雷公藤屬植物葉片中萜類成分的差異性

郭思遠 馬寶偉 吳曉毅 李佳 高偉 黃璐琦

摘要 目的：測定雷公藤屬植物葉片中5種萜類成分的含量并比較差異，研究3個物種間的化學親緣關系。方法：采用HPLC法測定28批雷公藤屬植物葉片中雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷酚新內酯、雷酚內酯和雷公藤紅素5個成分的含量，并進行方差分析和聚類分析。結果：雷公藤屬植物葉片中，雷公藤甲素、雷酚內酯和雷公藤紅素的含量差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；雷公藤內酯酮和雷酚新內酯含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。運用系統(tǒng)聚類將28批雷公藤屬植物聚為4類：第I類為東北雷公藤和昆明山海棠；第II類為雷公藤；第III類為雷公藤；第IV類為雷公藤和昆明山海棠。結論：雷公藤屬植物葉片中部分萜類成分含量差異明顯。東北雷公藤與雷公藤化學親緣關系較遠；昆明山海棠混在2者之間，與2者無明顯區(qū)分。

關鍵詞 雷公藤屬；萜類成分；含量測定；化學分類

Abstract Objective：To study the relative relationship among the three species of Tripterygium genus by measuring the contents of 5 terpenoid compositions in plant leaves of Tripterygium genus and comparing the differences.Methods：HPLC was used to measure the 5 composition contents including Triptolide，Triptonide，Neotriptophenolide，Triptophenolide and Tripterine in 28 batches of plant leaves of Triptergium genus.ANOVA and cluster analysis were also performed to verify the results.Results：There were significant differences among the contents of Triptolide，Triptophenolide and Tripterine in the plant leaves of Triptergium genus （P<0.05）； There was no significant difference between Triptonide and Neotriptophenolide.Hierarchical clustering was used to divide the 28 batches of plants of Triptergium genus into 4 kinds：I：Tripterygium regelii Sprague et Takeda and Tripterygium hypoglaucum； II：Tripterygium； III：Tripterygium； IV：Tripterygium and Tripterygium hypoglaucum.Conclusion：The differences of some contents of terpenoid compositions in plant leaves of Tripterygium genus were significant.The relative relationship of Tripterygium regelii Sprague et Takeda and Tripterygium was distant； Tripterygium hypoglaucum was between the two，which had no significant difference.

Key Words Tripterygium genus； Terpenoid composition； Content determination； Chemotaxonomy

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.002

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）、東北雷公藤（Tripterygium regelii Sprague et Takeda）和昆明山海棠（Tripterygium hypoglaucum（Levl.）Hutch.）3者均屬于衛(wèi)矛科雷公藤屬植物。雷公藤為傳統(tǒng)中藥，又名黃藤、黃臘藤、斷腸草等[1]。藥理研究顯示，其有較好的抑制免疫、抗炎、抗動脈粥樣硬化和抗腫瘤等作用[2]，臨床上主要用于腎病綜合征、類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病的治療[3]。目前，雷公藤和昆明山海棠可作為藥用植物，而東北雷公藤尚無用藥歷史[4]。

文獻報道[4-5]顯示，綜合形態(tài)特征、生物特性和地理分布分析，認為雷公藤和昆明山海棠應劃分為同一物種的2個類型，將分布于浙江和福建等海拔300～500 m以上的物種劃分為雷公藤種內的一個新變形，即中間型雷公藤[5]。有文獻通過RAPD分子標記方法研究3者遺傳關系和遺傳多樣性，結果顯示東北雷公藤明顯與其他種有顯著地遺傳差異可作為一個獨立物種，而雷公藤與昆明山海棠之間存在大量的中間類型，中間類型連接了這2個種，建議將2個種合并。

