菌（ATCC 14234）具有非常好的效能，并從該菌中純化出了可用于生產(chǎn)Ala-Gln的酶。Miyazawa T等[23]報(bào)道了一種動(dòng)力學(xué)控制酶催化合成Ala-Gln的前體Z-Ala-Gln的方法：利用低廉的木瓜蛋白酶作為催化劑，可以在35 ℃、pH 9.5的條件下合成Z-Ala-Gln，Ala-Gln的產(chǎn)率可以達(dá)到35.5%。Hernández JG等[24]利用機(jī)械研磨的方法，使酶催化生產(chǎn)Ala-Gln的產(chǎn)率提高至45%。洪翔等[25]利用重組枯草芽孢桿菌L-氨基酸連接酶成功地生物合成出Ala-Gln，為Ala-Gln的生物制造奠定了理論基礎(chǔ)。利用酶催化的方法反應(yīng)不需要使用保護(hù)基，沒有用到化學(xué)試劑，可以得到手性單一的產(chǎn)物，小批量生產(chǎn)的產(chǎn)率較高；但同時(shí)亦有發(fā)酵產(chǎn)酶純化過程復(fù)雜、酶在使用一段時(shí)間后容易失活、大批量生產(chǎn)的產(chǎn)率較難控制等不足。

2 結(jié)語

綜上所述，多種合成Ala-Gln的方法和工藝推動(dòng)了其在臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。目前的合成方法主要存在氨解時(shí)氨基酸存在手性異構(gòu)等問題，這些問題都限制了其工業(yè)化應(yīng)用并給產(chǎn)品的安全性帶來了隱患。與其他方法相比，谷氨酸水解法煩瑣的反應(yīng)步驟、高額的合成成本以及毒性問題使其具有一定的局限性。D-氯（溴）代丙酸法相比谷氨酸水解法在合成步驟上更為簡易，成本相對(duì)低廉，但其產(chǎn)物的純度是限制其發(fā)展的主要因素。N-羥基丙酸酐法較之前兩種方法，合成步驟更為簡易，合成周期短，因避免了使用保護(hù)基使其合成成本更加低廉，但該方法存在反應(yīng)副產(chǎn)物過多導(dǎo)致其目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率不夠高的問題，使其用于大規(guī)模生產(chǎn)受到限制。目前活化酯法是應(yīng)用最廣泛的合成方法，較之以上方法其具有較高的產(chǎn)率、較短的合成周期等優(yōu)點(diǎn)，但高成本是限制其大規(guī)模生產(chǎn)的主要原因。Appel縮合法的出現(xiàn)以其合成成本更加低廉、可行性好、穩(wěn)定性高、合成周期短等突出的優(yōu)點(diǎn)為推動(dòng)Ala-Gln的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用提供了可能。相對(duì)于化學(xué)合成的方法，酶催化合成法可以得到手性單一的產(chǎn)物，小批量產(chǎn)率較高、毒性小，但其生產(chǎn)條件要求極為嚴(yán)格，生產(chǎn)中的酶極易失活。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 周健，司繼剛. 丙氨酰谷氨酰胺的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國藥房，2016，27（26）： 3739-3741.

[ 2 ] HARTMANN R，LICKS F，SCHEMITT E G，et al. Effect of glutamine on liver injuries induced by intestinal ischemia-reperfusion in rats[J]. Nutri Hosp，2017，34（3）：548-554.

[ 3 ] NEWSHOLME EA，CALDER PC.The proposed role of glutamine in some cells of the immune system and speculative consequences for the whole animal[J]. Nutrition，1997，13（13）：728-730.

[ 4 ] ZHAI Y，SUN Z，ZHANG J，et al. Activation of the TOR signalling pathway by glutamine regulates insect fecundity[J]. Sci Rep，2015. DOI：10.1038/SREP/0694.

[ 5 ] AMORES-S NCHEZ MI，MEDINA MA. Glutamine，as a precursor of glutathione，and oxidative stress[J]. Mol Genet Metab，1999，67（2）：100-108.

[ 6 ] COSTER J，MCCAULEY R，HALL J. Glutamine： metabolism and application in nutrition support[J]. Asia Pac J Clin Nutr，2004，13（1）： 25-31.

