人工蟬花子實體對慶大霉素所致小鼠急性腎衰竭的影響及機制研究

邵佳蔚 于瑞蓮 喻振 邱蓉麗 許金國 呂高虹

中圖分類號 R932；R965；R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）19-2648-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.13

摘 要 目的：研究人工蟬花子實體對慶大霉素所致小鼠急性腎衰竭的影響，并初步探討其可能的作用機制。方法：將48只小鼠隨機分為空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、維拉帕米組（陽性對照，21.43 mg/kg）和人工蟬花子實體高、中、低劑量組（5、2.5、1.25 g/kg），每組8只。除空白組外，其余各組小鼠均腹腔注射慶大霉素200 mg/kg制備急性腎衰竭模型。各組小鼠于每次注射慶大霉素2 h后灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥4 h后，測定各組小鼠血清中尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）和總蛋白含量，計算腎指數(shù)，測定腎組織中丙二醛（MDA）、超氧化岐化酶（SOD）含量及Na+-K+-ATP酶活性，肉眼及蘇木精-伊紅（HE）染色后顯微鏡下觀察各組小鼠腎組織病理變化。結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠血清中BUN、Scr和腎組織中MDA含量以及腎指數(shù)均顯著升高（P<0.01），血清中總蛋白含量以及腎組織中SOD含量和Na+-K+-ATP酶活性均顯著降低（P<0.01）；肉眼觀察腎組織出現(xiàn)腫大、充血等病理變化，顯微鏡下可見腎組織發(fā)生腎小管上皮細胞重度顆粒、空泡樣變性以及上皮細胞大量脫落等病理損傷。與模型組比較，各給藥組小鼠血清中BUN、Scr和腎組織中MDA含量以及腎指數(shù)均顯著降低（P<0.01），人工蟬花子實體高、中劑量組小鼠腎組織中SOD含量以及各給藥組小鼠血清中總蛋白含量和腎組織中Na+-K+-ATP酶活性均顯著升高（P<0.01）；各給藥組小鼠腎組織的病理損傷也不同程度好轉(zhuǎn)，其中尤以人工蟬花子實體高、中劑量組改善最為明顯。結(jié)論：人工蟬花子實體對慶大霉素所致小鼠急性腎衰竭具有顯著的保護作用，其作用機制可能與減輕腎損傷及抗氧化作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞 人工蟬花；子實體；急性腎衰竭模型；抗氧化作用；腎損傷；小鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of artificial Isaria cicadae cystocarp on gentamicin-induced acute renal failure in mice， and to investigate potential mechanism preliminarily. METHODS： Totally 48 mice were randomly divided into blank group （normal saline）， model group （normal saline）， verapamil group （positive control， 21.43 mg/kg）， artificial I. cicadae cystocarp high-dose， moderate-dose and low-dose groups （5， 2.5， 1.25 g/kg）， with 8 mice in each group. Except for blank group， other groups were given gentamicin 200 mg/kg intraperitoneally to induce acute renal failure model； 2 h after intraperitoneal injection of gentamicin， each group was given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 7 d. 4 h after last administration， the contents of BUN， Scr and total protein in serum were determined， and renal indexes were calculated. The contents of MDA， SOD and activity of Na+-K+-ATP enzyme in renal tissue were determined； the changes of renal histopathological were observed by naked eye or microscope after HE staining. RESULTS： Compared with blank group， the serum contents of BUN and Scr， the content of MDA in renal tissue and renal indexes were increased significantly in model group （P<0.01）； the serum content of total protein， the content of SOD and activity of Na+-K+-ATP enzyme in renal tissue were decreased significantly （P<0.01）. The pathological changes of renal tissue were observed by naked eye， such as swelling， congestion. Pathological injury of renal tissue was founded under microscope， such as severe granularity and vacuolar changes in renal tubular epithelial cells， epithelial cell exfoliation. Compared with model group， serum contents of BUN and Scr， content of MDA and renal indexes of renal tissue were decreased significantly in each administration group （P<0.01）； SOD content of renal tissue in artificial I. cicadae cystocarp high-dose and medium-dose groups， activity of Na+-K+-ATP enzyme in renal tissue in each administration group were increased significantly （P<0.01）. The pathological injury of renal tissue in different administration groups were also improved to varying degrees， especially artificial I. cicadae cystocarp high-dose and medium-dose groups. CONCLUSIONS： The artificial I. cicadae cystocarp has a significant protective effect on the gentamicin-induced acute renal failure in mice， the mechanism of which may be related to the alleviation of renal damage and antioxidant function.