現代研究發(fā)現，雷公藤中含有二萜類、三萜類、生物堿類、倍半萜類等活性成分[6-7]。本實驗以雷公藤的萜類活性成分：雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷酚新內酯、雷酚內酯和雷公藤紅素為指標，對不同產地的雷公藤葉片、東北雷公藤葉片和昆明山海棠葉片進行含量測定，并參照藥用植物化學分類研究方法[8]對樣品進行系統(tǒng)聚類分析，為進一步研究3者萜類含量差異和物種分類提供化學角度支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（Agilent 1200，安捷倫科技有限公司），冷凍干燥機（Alpha 1-2LDplus，德國格馬有限責任公司），混合球磨儀（MM400，德國RETSCH公司），循環(huán)水式多用真空泵（SHB-III，鄭州長城科工貿有限公司），數顯恒溫水浴鍋（SB-1100，上海愛朗儀器有限公司），低速臺式離心機（SIGMA 1-14，德國Sigma實驗室離心機股份有限公司）。

1.2 試劑 雷公藤甲素（成都曼思特生物科技有限公司生產，生產批號MUST-14092510），雷公藤內酯酮（成都曼思特生物科技有限公司生產，生產批號MUST-14111115），雷酚新內酯（藥渡經緯信息科技有限公司生產，生產批號YD0000883-170220），雷酚內酯（上海源葉生物科技有限公司生產，生產批號Y25A3S1），雷公藤紅素（成都普思生物科技有限公司生產，生產批號R0130198）；上述對照品HPLC純度≥98%。乙腈（色譜純，Fisher Chemical），甲醇（分析純，北京化工廠生產），磷酸（色譜純，北京現代東方精細化學品有限公司生產），DMSO（純度>99.5%，SIGMA-ALORICH中國公司生產），娃哈哈純凈水（純化水，娃哈哈宏振飲料有限公司生產）。

1.3 分析樣品 本實驗所用雷公藤屬植物葉片由本課題組野外采集，其基原植物經鑒定為雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）、東北雷公藤（Tripterygium regelii Sprague et Takeda）、昆明山海棠（Tripterygium hypoglaucum（Levl.）Hutch.）。3者取其葉，在-80 ℃冰箱中保存，再于冷凍干燥機中冷凍干燥24 h，備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：DIKMA Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），洗脫梯度（0～12 min，38%A；12～25 min，38%～60%A；25～30 min，60%～65%A；30～35 min，65%A；35～48 min，65%～85%A；48～52 min，85%A；52～54 min，85%～83%A，54～65 min，83%A）；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：220 nm。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取雷公藤甲素對照品2.38 mg、雷公藤內酯酮對照品1.44 mg、雷酚新內酯1.53 mg、雷酚內酯1.67 mg，于2 mL容量瓶中，用50%DMSO甲醇溶液溶解，定容至刻度，搖勻即得，含雷公藤甲素對照品1 190 μg/mL、雷公藤內酯酮對照品720 μg/mL、雷芬新內酯對照品765 μg/mL、雷酚內酯對照品835 μg/mL、雷公藤紅素對照品930 μg/mL的混合對照品溶液。進樣10 μL。對照品色譜圖見圖1。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取昆明山海棠、雷公藤、東北雷公藤干燥葉片適量。取昆明山海棠、雷公藤樣品于2 mL離心管中，混合球磨儀粉碎2 min，加入10倍量體積（w/v）80%甲醇水溶液，超聲提取2 h，搖勻，離心10 min（14 000 r/min），上清液離心5 min（14 000 r/min），上清液微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得；取東北雷公藤樣品研成粉末于15 mL離心管中，加入10倍量體積（w/v）80%甲醇水溶液，超聲提取2 h，抽濾，濃縮，用80%甲醇水溶液定容至2 mL，離心10 min（14 000 r/min），上清液離心5 min（14 000 r/min），上清液微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得。進樣15 μL。

2.4 線性關系考察 精密吸取對照品儲備液適量，分別用50%DMSO甲醇溶液溶解逐漸稀釋配制成5個不同濃度的混合對照品溶液，用“2.1項”下色譜條件進行分析。以峰面積為縱坐標，對照品溶液濃度為橫坐標，進行回歸，回歸方程及線性關系。見表1。