[ 7 ] TIAN Y，DU W，CAO S，et al. Systematic analyses of glutamine and glutamate metabolisms across different cancer types[J]. Chin J Cancer，2017，36（1）：88-96.

[ 8 ] ZHANG J，PAVLOVA N N，THOMPSON C B. Cancer cell metabolism： the essential role of the nonessential amino acid，glutamine[J]. EMBO J，2017，36（10）：1302-1315.

[ 9 ] LIEBERMAN BP，PLOESSL K，WANG L，et al. PET imaging of glutaminolysis in tumors by 18F-（2S，4R）4-fluoroglutamine[J]. J Nucl Med，2011，52（12）：1947-1955.

[10] SARTORI T，GALVAO DOS SANTOS G，NOGUEIRA- PEDRO A，et al. Effects of glutamine，taurine and their association on inflammatory pathway markers in macrophages[J]. Inflammopharmacology，2018，26（3）：829-838.

[11] YAGASAKI M，HASHIMOTO S. Synthesis and application of dipeptides：current status and perspectives[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2008，81（1）：13-22.

[12] 周燕萍，龔茜芬，王自強(qiáng). 丙氨酰谷氨酰胺雙肽在胃腸道術(shù)后應(yīng)用的安全性和有效性觀察[J].中國藥房，2005，16（17）：1321-1323.

[13] 楊琪. 丙氨酰谷氨酰胺的制備工藝改進(jìn)[J]. 科技展望，2015（8）：77.

[14] 柯遠(yuǎn). 丙谷二肽合成工藝改進(jìn)[D]. 濟(jì)南：濟(jì)南大學(xué)，2013.

[15] YASUTSUGU S，SHUMPEI S，SHIRO A. Studies on the synthesis of peptides containing glutamine as the c-terminal.1.protection of amide-nitrogen with xanthyl group during peptide synthesis[J]. Bull Chem Soc Jpn，2006，35（12）： 1966-1970.

[16] 肖湘，覃軍，王祥智. 丙氨酰-谷氨酰胺的簡便有效合成 [J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用，2002（3）：332-333.

[17] DJA ERICKSON RA，F(xiàn)ROEN DE，et al. The synthesis of the high-potency sweetener，nc-00637. part 2： preparation of the pyridine moiety[J]. Org Process Res Dev，2004，8（1）： 62-71.

[18] 陳然，錢紹松，吳曉燕，等. 10 t/a中試規(guī)模制備二肽L-丙氨酰-L-谷氨酰胺[J]. 精細(xì)化工，2005（12）：958-960.

[19] 潘和平，王良友，徐琪壽，等. 液相合成含谷氨酰胺、天門冬酰胺肽鏈的方法及其中間體：中國，CN1295079[P].2001-05-16.

[20] 唐果，趙玉芬，許鵬翔，等. N（2）-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法：中國，CN1683391[P].2005-10-19.

[21] TABATA K，HASHIMOTO S. Fermentative production of L-alanyl-L-glutamine by a metabolically engineered Escherichia coli strain expressing L-amino acid alpha-ligase [J]. Appl Environ Microbiol，2007，73（20）： 6378-6385.

[22] YOKOZEKI K，HARA S. A novel and efficient enzymatic method for the production of peptides from unprotected starting materials[J]. J Biotechnol，2005，115（2）：211- 220.

[23] MIYAZAWA T，HORIMOTO T，TANAKA K. Kinetically controlled peptide synthesis mediated by papain using the carbamoylmethyl ester as an acyl donor[J]. Int J Pept Res Ther，2014，20（3）：371-376.

[24] HERN?NDEZ JG，ARDILA-FIERRO KJ，CRAWFORD D，et al. Mechanoenzymatic peptide and amide bond formation [J]. Green Chem，2017，19（11）： 2620-2625.

[25] 洪翔，朱新雅，賈子樊，等.利用重組枯草芽孢桿菌L-氨基酸連接酶合成丙谷二肽 [J]. 發(fā)酵科技通訊，2017，46（2）： 83-87.

（收稿日期：2018-02-06 修回日期：2018-04-08）

（編輯：張 靜）