KEYWORDS Artificial Isaria cicadae； Cystocarp； Acute renal failure model； Antioxidant function； Renal injury； Mice

腎臟疾病是一類嚴重危害人類健康的疾病，嚴重時可能出現(xiàn)腎功能衰竭，直接威脅生命。近年來，腎臟疾病的發(fā)病率呈上升且年輕化趨勢[1-2]。中藥蟬花（Isaria cicadae Mique）是麥角菌科真菌——蟬擬青霉寄生竹蟬若蟲后的復(fù)合體，主產(chǎn)于江蘇、浙江一帶[3-4]。我國《本草綱目》《本草圖經(jīng)》《證類本草》等中藥典籍中記載的蟲草均有兩個：一個是冬蟲夏草，另一個就是蟬花。蟬花有多種藥理作用，尤其對腎臟有特殊保護作用，可降低血肌酐和尿肌酐含量、提高內(nèi)源性肌酐清除率、減輕腎小球損傷、改善腎功能、延緩腎小球硬化進程等[5]。但天然野生蟬花因無孢子囊殼包被，在野外生成孢子后，直接隨風飛散，且干燥后，其頂部孢子梗極易折斷，殘留的孢子粉飛散不易采摘，大大影響了其藥效和品質(zhì)，限制了野生蟬花的大量使用，因此蟬花的人工培養(yǎng)成為了研究的熱點。

目前，蟬花的人工培養(yǎng)主要分為兩種方式：液體深層發(fā)酵獲得的菌絲體和生物固體發(fā)酵培養(yǎng)的蟬花子實體[6]。其中，蟬花子實體是蟬花的藥用部位，最能體現(xiàn)其藥用價值。菌絲體和子實體在營養(yǎng)和藥效成分上存在未知差異，無具體的研究數(shù)據(jù)支持菌絲體能代替子實體應(yīng)用[6]。因此，蟬花子實體的培養(yǎng)仍然是人工栽培蟬花的研究重點。本課題組前期采用江蘇句容磨盤山的野生蟬花進行人工分離與培育，利用生物固體發(fā)酵技術(shù)，采用密閉無菌透氣袋（盒）進行人工栽培，獲得了與野生蟬花外形基本類似的人工栽培蟬花子實體（見圖1），并測得其腺苷含量為1.9 mg/100 g，已接近特級蟬花的標準。此法因在一個相對封閉的環(huán)境中培養(yǎng)，產(chǎn)生的孢子粉全部落入容器中，易于收集且收率高，有效解決了野生藥材蟬花孢子粉不易收集的問題。本研究先通過腹腔注射慶大霉素制備經(jīng)典的急性腎衰小鼠模型，再采用本課題組栽培的人工蟬花子實體灌胃給藥后，研究其對慶大霉素引起的小鼠急性腎衰的影響，并初步探討其作用機制，為其進一步開發(fā)及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

TD50002A型電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）；752型紫外-可見分光光度計（上海達平儀器有限公司）；SpectraMax190型全波長酶標儀（美國MD公司）；BH-2型光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

人工蟬花子實體由本實驗室人工栽培獲得，于2018年1月8日采摘，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院于瑞蓮副教授鑒定為麥角菌科蟬花；硫酸慶大霉素注射液（宜昌人福藥業(yè)有限公司，批號：160714，規(guī)格：2 mL ∶ 8萬單位）；鹽酸維拉帕米片 （華北制藥股份有限公司，批號：170311，規(guī)格：每片40 mg）；尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、總蛋白、丙二醛（MDA）、超氧化岐化酶（SOD）、Na+-K+-ATP酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為：C013-2、C011-2、A045-4、A003-1、A001-3、A016-2）；其他試劑均為分析純。

1.3 動物

清潔級ICR小鼠48只，♂，體質(zhì)量（20±2） g，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，實驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（蘇）2017-0001。小鼠購入后，飼養(yǎng)于恒溫（22 ℃）、相對濕度為50%的動物房中，飼養(yǎng)期間自由飲食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

2 方法

2.1 人工蟬花子實體的制備

采用野生蟬花的新鮮子實體，通過組織分離法，經(jīng)數(shù)次分離后獲得蟬花純菌種[該菌種經(jīng)北京中科院微生物所菌種鑒定中心鑒定，確認其為蟬棒束孢Isaria cicadae（曾用名Cordyceps cicadae） ]。將分離得到的蟬花菌種接種入液體培養(yǎng)基中，得到液體種子液。再將種子液接種入人工栽培試驗培養(yǎng)基中，放置于恒溫房（24 ℃）內(nèi)，于密閉無菌透氣盒中進行生物固體發(fā)酵，收集子實體，60 ℃烘干，備用。將干燥的人工蟬花子實體粉碎，臨用前加生理鹽水制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的藥液。

