氣相色譜法同時(shí)測(cè)定麝香追風(fēng)止痛膏中5種揮發(fā)性成分的含量

黃傳俊 陳云 曾博程 劉勇 曾凡華 王文娟 葉修文 杜君 代曉進(jìn) 楊紅菊 譙志文 周年華

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定麝香追風(fēng)止痛膏中5種揮發(fā)性成分含量的方法。方法：采用氣相色譜法，色譜柱為PEG-20M毛細(xì)管柱，檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器，載氣為氮?dú)猓兌龋?9.999%），柱流量為1.5 mL/min，吹掃流量為3.0 mL/min，分流比為5 ∶ 1，進(jìn)樣口溫度為200 ℃，檢測(cè)器溫度為250 ℃，程序升溫，進(jìn)樣量為2 μL，尾吹流量為40 mL/min。結(jié)果：樟腦、龍腦、異龍腦、薄荷腦、水楊酸甲酯檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍分別為19.78～247.26 μg/mL（r=0.999 6）、15.88～198.52 μg/mL（r=0.999 9）、8.60～107.56 μg/mL（r=0.999 9）、20.11～251.32 μg/mL（r=0.999 8）、12.09～151.11 μg/mL（r=0.999 3）；定量限分別為329.68、264.69、143.41、335.09、402.96 ng/mL，檢測(cè)限分別為98.90、79.41、43.02、100.53、120.89 ng/mL；中間精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于3%；加樣回收率分別為97.85%～101.52%（RSD=1.54%，n=6）、99.55%～103.75%（RSD=1.38%，n=6）、98.88%～104.23%（RSD=1.94%，n=6）、 98.11%～102.64%（RSD=1.92%，n=6）、96.55%～99.61%（RSD=1.44%，n=6）；耐用性試驗(yàn)的RSD均小于3%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性好，可用于麝香追風(fēng)止痛膏中5種揮發(fā)性成分含量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞 麝香追風(fēng)止痛膏；樟腦；龍腦；異龍腦；薄荷腦；水楊酸甲酯；氣相色譜法；含量測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）14-1931-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.14

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of 5 volatile constituents in Shexiang zhuifeng zhitong plaster. METHODS： Gas chromatography was adopted. The determination was performed on PEG-20M capillary column with flame ionization detector as detector，nitrogen （99.999%） as carrier gas， with column flow rate of 1.5 mL/min， purge flow of 3.0 mL/min， split ratio of 5 ∶ 1， injector temperature of 200 ℃， detector temperature of 250 ℃， temperature programming， sample size of 2 μL， tail blowing flow of 40 mL/min. RESULTS： The linear range of camphor， borneol， isoborneol， menthol and menthyl salicylate were 19.78-247.26 μg/mL（r=0.999 6）， 15.88-198.52 μg/mL （r=0.999 9）， 8.60-107.56 μg/mL（r=0.999 9）， 20.11-251.32 μg/mL （r=0.999 8）and 12.09-151.11 μg/mL （r=0.999 3）， respectively. The limits of quantitation were 329.68，264.69， 143.41， 335.09， 402.96 ng/mL； the limits of detection were 98.90， 79.41， 43.02， 100.53， 120.89 ng/mL， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 3%. The recoveries were 97.85%-101.52%（RSD=1.54%，n=6）， 99.55%-103.75%（RSD=1.38%，n=6）， 98.88%-104.23%（RSD=1.94%，n=6）， 98.11%-102.64%（RSD=1.92%，n=6）， 96.55%-99.61%（RSD=1.44%，n=6）， respectively. RSDs of durability test were all lower than 3%. CONCLUSIONS： The method is simple， precise， stable，reproducible and durable， and can be used for simultaneous determination of 5 volatile constituents in Shexiang zhuifeng zhitong plaster.

