太子參抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的活性部位篩選及作用機(jī)制研究

楊馨 張金娟 宛蕾 鄧連力 廖尚高 何迅

摘 要 目的：篩選太子參抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷的活性部位，并探討其作用機(jī)制。方法：太子參藥材水提物經(jīng)D101大孔吸附樹脂柱以水-乙醇梯度洗脫，得水洗脫部位（Fr.A）、30%乙醇洗脫部位（Fr.B）、50%乙醇洗脫部位（Fr.C）、95%乙醇洗脫部位（Fr.D）。采用化學(xué)缺氧法以連二亞硫酸鈉復(fù)制大鼠H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷模型，采用MTS法檢測經(jīng)太子參各部位低、中、高劑量（Fr.A、Fr.B、Fr.C低、中、高劑量均分別為750、1 500、3 000 mg/L，F(xiàn)r.D低、中、高劑量分別為5、10、20 mg/L）預(yù)處理后的細(xì)胞存活率，篩選活性最強(qiáng)部位。分別采用微板法、硫代巴比妥酸比色法、WST-1法測定經(jīng)太子參活性最強(qiáng)部位低、中、高劑量預(yù)處理后細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活性以及細(xì)胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞胱天蛋白酶3（Caspase-3）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）的表達(dá)水平。結(jié)果：經(jīng)4個部位預(yù)處理后，F(xiàn)r.A高劑量組，F(xiàn)r.B高劑量組，F(xiàn)r.C各劑量組的細(xì)胞存活率均較模型組顯著升高（P<0.05或P<0.01），且以Fr.C的活性最強(qiáng)。經(jīng)Fr.C預(yù)處理后，各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性，中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)MDA含量、細(xì)胞凋亡率及Caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)量均較模型組顯著下降（P<0.05或P<0.01）；高劑量組細(xì)胞內(nèi)SOD活性以及中、高劑量組細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)量均較模型組顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：太子參Fr.A、Fr.B、Fr.C部位均具有抗心肌細(xì)胞H/R損傷的作用，其中以Fr.C的活性最強(qiáng)；Fr.C抗心肌細(xì)胞H/R損傷作用可能與其改善細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高細(xì)胞清除氧自由基的能力，降低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度，抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)以及下調(diào)Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 太子參；活性部位；大鼠H9c2心肌細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧損傷；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；胱天蛋白酶3；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2；Bcl-2相關(guān)X蛋白

中圖分類號 R965.1；R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）14-1958-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.20

ABSTRACT OBJECTIVE： To screen the active fractions of Pseudostellaria heterophylla against myocardial hypoxia/reoxygenation （H/R） injury， and to investigate its mechanism. METHODS： The water extract of P. heterophylla was eluted with D101 macroporous adsorption resin column by water-ethanol gradient elution to obtain water elution fraction （Fr.A）， 30% ethanol eluting fraction （Fr.B）， 50% ethanol eluting fraction （Fr.C） and 95% ethanol eluting fraction （Fr.D）. H/R injury model of rat H9c2 myocardial cells was induced by chemical anoxia method with natrium hydrosulfurosum. MTS assay was used to detect survival rate of cells after pretreated with low-dose， medium-dose and high-dose of each fraction （low-dose， medium-dose and high- dose of Fr.A， Fr.B， Fr.C were 750， 1 500， 3 000 mg/L；low-dose， medium-dose and high-dose of Fr.D were 5， 10， 20 mg/L）， and the strongest active fraction of P. heterophylla was screened. After pretreated with the strongest active fraction， the activity of LDH in cell culture medium， the content of MDA and the activity of SOD in the cells were determined by microplate method， TBA method and WST-1 method， respectively. The apoptotic rate of the cells was detected by flow cytometry. The expressions of Caspase-3， Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. RESULTS： After the pretreatment of 4 fractions， the survival rate of cells in Fr.A high-dose group， Fr.B high-dose group and all Fr.C groups were increased significantly， compared with model group （P<0.05 or P<0.01）. The activity of Fr.C was the strongest. After pretreated with different doses of Fr.C， the activity of LDH in the culture medium of all groups， the content of MAD， apoptotic rate， the protein expression of Caspase-3 and Bax in medium-dose and high-dose groups were all decreased significantly， compared with model group （P<0.05 or P<0.01）； the activity of SOD in high-dose group， the protein expression of Bcl-2 in medium-dose and high-dose groups were increased significantly， compared with model group （P<0.05）. CONCLUSIONS： The Fr.A， Fr.B and Fr.C of P. heterophylla have anti-H/R injury effects on cardiomyocytes， and the activity of Fr.C is the strongest. Anti-H/R injury of Fr.C may be related to its ability to improve oxidant stress state and scavenge oxygen free radicals， decrease the degree of lipid peroxidation， inhibit cell apoptosis， up-regulate the protein expression of Bcl-2 and down-regulate the protein expression of Caspase-3 and Bax.