2.2 分組、造模與給藥

將48只小鼠隨機分為6組，每組8只，分別為空白組、模型組、維拉帕米組（陽性對照）和人工蟬花子實體高、中、低劑量組。除空白組外，其余5組小鼠均每日腹腔注射慶大霉素200 mg/kg建立急性腎衰竭模型[7]；空白組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。并于每次注射慶大霉素（或生理鹽水）2 h后，維拉帕米組小鼠灌胃維拉帕米（以生理鹽水為溶劑）21.43 mg/kg[8]，人工蟬花子實體高、中、低劑量組小鼠分別灌胃人工蟬花子實體（以生理鹽水為溶劑）5、2.5、1.25 g/kg[9]，空白組和模型組小鼠灌胃生理鹽水，灌胃體積均為0.2 mL/10 g。每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

2.3 血清中BUN、Scr和總蛋白含量測定

末次給藥4 h后，小鼠摘眼球取血，將血液樣本靜置約2 h，然后以3 000 r/min離心10 min，分離血清。按照相應(yīng)試劑盒說明書操作，測定血清中BUN、Scr和總蛋白含量。

2.4 腎指數(shù)計算

取血后處死小鼠，取腎組織，用濾紙吸干腎組織表面血液，稱質(zhì)量，記錄兩側(cè)腎的質(zhì)量，計算腎指數(shù)：腎指數(shù)=兩側(cè)腎質(zhì)量總和（g）/體質(zhì)量（g）。

2.5 腎組織病理學觀察

取左腎，肉眼觀察其大體變化，然后用10%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片（5 μm）。蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光學顯微鏡下進行腎組織病理學觀察。

2.6 腎組織中MDA、SOD含量和Na+-K+-ATP酶活性測定

取右腎，制成10%的組織勻漿，采用硫代巴比妥酸法測定腎組織中MDA含量，采用羥胺法測定腎組織中SOD含量，采用比色法測定腎組織中Na+-K+-ATP酶活性，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠血清中BUN、Scr和總蛋白含量的測定結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠血清中BUN、Scr含量顯著升高（P<0.01），總蛋白含量顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中BUN、Scr含量均顯著降低（P<0.01），總蛋白含量均顯著升高（P<0.01）。各組小鼠血清中BUN、Scr和總蛋白含量測定結(jié)果見表1。

3.2 各組小鼠腎指數(shù)測定結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠腎指數(shù)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠腎指數(shù)均顯著降低 （P<0.01）。各組小鼠腎指數(shù)測定結(jié)果見表2。

3.3 各組小鼠腎組織病理學改變觀察結(jié)果

3.3.1 大體觀察結(jié)果 空白組小鼠腎組織外觀正常；模型組小鼠腎組織明顯發(fā)白、腫大，可見明顯充血條紋；維拉帕米組小鼠腎組織較空白組體積增大，顏色發(fā)白、變淺；人工蟬花子實體高劑量組小鼠腎組織顏色較紅，體積大小與空白組相近；人工蟬花子實體中、低劑量組小鼠腎組織較空白組顏色變淺，與模型組比較有明顯改善，但改善程度不及人工蟬花子實體高劑量組，結(jié)果見圖2。

3.3.2 病理切片觀察結(jié)果 與空白組比較，模型組小鼠病理變化十分明顯，表現(xiàn)為腎小管上皮細胞重度顆粒、空泡樣變性，伴有腎間質(zhì)炎細胞浸潤，腎小管上皮細胞大量脫落；人工蟬花子實體高劑量組小鼠腎小管上皮細胞基本完整，空泡樣變性明顯改善，其組織形態(tài)接近空白組；人工蟬花子實體中、低劑量組小鼠腎組織細胞空泡樣變性程度減輕，但減輕程度不及高劑量組，且腎間質(zhì)仍存在較多炎細胞；維拉帕米組小鼠腎組織的病理情況改善程度不及人工蟬花子實體各劑量組，腎小管細胞的空泡樣變性仍然十分明顯，結(jié)果見圖3。

3.4 各組小鼠腎組織中MDA、SOD含量及Na+-K+-ATP酶活性測定結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠腎組織中MDA含量顯著升高（P<0.01），SOD含量和Na+-K+-ATP酶活性顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠腎組織中MDA含量均顯著降低（P<0.01），Na+-K+-ATP酶活性均顯著升高（P<0.01），人工蟬花子實體高、中劑量組SOD含量顯著升高（P<0.01）。各組小鼠腎組織中MDA、SOD含量及Na+-K+-ATP酶活性測定結(jié)果見表3。