KEYWORDS Shexiang zhuifeng zhitong plaster； Camphor； Borneol； Isoborneol； Menthol； Menthyl salicylate； GC； Content determination

麝香追風(fēng)止痛膏由麝香追風(fēng)止痛流浸膏、樟腦、冰片、薄荷腦、水楊酸甲酯、蕓香浸膏、顛茄流浸膏等為主藥，加以橡膠、松香、氧化鋅、凡士林、羊毛脂、液體石蠟等基質(zhì)制成。其中，麝香追風(fēng)止痛流浸膏由人工麝香、生草烏、生川烏、乳香、沒(méi)藥、生馬錢(qián)子、丁香、肉桂、荊芥、防風(fēng)、老鸛草、香加皮、積雪草、骨碎補(bǔ)、白芷、山柰、干姜等藥材提取加工而成。該貼膏劑具有祛風(fēng)除濕、散寒止痛的功效[1]，臨床上廣泛用于急、慢性軟組織損傷、關(guān)節(jié)扭傷、肩周炎、頸椎病、腰腿疼痛、肌肉痛等癥的治療[2-4]。由于該制劑所含的樟腦、冰片（龍腦和異龍腦）、薄荷腦、水楊酸甲酯均為揮發(fā)性成分，在對(duì)療效產(chǎn)生貢獻(xiàn)[5-6]的同時(shí)，也顯著影響制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性，因此如何控制好上述揮發(fā)性成分的含量非常關(guān)鍵。

已有研究對(duì)該制劑（原名：麝香止痛膏）中樟腦進(jìn)行了定量分析，同時(shí)對(duì)樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯、桂皮醛、丁香酚、麝香酮等各成分進(jìn)行了鑒定[7]；也有研究就該制劑中麝香酮、桂皮醛、薄荷腦進(jìn)行了穩(wěn)定性考察[8]。但上述研究對(duì)各揮發(fā)性成分定量分析不全面，參考價(jià)值有限。本研究采用氣相色譜法同時(shí)測(cè)定該制劑中樟腦、龍腦、異龍腦、薄荷腦、水楊酸甲酯5種揮發(fā)性成分的含量，樣品分析時(shí)間約25 min，較已有文獻(xiàn)報(bào)道的分析時(shí)間大幅縮短，各組分峰之間分離度好，峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)，能更好地控制麝香追風(fēng)止痛膏的內(nèi)在質(zhì)量。現(xiàn)將有關(guān)情況報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

GC-2014型氣相色譜儀，包括氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）、AOC-20i自動(dòng)進(jìn)樣器、Lab Solutions色譜工作站（日本Shimadzu公司）；CP225D型電子分析天平、BS124S型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

麝香追風(fēng)止痛膏（重慶希爾安藥業(yè)有限公司，批號(hào)：160701、160801、161001、161201、170101、170201、170301、170501、171001、171201，規(guī)格：每片7 cm×10 cm）；樟腦對(duì)照品（批號(hào)：110747-201409，純度：98.7%）、龍腦對(duì)照品（批號(hào)：110881-201507，純度：96.8%）、異龍腦對(duì)照品（批號(hào)：111512-200802，純度：97.5%）、薄荷腦對(duì)照品（批號(hào)：110728-201506，純度：96.2%）、水楊酸甲酯對(duì)照品（批號(hào)：110707-201413，純度：99.7%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；正十四烷對(duì)照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：H1618002，純度：99.5%）；試驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：PEG-20M毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；檢測(cè)器：FID；載氣：氮?dú)猓兌龋?9.999%）；柱流量：1.5 mL/min；吹掃流量：3.0 mL/min；分流比：5 ∶ 1；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；檢測(cè)器溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度為110 ℃，保持13 min，以30 ℃/min的速率升至160 ℃，保持9 min；進(jìn)樣量：2 μL；尾吹流量：40 mL/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱(chēng)取正十四烷對(duì)照品351.63 mg，加乙酸乙酯溶解，制成正十四烷質(zhì)量濃度為3.498 7 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取樟腦對(duì)照品62.63 mg、龍腦對(duì)照品51.27 mg、異龍腦對(duì)照品27.58 mg、薄荷腦對(duì)照品62.83 mg、水楊酸甲酯對(duì)照品37.89 mg，各置于25 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容，搖勻，得單一對(duì)照品溶液。分別精密量取上述樟腦、龍腦、異龍腦、薄荷腦、水楊酸甲酯單一對(duì)照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，置于同一25 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加乙酸乙酯定容，搖勻，得混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取樣品1片，除去蓋襯，剪成小塊，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯50 mL，密塞，靜置30 min，搖勻；精密量取溶液20 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加乙酸乙酯定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液 按麝香追風(fēng)止痛膏處方和工藝制備缺樟腦、冰片、薄荷腦和水楊酸甲酯的陰性樣品，并按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果，陰性對(duì)照溶液在樟腦、龍腦、異龍腦、薄荷腦、水楊酸甲酯和正十四烷等各成分相應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，表明本方法專(zhuān)屬性良好。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加乙酸乙酯定容，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各2 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以?xún)?nèi)標(biāo)物與待測(cè)成分質(zhì)量濃度比（x，c內(nèi)/c待）為橫坐標(biāo)、峰面積比（y，A內(nèi)/A待）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，回歸方程與線(xiàn)性范圍見(jiàn)表1。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，樟腦、龍腦、異龍腦、薄荷腦、水楊酸甲酯定量限分別為329.68、264.69、143.41、335.09、402.96 ng/mL，檢測(cè)限分別為98.90、79.41、43.02、100.53、120.89 ng/mL。