KEYWORDS Pseudostellaria heterophylla； Active fraction； Rat H9c2 cardiomyocytes； Hypoxia/reoxygenation injury； Oxidant stress； Cell apoptosis； Caspase-3； Bcl-2； Bax

太子參是石竹科假繁縷屬植物孩兒參[Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax ex Pax et Hoffm.]的干燥塊根，可用于治療脾虛體倦、食欲不振、病后虛弱、氣陰不足、自汗口渴、肺燥干咳等癥，同時也是民間用于治療心悸的重要藥材[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，太子參具有明確的抗應(yīng)激、抗疲勞、降血糖、降血脂、增強(qiáng)免疫功能、抗心肌缺氧及改善急性心肌梗死后的慢性心力衰竭等作用[2-4]。本研究采用中藥傳統(tǒng)煎煮法對太子參藥材進(jìn)行提取，水提物經(jīng)D101大孔吸附樹脂柱以水-乙醇梯度洗脫，得到太子參不同極性部位；考察不同部位對連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（Hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷模型的影響，篩選出活性最強(qiáng)的部位，并對其抗心肌細(xì)胞H/R損傷的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，旨在為太子參的臨床應(yīng)用奠定現(xiàn)代藥理學(xué)研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

2001HY-6003型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Elx 800UV型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；Universal HoodⅡ型凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）；BS223S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；Allegra 64R型臺式高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；MiniSpin型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；NovoCyte 3008型流式細(xì)胞儀（美國ACEA Biosciences公司）；TS-1000型轉(zhuǎn)移脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；WD-905D型水平搖床（北京市六一儀器廠）；K30型干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

太子參藥材購于貴州省凱里市黃平縣太子參栽培種植基地（批號：TZS-20140520），經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院龍慶德副教授鑒定為石竹科假繁縷屬植物孩兒參[P. heterophylla （Miq.） Pax ex Pax et Hoffm.]的根。

D101大孔吸附樹脂（0.30～1.25 mm，天津市海光化工有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM無糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號分別為8117182、1868979、1859509）；胎牛血清（德國SeraPro公司，批號：P1701）；維生素E（純度：≥98%）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制劑（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為1012B036、20170227、20171018、20171011）；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號：0424A17）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20170319、20170312、20170105）；CellTiter 96? AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑盒（MTS）（美國Promega公司，批號：0000227663）；膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：20171017）；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）抗體（美國BioWorld公司，批號：CC893300）；Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體（美國Proteintech公司，批號：00054598）；胱天蛋白酶3（Caspase-3）抗體（美國Cell Signaling公司，批號：18）；兔β-肌動蛋白（β-actin）抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：AG07197903）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：133599）；免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）（上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，批號：20170906）；乙醇、Na2S2O4、二甲基亞砜（DMSO）等試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 細(xì)胞