4 討論

慶大霉素進入體內(nèi)經(jīng)腎排泄后被腎小管重吸收，造成腎小管上皮細胞的膜脂質(zhì)代謝功能障礙，使腎小管受損，發(fā)生急性腎衰竭，由其造成的腎衰竭是當今公認的腎毒性急性腎衰竭實驗?zāi)Ｐ蚚10]。維拉岶米作為鈣通道拮抗劑，臨床上常用其治療慶大霉素所致的急性腎衰竭。其可提高腎小球的濾過分數(shù)、直接抑制近端小管和內(nèi)髓集合管對鈉的重吸收，具有利尿、利鈉的作用 ，并有抑制腎內(nèi)腎素的分泌、清除氧自由基以及保護細胞免受損傷等作用[11]。故本研究以慶大霉素所致急性腎衰竭小鼠為模型動物，以維拉帕米為陽性對照藥，與人工蟬花子實體進行藥效比較。

當腎遭受損傷時，腎小球毛細血管發(fā)生病變，腎小球濾過功能異常，其機械屏障——濾孔增大，常引起血漿蛋白濾過增加，即表現(xiàn)為非選擇性尿蛋白。因此，血清中蛋白質(zhì)含量的變化是判斷腎功能的主要指標之一[12-14]。在本研究中，模型組小鼠血清中總蛋白含量顯著降低，提示其腎功能受到了嚴重損傷；而人工蟬花子實體給藥后能明顯升高模型小鼠血清中總蛋白含量，提示人工蟬花子實體能修復(fù)腎小球濾過的機械屏障，保護腎小球的濾過功能。

BUN屬于蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物，從腎小球濾過而排出體外，腎小球濾過功能受損，可使血液中BUN含量升高，所以常將BUN作為判斷腎小球濾過功能的指標[15-16]。Scr是目前公認的評價腎功能損傷的重要指標，是肌肉在人體內(nèi)代謝的產(chǎn)物，主要由腎小球濾過排出體外，血液中Scr含量的升高程度可反映腎功能的受損程度[17]。在本研究中，模型組小鼠血清中BUN、Scr含量顯均著升高，提示其腎功能遭到了嚴重損傷。而人工蟬花子實體給藥后能顯著降低模型小鼠血清中BUN、Scr含量，表明人工蟬花子實體能促進蛋白質(zhì)、肌肉代謝產(chǎn)物的排出，恢復(fù)腎小球的濾過能力，有較好的腎保護作用。

MDA是脂質(zhì)過氧化的指標之一，可間接反映出細胞損傷的程度。SOD能清除超氧陰離子自由基，對機體的氧化與抗氧化平衡起著重要的作用，間接反映機體清除氧自由基的能力[18]。在本研究中，模型組小鼠腎組織中MDA含量顯著升高，SOD含量顯著降低，這表明慶大霉素所致急性腎衰竭存在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的異常。給予人工蟬花子實體后，模型小鼠腎組織中MDA含量降低，SOD含量升高，這提示人工蟬花子實體可能是通過減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，同時激活自由基清除酶的活性，清除組織中的自由基，減輕自由基及其代謝產(chǎn)物對組織的傷害作用，以此來實現(xiàn)對慶大霉素所致急性腎衰竭的保護作用。Na+-K+-ATP 酶存在于細胞膜、線粒體膜及各種生物膜中，此酶的活性變化代表細胞膜功能的改變[19]。在本研究中，模型組小鼠Na+-K+-ATP酶活性下降，這可能引起依賴Na+-K+-ATP酶的膜轉(zhuǎn)運功能異常，引起Na+、水潴留，導致細胞水腫和損傷。人工蟬花子實體給藥后能使Na+-K+-ATP酶活性升高，提示其可恢復(fù)細胞膜的轉(zhuǎn)運功能，降低Na+、水潴留，減輕細胞損傷，以此來對抗慶大霉素造成的腎毒性。

綜上所述，本實驗室栽培的人工蟬花子實體能通過清除反應(yīng)性氧代謝產(chǎn)物及自由基，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護和穩(wěn)定細胞膜，以此來達到改善慶大霉素所致小鼠急性腎衰的作用，且效果優(yōu)于陽性對照藥維拉帕米。本研究結(jié)果提示，人工蟬花子實體對藥損型急性腎衰竭具有一定的保護作用，值得進一步開發(fā)利用。而關(guān)于其治療機制的深入了解，以及有效活性成分的提取分離，本課題組將繼續(xù)研究探討。

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（收稿日期：2018-05-05 修回日期：2018-07-22）

（編輯：林 靜）