HPLC—一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定大青葉中6種抗腫瘤活性成分的含量

羅文艷 段和祥 劉緒平 陳希 章瑛 李志勇

中圖分類(lèi)號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）19-2635-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.10

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定大青葉中6種抗腫瘤活性成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Waters XTERRA? MS C18，流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL。以木犀草苷為內(nèi)標(biāo)，分別計(jì)算其與尿苷、腺苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素的相對(duì)校正因子（RCF），通過(guò)RCF計(jì)算大青葉中上述5種抗腫瘤活性成分的含量，同時(shí)采用外標(biāo)法測(cè)定這6種成分的含量，比較一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法的含量測(cè)定結(jié)果。結(jié)果：尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素進(jìn)樣量檢測(cè)線(xiàn)性范圍分別為0.122 6～4.902、0.063 4～2.534、0.032 7～1.309、0.038 2～1.527、0.032 3～1.291、0.052 5～2.098 ?g（r≥0.999 1）；檢測(cè)限分別為3.06、1.58、0.82、0.96、0.81、1.31 μg/mL，定量限分別為10.21、5.28、2.73、3.18、2.69、4.37 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<2%（n=6）；加樣回收率為96.45%～99.14%（ RSD為0.8%～1.6%，n=6）。尿苷、腺苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素的RCF分別為0.197、0.413、0.732、0.825、0.587。在不同試驗(yàn)條件下，RCF重現(xiàn)性良好。采用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法的含量測(cè)定結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單快捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于大青葉中尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素和芹菜素6種抗腫瘤活性成分含量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；一測(cè)多評(píng)法；大青葉；木犀草苷；抗腫瘤活性成分；相對(duì)校正因子

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of 6 antitumor active constituents in Folium isatidis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Waters XTERRA? MS C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.1% formic acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 35 ℃， and detection wavelength was 254 nm. The injection volume was 10 μL. Using luteolin as internal standard， relative correction factors （RCF） of uridine， adenosine， hyperin， 7-methoxycoumarin and apigenin were calculated respectively. The contents of above 5 antitumor active components in F. isatidis were calculated by RCF. The contents of 6 components were determined by external standard method （ESM）. The results of content determination by QAMS were compared with ESM. RESULTS： The linear range was 0.122 6-4.90 2 ?g for uridine， 0.063 4-2.534 ?g for adenosine， 0.032 7-1.309 ?g for luteolin， 0.038 2-1.527 ?g for hyperin， 0.032 3-1.291 ?g for 7-methoxycoumarin， 0.052 5-2.098 ?g for apigenin（r≥0.999 1）. The limits of detection were 3.06， 1.58， 0.82， 0.96， 0.81， 1.31 μg/mL， respectively. The limits of quantification were 10.21， 5.28， 2.73， 3.18， 2.69， 4.37 μg/mL. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were less than 2% （n=6）. The average recoveries were 96.45%-99.14% （RSDs were 0.8%-1.6%， n=6）. RCFs of uridine， adenosine， hyperin， 7-methoxycoumarin and apigenin were 0.197， 0.413， 0.732， 0.825 and 0.587， respectively. RCFs repeatability was perfect under different experiment conditions. There was no significant difference between the quantitative results of the QAMS and ESM （P>0.05）. CONCLUSIONS： QAMS method is simple， fast， accurate and feasible， and can be used for simultaneous determination of uridine， adenosine， luteolin， hyperin， 7-methoxycoumarin and apigenin in F. isatidis.

KEYWORDS HPLC； QAMS； Folium isatidis； Luteolin； Antitumor active constituent； Relative correction factor

大青葉（Folium isatidis）為十字花科植物菘藍(lán)（Isatis indigotica Fort.）的干燥葉，具有清熱解毒、涼血消斑之功效，用于溫病高熱、神昏、發(fā)斑發(fā)疹、作腮、喉痹、丹毒、癰腫等的治療[1]。大青葉的化學(xué)成分主要有生物堿類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、苷類(lèi)、甾體類(lèi)、氨基酸和無(wú)機(jī)元素等[2-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，大青葉具有抗炎、抗病毒、解熱、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗內(nèi)毒素等作用[5-8]。大青葉中含有尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素等抗腫瘤成分。本研究建立了高效液相色譜（HPLC）-一測(cè)多評(píng)（QAMS）法同時(shí)測(cè)定大青葉中6種抗腫瘤活性成分的含量，以木犀草苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算尿苷、腺苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素與其之間的相對(duì)校正因子（RCF），利用RCF測(cè)定各成分含量，并將結(jié)果與外標(biāo)法（ESM）測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，旨在為大青葉藥材質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供一種新的技術(shù)手段和依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260 Infinity ⅡHPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；Alliance e2695 HPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；色譜柱：Waters XTERRA? MS C18、Inerstsil ODS-3、ZORBAX Eclipse XDB-C18（均為250 mm×4.6 mm，5 μm）；MS205DU電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；DS-8510DT超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