大鼠H9c2心肌細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。

2 方法

2.1 樣品的制備

稱取太子參藥材30 kg，用水煎煮提取2次，第1次用10倍量水浸泡過夜后加熱煎煮提取2 h，第2次用8倍量水加熱煎煮提取2 h，合并兩次提取液，濾過，濾液加熱濃縮，得水提取浸膏（得率為47.50%）。將上述浸膏用水溶解（終質(zhì)量濃度為1.0 g/mL，以生藥量計），經(jīng)D101大孔吸附樹脂柱，依次以水、30%乙醇、50%乙醇、95%乙醇洗脫，收集各部分洗脫液，加熱濃縮至稠膏，得太子參水洗脫部位（Fr.A）、30%乙醇洗脫部位（Fr.B）、50%乙醇洗脫部位（Fr.C）和95%乙醇洗脫部位（Fr.D）等4個部位，分別于70 ℃下減壓濃縮、冷凍干燥，即得各部位樣品（得率分別為37.38%、3.62%、0.35%、0.02%）。精確稱取上述各部位樣品適量，用DMSO溶解，得質(zhì)量濃度均為500 mg/mL的樣品溶液，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷模型的建立

將H9c2心肌細(xì)胞接種于完全培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清）中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，常規(guī)傳代。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶消化，以轉(zhuǎn)速1 000 r/min離心3 min，收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞密度至4×104 mL-1，按100 μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、2 mL/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板或5 mL/瓶接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。吸棄上清液，用DMEM無糖培養(yǎng)基清洗2次，采用化學(xué)缺氧法[5]在培養(yǎng)板/瓶中加入以DMEM無糖培養(yǎng)基配制的終濃度為20 mmol/L的Na2S2O4溶液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中，刺激細(xì)胞15 min使發(fā)生缺氧損傷；然后吸棄缺氧液，換用完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)15 min，進(jìn)行復(fù)氧。

2.3 太子參抗H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷的活性部位篩選

取對數(shù)生長期的H9c2心肌細(xì)胞，以4×104 mL-1的密度按100 ?L/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組、模型組、維生素E組以及太子參Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D低、中、高劑量組（參照前期預(yù)試驗結(jié)果，F(xiàn)r.A、Fr.B、Fr.C的低、中、高劑量分別為750、1 500、3 000 mg/L，F(xiàn)r.D的低、中、高劑量分別為5、10、20 mg/L，均以各部位樣品質(zhì)量計，下同），每組設(shè)6個復(fù)孔，吸棄各孔上清液，正常對照組及模型組加入完全培養(yǎng)基100 μL，各給藥組加入含相應(yīng)劑量藥物的完全培養(yǎng)基100 μL，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h。除正常對照組外，其余各組均按“2.2”項下方法復(fù)制H/R損傷模型。復(fù)氧后，每孔加入MTS 20 μL，于培養(yǎng)箱中孵育3 h后，使用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長處的光密度（OD）值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=樣品組平均OD值/正常對照組平均OD值×100%[6]。以上試驗重復(fù)3次，比較太子參不同部位對H/R損傷模型細(xì)胞存活率的影響，篩選出活性最強(qiáng)部位。

2.4 太子參活性最強(qiáng)部位對H/R損傷模型細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性及細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD活性的影響

取對數(shù)生長期的H9c2心肌細(xì)胞，以4×104 mL-1的密度按2 mL/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組、模型組、維生素E組和太子參活性最強(qiáng)部位低、中、高劑量組，每組設(shè)3個復(fù)孔。正常對照組及模型組加入完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)劑量藥物的完全培養(yǎng)基2 mL，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h。除正常對照組外，其余各組均按“2.2”項下方法復(fù)制H/R損傷模型。復(fù)氧后，各孔吸取上清液采用微板法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性；各孔吸棄上清液后，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）清洗2次，加入RIPA細(xì)胞裂解液100 μL，收集裂解后的細(xì)胞，采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法檢測細(xì)胞內(nèi)MDA含量，采用WST-1法檢測細(xì)胞內(nèi)SOD活性。各指標(biāo)均使用酶標(biāo)儀檢測，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。以上試驗重復(fù)3次。