2.6 中間精密度試驗(yàn)

由2名分析員在不同日期取樣品（批號(hào)：170201）適量，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件在不同儀器上進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：170201）5份，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，樟腦、龍腦、異龍腦、薄荷腦、水楊酸甲酯峰面積的RSD分別為 1.72%、1.08%、1.22%、0.96%、1.95%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：160701）適量，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，樟腦、龍腦、異龍腦、薄荷腦、水楊酸甲酯含量平均值分別為16.64、8.47、4.97、13.21、12.85 mg/片，RSD分別為2.22%、1.74%、1.95%、1.69%、2.15%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號(hào)：160701）1片，按規(guī)格尺寸平均分成2小片，取其中一小片，除去蓋襯，剪成小塊，置于50 mL量瓶中，分別加入一定量的各待測(cè)成分單一對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.10 耐用性試驗(yàn)

2.10.1 色譜柱考察 取樣品（批號(hào)：160701）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件[分別設(shè)置色譜柱為Shimadzu RTX-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）、AT·PEG-20M（30 m×0.32 mm×0.25 μm）、Phenomenex ZB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）]進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，當(dāng)色譜柱發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿(mǎn)足試驗(yàn)要求，表明耐用性良好。

2.10.2 尾吹流量考察 取樣品（批號(hào)：160701）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置尾吹流量為35、40、45 mL/min）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，當(dāng)尾吹流量發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿(mǎn)足試驗(yàn)要求，表明耐用性良好。

2.10.3 進(jìn)樣口溫度考察 取樣品（批號(hào)：160701）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置進(jìn)樣口溫度為195、200、205 ℃）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)樣口溫度發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿(mǎn)足試驗(yàn)要求，表明耐用性良好。

2.10.4 檢測(cè)器溫度考察 取樣品（批號(hào)：160701）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置檢測(cè)器溫度為245、250、255 ℃）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，當(dāng)檢測(cè)器溫度發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿(mǎn)足試驗(yàn)要求，表明耐用性良好。

2.11 樣品含量測(cè)定

取10批樣品各適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

本課題組在確定色譜條件時(shí)，參考文獻(xiàn)[9-14]，分別考察了不同提取溶劑、升溫程序、內(nèi)標(biāo)物對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙酸乙酯作提取溶劑時(shí)，有效成分可充分溶解，待測(cè)成分含量較以石油醚作提取溶劑時(shí)高；以30 ℃/min的升溫速率，25 min即可完成1次分析，與已有報(bào)道[15-17]比較縮短了分析時(shí)間；以正十四烷為內(nèi)標(biāo)時(shí)，待測(cè)成分及內(nèi)標(biāo)峰與相鄰峰之間分離度好，峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)性好，色譜結(jié)果較以萘為內(nèi)標(biāo)時(shí)[17]好。