3批大青葉藥材購(gòu)于樟樹(shù)康健中藥材有限公司，經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院中藥室萬(wàn)林春副主任中藥師鑒定為十字花科植物菘藍(lán)（I. indigotica Fort.）的干燥葉。大青葉藥材來(lái)源詳見(jiàn)表1。

尿苷（批號(hào)：110887-200202，純度：100%）、腺苷（批號(hào)：110879-201703，純度：99.7%）、木犀草苷（批號(hào)：111720-201609，純度：94.9%）、金絲桃苷（批號(hào)：111521- 201708，純度：95.1%）、7-甲氧基香豆素（批號(hào)：111513- 200001，純度：100%）、芹菜素（批號(hào)：111901-201603，純度：99.2%）對(duì)照品均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XTERRA? MS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～75 min，10%→64%A；75～80 min，64%→90%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用70%甲醇溶液溶解并定量稀釋制成每1 mL中分別含上述對(duì)照品122.6、63.4、32.7、38.2、32.3、52.5 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 稱(chēng)取大青葉藥材10 g，剪碎，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液100 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）提取45 min，取出，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白溶液 取70%甲醇溶液作為空白溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果，在該色譜條件下，各待測(cè)成分色譜峰都可以達(dá)到基線(xiàn)分離，各對(duì)照品色譜峰與相鄰峰之間分離度均>1.5，理論板數(shù)按木犀草苷峰計(jì)>3 000，詳見(jiàn)圖1。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、20、40 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以待測(cè)成分進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 檢測(cè)限與定量限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，根據(jù)色譜峰響應(yīng)情況逐步稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各色譜峰。以信噪比為3 ∶ 1作為檢測(cè)限，以信噪比為 10 ∶ 1作為定量限。結(jié)果，尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素的檢測(cè)限分別為3.06、1.58、0.82、0.96、0.81、1.31 μg/mL，定量限分別為10.21、5.28、2.73、3.18、2.69、4.37 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素峰面積的RSD分別為1.24%、1.08%、0.32%、1.55%、0.89%、1.68%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：170001）10 μL，分別于室溫下放置0、4、8、12、18、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素峰面積的RSD分別為0.27%、1.12%、1.47%、1.77%、1.65%、0.78%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取大青葉藥材（批號(hào)：170001）各約10 g，剪碎，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素和芹菜素含量的RSD分別為1.6%、1.1%、1.4%、0.8%、1.9%、1.2%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收試驗(yàn)

取大青葉藥材（批號(hào)：170001）約10 g，共6份，剪碎，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入一定量的各待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，各成分平均回收率為96.45%～99.14%。

2.10 QAMS法

2.10.1 RCF的計(jì)算 以木犀草苷為內(nèi)標(biāo)物，采用斜率校正法[9]，RCF計(jì)算公式為fk/s=ak/as[10-11]（a為回歸方程的斜率，s為內(nèi)標(biāo)物，k為其他待測(cè)組分），分別計(jì)算尿苷、腺苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素和芹菜素與內(nèi)標(biāo)物木犀草苷的RCF。結(jié)果，尿苷、腺苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素的RCF分別為0.197、0.413、0.732、0.825、0.587。

2.10.2 RCF重現(xiàn)性考察 取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液和“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定分析，考察2個(gè)不同廠(chǎng)家的HPLC儀和3個(gè)不同品牌的色譜柱對(duì)RCF的影響，結(jié)果RSD均小于2.4%（n=6），表明在不同試驗(yàn)環(huán)境下，該方法均具有較好的重現(xiàn)性。不同色譜儀和不同色譜柱條件下測(cè)得的fk/s結(jié)果見(jiàn)表4。

2.10.3 待測(cè)組分色譜峰的定位 在無(wú)對(duì)照品的條件下，準(zhǔn)確定位每個(gè)色譜峰是QAMS法成功應(yīng)用的關(guān)鍵，文獻(xiàn)[12]大都采用相對(duì)保留時(shí)間（rI/S）進(jìn)行峰定位， rI/S=tR（I）/tR（S）[13-14]（tR為保留時(shí)間，I為待測(cè)成分，S為內(nèi)標(biāo)物）。本試驗(yàn)以木犀草苷為內(nèi)標(biāo)物，采用相對(duì)保留時(shí)間結(jié)合化合物的紫外光譜特征來(lái)定位，計(jì)算2個(gè)不同廠(chǎng)家的HPLC儀和3個(gè)不同品牌的色譜柱的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果RSD<2.7%（n=6），表明該方法重現(xiàn)性好。不同色譜條件下的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果見(jiàn)表5。