2.5 太子參活性最強(qiáng)部位對H/R損傷模型細(xì)胞凋亡率的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測太子參活性最強(qiáng)部位對H/R損傷模型細(xì)胞凋亡率的影響。取對數(shù)生長期的H9c2心肌細(xì)胞，以4×104 mL-1的密度按2 mL/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組、模型組和太子參活性最強(qiáng)部位低、中、高劑量組，每組設(shè)3個復(fù)孔。正常對照組及模型組加入完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)劑量藥物的完全培養(yǎng)基2 mL，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h。除正常對照組外，其余各組均按“2.2”項下方法復(fù)制H/R損傷模型。復(fù)氧后，用PBS清洗2次，消化、離心收集細(xì)胞，按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行Annexin Ⅴ-FITC/PI染色，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。以上試驗重復(fù)3次。

2.6 太子參活性最強(qiáng)部位對H/R損傷模型細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響

采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測太子參活性最強(qiáng)部位對H/R損傷模型細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白（Caspase-3、Bcl-2、Bax）表達(dá)的影響。取對數(shù)生長期的H9c2心肌細(xì)胞，以4×104 mL-1的密度按5 mL/瓶接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按照“2.5”項下方法分組。正常對照組及模型組加入完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)劑量藥物的完全培養(yǎng)基2 mL，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h。除正常對照組外，其余各組均按“2.2”項下方法復(fù)制H/R損傷模型。復(fù)氧后，用預(yù)冷的PBS清洗2次，加入含1% PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液100 μL，冰浴30 min，將細(xì)胞刮下，收集裂解后的細(xì)胞液，于4 ℃下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min，取上清液采用二喹啉甲酸法（BCA）測定蛋白濃度[7]。經(jīng)蛋白上樣緩沖液稀釋后，用100 ℃沸水將蛋白變性后置于-80 ℃保存，備用。每組取蛋白20 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，以5%胎牛血清蛋白室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗[Caspase-3（1 ∶ 1 000）、Bcl-2（1 ∶ 1 000）、Bax（1 ∶ 5 000）、β-actin（1 ∶ 5 000）]，在室溫下振搖2 h后，于4 ℃孵育過夜，用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液（TBST）洗膜3次，每次5 min，加入二抗[HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1 ∶ 5 000）]，室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL顯色后，置于凝膠成像分析儀上成像并用Image Lab 3.0軟件分析。以相應(yīng)蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示該蛋白的相對表達(dá)量。以上試驗重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）或Dunnetts t檢驗，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 太子參抗H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷的活性部位篩選結(jié)果

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，維生素E組，F(xiàn)r.A高劑量組，F(xiàn)r.B高劑量組，F(xiàn)r.C各劑量組的細(xì)胞存活率均顯著升高，且Fr.C的抗細(xì)胞損傷作用呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；而Fr.A低、中劑量組，F(xiàn)r.B低、中劑量組，F(xiàn)r.D各劑量組的細(xì)胞存活率與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這提示Fr.C是太子參抗H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷的活性最強(qiáng)部位，詳見表1。

3.2 Fr.C對H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后LDH、MDA、SOD水平的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性和細(xì)胞內(nèi)MDA含量均顯著升高，而細(xì)胞內(nèi)SOD活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示細(xì)胞明顯受損。與模型組比較，維生素E組和Fr.C各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性均顯著降低，且呈一定的劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；Fr.C中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)MDA含量均顯著降低，F(xiàn)r.C高劑量組細(xì)胞內(nèi)SOD活性顯著上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這提示Fr.C能減輕H/R損傷后H9c2心肌細(xì)胞的受損程度，對其具有一定的保護(hù)作用，詳見表2。