樟腦、龍腦、異龍腦、薄荷腦、水楊酸甲酯在超聲提取時(shí)會(huì)隨著溫度的升高而揮發(fā)，本課題組考慮到這個(gè)問(wèn)題，采取了易溶解上述5種成分的乙酸乙酯作為提取溶劑進(jìn)行靜置提取，并與冰水浴超聲對(duì)比，發(fā)現(xiàn)含量無(wú)明顯差異?？紤]到靜置提取干擾因素小，方法更簡(jiǎn)單，有效避免了樣品中提取成分揮發(fā)而對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，故最終采用乙酸乙酯靜置提取揮發(fā)性成分。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性好，可用于麝香追風(fēng)止痛膏中樟腦、龍腦、異龍腦、薄荷腦和水楊酸甲酯5種揮發(fā)性成分含量的同時(shí)測(cè)定。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局. WS-11370（ZD-1370）-2002- 2012Z中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)部分：骨傷科分冊(cè)[S].2012.

[ 2 ] 呂姍珊，楊超，譙志文，等. 麝香追風(fēng)止痛膏主要藥效學(xué)研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)急癥，2014，23（5）：877-879.

[ 3 ] 楊超，唐桂英，呂姍珊，等. 麝香追風(fēng)止痛膏局部皮膚刺激性及過(guò)敏性實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)急癥，2014，23（8）：1491-1493.

[ 4 ] 陳犁，呂姍珊，周年華，等. 麝香追風(fēng)止痛膏治療肩關(guān)節(jié)周?chē)着R床研究[J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，11（1）：89-92.

[ 5 ] 丁元?jiǎng)?，馬紅梅，張伯禮，等. 樟腦藥理毒理研究回顧及安全性研究展望[J]. 中國(guó)藥物警戒，2012，9（1）：38-42.

[ 6 ] 魏楚蓉，伍趕球. 冰片的藥理作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志，2010，9（5）：447-451.

[ 7 ] 李曉光，丁一，成桂紅，等. 麝香止痛膏主要成分的分析[J]. 中成藥，2003，25（10）：795-797.

[ 8 ] 謝曉燕. 麝香止痛膏主要成分的分析[J]. 中醫(yī)中藥，2012，9（5）：181-183.

[ 9 ] 邢俊波，曹紅，胡丹，等. 毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定傷濕止痛膏中水楊酸甲酯的含量[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（1）：54-55.

[10] 莫火弟，容令新，何偉蓉，等. 氣相色譜法測(cè)定活絡(luò)膏中薄荷腦和水楊酸甲酯的含量[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，7（18）：15-17.

[11] 邢俊波，曹紅，陳玉敏，等. 毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定傷痛寧膏中薄荷腦和水楊酸甲酯的含量[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2010，17（2）：48-49.

[12] 康麗紅，江志華，黃庭亮，等. 氣相色譜法測(cè)定驅(qū)風(fēng)保濟(jì)油中水楊酸甲酯的含量[J]. 今日藥學(xué)，2011，21（12）：739-740.

[13] 傅應(yīng)華. 毛細(xì)管氣相色譜法同時(shí)測(cè)定少林風(fēng)濕跌打膏中薄荷腦、水楊酸甲酯和冰片的含量[J]. 藥物分析雜志，2011，15（6）：1111-1115.

[14] 李彥超，李宜鮮，宋漢敏，等. GC法同時(shí)測(cè)定安陽(yáng)精制膏中薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯的含量[J].中醫(yī)研究，2011，24（2）：25-27.

[15] 王海波，宋漢敏，李振國(guó)，等. 氣相色譜法同時(shí)測(cè)定關(guān)節(jié)止痛膏中樟腦、薄荷腦、水楊酸甲酯的含量[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，13（7）：77-80.

[16] 張潤(rùn)容，尚強(qiáng)，葉雪峰，等. 氣相色譜法測(cè)定風(fēng)痛靈貼膏中水楊酸甲酯的含量[J]. 醫(yī)藥衛(wèi)生，2015，22（11）：143-145.

[17] 文慶，聶平，張帆，等. 氣相色譜法同時(shí)檢測(cè)附桂風(fēng)濕膏中薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯的含量[J].中南藥學(xué)，2014，15（6）：585-588.

（收稿日期：2018-02-12 修回日期：2018-04-18）

（編輯：張 靜）