2.10.4 QAMS法與ESM法測(cè)定結(jié)果比較 取3批大青葉藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備樣品，分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定，采用QAMS法與ESM法計(jì)算各成分含量，結(jié)果相對(duì)偏差（d）均<2.0%；同時(shí)，通過(guò)t檢驗(yàn)對(duì)兩種方法所測(cè)含量結(jié)果進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。QAMS法與ESM法測(cè)定6種成分的含量結(jié)果見(jiàn)表6。

3 討論

3.1 質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇

大青葉在抗菌、抗炎、抗病毒方面報(bào)道較多，在抗腫瘤方面關(guān)注較少，本試驗(yàn)重點(diǎn)研究其抗腫瘤作用的活性成分。尿苷是合成很多抗腫瘤核苷類(lèi)成分的前體[15]；腺苷在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡中起著關(guān)鍵作用[15-16]；木犀草苷對(duì)食管鱗狀癌 Eca109 細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著抑制作用[17]；金絲桃苷能通過(guò)阻斷細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抗胃癌[18]；香豆素抗腫瘤活性具有高效低毒的特點(diǎn)，在香豆素7位連接適當(dāng)長(zhǎng)度的基團(tuán)能顯著增強(qiáng)抗腫瘤活性[19]；芹菜素對(duì)肺癌細(xì)胞的抗增殖作用和抗腫瘤藥物的增敏作用良好[20]。大青葉藥材中含有以上6種成分，且都對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，因此選取上述6種成分作為大青葉質(zhì)量控制的指標(biāo)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

筆者也曾比較了甲醇-水、乙腈-水兩種流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)甲醇-水作為流動(dòng)相洗脫效果明顯優(yōu)于乙腈-水。在甲醇-水的基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察了含0.1%甲酸的甲醇、0.1%醋酸的甲醇、0.1%醋酸銨的甲醇、0.1%磷酸的甲醇，發(fā)現(xiàn)含0.1%甲酸的甲醇作為流動(dòng)相洗脫效果最佳，各峰分離度均>1.5，故本試驗(yàn)最終選取甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

3.3 檢測(cè)器的選擇

筆者在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)6種成分進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)各成分均有紫外吸收。但由于各成分的最大吸收波長(zhǎng)不同，為便于在試驗(yàn)過(guò)程中觀(guān)察各成分峰在不同波長(zhǎng)處的響應(yīng)值及分離度情況，本試驗(yàn)最終選擇二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行試驗(yàn)。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)混合對(duì)照品溶液中的待測(cè)成分進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，獲得尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素的最大吸收波長(zhǎng)分別為261、258、254、255、323、337 nm，6種成分中有4種成分的最大吸收波長(zhǎng)集中在254 nm附近，2種成分的最大吸收波長(zhǎng)在330 nm附近。若檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為330 nm，則對(duì)腺苷、尿苷和金絲桃苷色譜峰響應(yīng)值的影響較大；若檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為254 nm，則對(duì)7-甲氧基香豆素和芹菜素色譜峰響應(yīng)值的影響較小。以木犀草苷的最大吸收波長(zhǎng)254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，能兼顧各成分色譜峰的峰高與分離度，故本試驗(yàn)最終選取木犀草苷的最大吸收波長(zhǎng)254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.5 內(nèi)標(biāo)的選擇

筆者采用ESM法計(jì)算6種成分的含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，木犀草苷的含量較其他5種成分高，可獲得性強(qiáng)，以木犀草苷為內(nèi)標(biāo)，建立其與尿苷、腺苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素和芹菜素的RCF。在不同色譜儀和不同色譜柱中RSD均小于2.4%，相對(duì)保留時(shí)間RSD小于2.5%。采用QAMS法與ESM法同時(shí)檢測(cè)3批大青葉藥材中6種活性成分的含量，相對(duì)偏差小于2.0%。故本試驗(yàn)選擇木犀草苷作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行QAMS分析。

綜上所述，本文建立的含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單快捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于大青葉中尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素和芹菜素6種抗腫瘤活性成分含量的同時(shí)測(cè)定。

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（收稿日期：2018-06-28 修回日期：2018-08-21）

（編輯：余慶華）