3.3 Fr.C對H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后細(xì)胞凋亡的影響

與正常對照組比較，模型組的細(xì)胞凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，F(xiàn)r.C中、高劑量組的細(xì)胞凋亡率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；而Fr.C低劑量組的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），詳見圖1、表3。

3.4 Fr.C對H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞H/R損傷后Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量均顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，F(xiàn)r.C中、高劑量組細(xì)胞Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量均顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而Fr.C低劑量組細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量雖有變化，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這表明Fr.C中、高劑量能下調(diào)Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)，并上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，詳見圖2、表3。

4 討論

缺血性心臟病（Ischemic heart disease，IHD）是一類嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)疾病，是目前導(dǎo)致患者死亡和心功能衰竭的主要原因[8]。針對IHD所采取的主要治療方法再灌注療法（如藥物療法、冠狀動脈搭橋術(shù)、經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)等）可能會加重患者心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的損壞程度，從而導(dǎo)致心肌缺血/再灌注損傷（Myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）[9]。由于MIRI存在著復(fù)雜的致病因素，故目前尚無療效可靠的防治藥物[10]。因此，開發(fā)更加安全、有效的抗MIRI藥物對防治心肌缺血性疾病具有重要的臨床價值。

心肌缺血性損傷主要是供給心肌的氧減少，氧自由基清除系統(tǒng)功能減弱，生成系統(tǒng)活性卻增強(qiáng)；而心肌再灌注損傷主要是當(dāng)恢復(fù)氧氣供應(yīng)時，氧自由基急劇生成并大量堆積，從而造成心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝障礙，故MIRI的病因可主要?dú)w結(jié)為心肌細(xì)胞的H/R損傷[11-12]。為此，本研究采用化學(xué)缺氧法以終濃度為20 mmol/L的Na2S2O4溶液誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，復(fù)制H/R（即缺血/再灌注）損傷模型，從分子水平上初步探討了太子參不同極性部位對H/R損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

已有研究表明，維生素E是一種高效的自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化作用阻斷劑，能夠有效地保護(hù)心血管系統(tǒng)，降低心血管疾病的發(fā)病率[13]，對MIRI具有一定的療效[14]，并具有明顯的抗細(xì)胞凋亡能力[15]，故本研究以維生素E作為陽性對照藥物。同時，本研究參照前期預(yù)試驗安全濃度范圍設(shè)定了太子參不同部位的低、中、高劑量。本研究結(jié)果表明，太子參4個部位分別作用于H/R損傷模型24 h后，F(xiàn)r.A、Fr.B、Fr.C均可不同程度地提高心肌細(xì)胞的存活率，其中Fr.C的作用最為顯著。這提示Fr.A、Fr.B、Fr.C對Na2S2O4誘導(dǎo)H/R損傷的H9c2心肌細(xì)胞均具有一定的保護(hù)作用，且Fr.C的保護(hù)作用最強(qiáng)，可能與該部位富含苷類成分有關(guān)[3]。隨后，本研究以活性最強(qiáng)的Fr.C為對象，初步探討了太子參抗H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷的作用機(jī)制。

目前，MIRI的機(jī)制研究包括氧自由基、炎癥反應(yīng)、鈣超載、能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞凋亡等。細(xì)胞內(nèi)自由基的大量產(chǎn)生以及氧自由基清除能力的下降是引發(fā)MIRI的主要原因，因此在治療MIRI時，應(yīng)提高機(jī)體抗氧化物酶的活性，增加清除氧自由基的能力，以減輕氧自由基對心肌細(xì)胞的損傷[16-17]。LDH是一種糖酵解酶，在正常生理條件下，很少從細(xì)胞質(zhì)中釋放；而當(dāng)細(xì)胞受到損傷時，LDH便會從細(xì)胞質(zhì)中釋放出來，其滲出量的多少可間接反映細(xì)胞膜的損傷程度[18]。MDA是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的過氧化產(chǎn)物，其能與蛋白質(zhì)、氨基酸或者其他生物大分子相互作用，最終改變磷脂結(jié)構(gòu)，使生物膜受到嚴(yán)重?fù)p害，其含量可間接反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的程度[19]。通常情況下，內(nèi)源性抗氧化物酶（SOD等）是防止氧化應(yīng)激產(chǎn)生損傷的第一道防線，這類酶通過清除過量的氧自由基使機(jī)體處于平衡狀態(tài)，其活性的高低可反映機(jī)體清除氧自由基的能力，并間接反映機(jī)體對氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)程度[20]。本研究結(jié)果顯示，在太子參Fr.C預(yù)作用于心肌細(xì)胞H/R損傷模型24 h后，其低、中、高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性以及中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)MDA含量均顯著降低，高劑量組細(xì)胞內(nèi)SOD活性顯著上升，提示Fr.C能有效抑制H/R損傷細(xì)胞釋放LDH，并降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量、提高細(xì)胞內(nèi)SOD活性。這表明Fr.C能提高細(xì)胞清除氧自由基的能力，減輕細(xì)胞膜等受自由基攻擊后的損傷，降低H/R損傷致心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的程度，從而有效保護(hù)心肌細(xì)胞，這種保護(hù)作用可能與該部位能夠有效抑制心肌細(xì)胞受損過程中的脂質(zhì)過氧化有關(guān)[19]。

細(xì)胞凋亡發(fā)生在許多疾病的生理與病理過程中，隨著心血管病學(xué)研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)MIRI致心肌細(xì)胞死亡有兩種機(jī)制，即壞死和凋亡，而后者是引發(fā)心血管系統(tǒng)疾病的重要原因[21]。心肌再灌注雖然恢復(fù)了血流，但同時也可能加速受損心肌細(xì)胞的凋亡過程，故細(xì)胞凋亡在MIRI的病理過程中發(fā)揮著重要作用[22]。細(xì)胞凋亡的發(fā)生受細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控，其分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩大類，細(xì)胞凋亡的發(fā)生是這兩者平衡失調(diào)的結(jié)果。Bcl-2家族成員的構(gòu)成比例是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵因素，Bcl-2有抗凋亡作用，而Bax有促凋亡作用，Bcl-2/Bax是啟動細(xì)胞凋亡的“凋亡開關(guān)”，Bcl-2可與過表達(dá)的Bax形成異二聚體，抑制細(xì)胞凋亡，在抗細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者及啟動者是Caspase，其中Caspase-3不僅是Caspase家族的關(guān)鍵凋亡蛋白酶，同時也是細(xì)胞凋亡的核心標(biāo)志物之一[24]。在外界刺激或Caspase-3等因子活化時，Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入線粒體或細(xì)胞核內(nèi)，導(dǎo)致促凋亡因子與抗凋亡因子失衡，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。本研究結(jié)果顯示，太子參Fr.C預(yù)作用于心肌細(xì)胞H/R損傷模型24 h后，其中、高劑量組細(xì)胞凋亡率較模型組顯著下降，且Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量顯著下降，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著上升，提示其可有效抑制細(xì)胞凋亡，防止心肌細(xì)胞數(shù)目減少，維持或改善心功能。這表明Fr.C對H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)可能與其抗凋亡作用有關(guān)。

綜上所述，太子參Fr.A、Fr.B、Fr.C均具有一定的抗心肌細(xì)胞H/R損傷的作用，其中以Fr.C的活性最強(qiáng)。上述作用可能與其可改善細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高細(xì)胞清除氧自由基的能力，降低心肌細(xì)胞受損過程中的脂質(zhì)過氧化程度，抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)及下調(diào)Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究可為了解太子參在心肌細(xì)胞H/R損傷過程中的保護(hù)作用及其機(jī)制提供參考。

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（收稿日期：2018-01-13 修回日期：2018-05-13）

（編輯：張元媛）