2.5 樣品測定結果 按2.3項下的制備方法制備供試溶液，按2.1項下的色譜條件進樣，測定峰面積，計算含量。見表2。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS統(tǒng)計學軟件對雷公藤屬3個物種化學成分含量數據進行統(tǒng)計學分析，結果顯示，不同物種間雷公藤甲素、雷酚內酯和雷公藤紅素含量，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；不同物種間雷公藤內酯酮和雷酚新內酯含量，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖2。

2.7 聚類分析 以雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷酚新內酯、雷酚內酯和雷公藤紅素五種化學指標作為聚類指標，以各產區(qū)樣品各指標作為聚類數據，采用系統(tǒng)聚類法對不同樣品進行聚類分析。見圖3。

由圖3可見，樣品可被聚為四類，雷公藤74、雷公藤75、雷公藤76、雷公藤77被聚為一類，雷公藤68a、雷公藤78、雷公藤79、雷公藤80和雷公藤81被聚為一類，昆明山海棠1、雷公藤69、雷公藤70a、雷公藤72被聚為一類；東北雷公藤和昆明山海棠2、3、4、5被聚為另一類?？梢姡瑬|北雷公藤樣品可明顯與雷公藤樣品區(qū)分，2者萜類成分整體含量有較大差異；而昆明山海棠樣品混在2者之間不能區(qū)分。此外，雷公藤樣品不能聚為一類，說明不同雷公藤樣品之間萜類成分含量有差異，樣品質量的穩(wěn)定性不如東北雷公藤。雷公藤74、75、76、77與東北雷公藤樣品可聚為一大類，這可能與其所處海拔與采收時間有關，使其萜類含量與東北雷公藤接近。

3 討論

3.1 提取方法及色譜條件的選擇 本實驗在選擇提取方法時，參考了不同文獻[9-12]，比較了浸提法、加熱回流法、煎煮法和超聲提取法，綜合提取時間，提取效率考慮，最終選擇了超聲提取法。

在確定色譜條件時，參考了不同的文獻[13-16]，比較了0.05%磷酸水溶液、0.05%乙酸水溶液、與0.05%磷酸水溶液相同pH值的乙酸水溶液作為流動相時的分離效果，比較了流速為1 mL/min和0.8 mL/min時的分離效果，實驗結果顯示，以0.05%磷酸水溶液為水相，流速為0.8 mL/min時，分離效果較好且基線相對平坦。

3.2 統(tǒng)計分析雷公藤屬植物的差異 雷公藤屬3個物種的萜類含量測定結果顯示，雷公藤與昆明山海棠中的雷公藤甲素和雷公藤內酯酮含量，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而雷酚新內酯、雷酚內酯和雷公藤紅素含量，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。雷公藤與東北雷公藤中的雷公藤甲素、雷酚內酯和雷公藤紅素含量，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而雷公藤內酯酮和雷酚新內酯含量，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。東北雷公藤與昆明山海棠中的雷公藤甲素和雷酚內酯含量，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而雷公藤內酯酮、雷酚新內酯和雷公藤紅素含量，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。3者比較，雷公藤、東北雷公藤和昆明山海棠中的雷公藤甲素、雷酚內酯和雷公藤紅素含量，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而雷公藤內酯酮和雷酚新內酯含量，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。其中，雷公藤中雷公藤甲素、雷酚新內酯和雷公藤紅素的含量在3者中最高；東北雷公藤中雷公藤內酯酮和雷酚內酯的含量在3者中最高，而雷公藤甲素的含量在3者中最低；昆明山海棠中雷公藤內酯酮、雷酚新內酯、雷酚內酯和雷公藤紅素的含量在3者中均最低。

3.3 雷公藤屬植物分類學爭議 雷公藤屬植物在分類學上一直存在爭議。在《中國植物志》中，雷公藤屬植物分為了雷公藤、東北雷公藤和昆明山海棠3個種。然而在隨后出版的《中國植物志》中，雷公藤屬植物的3個種均被命名為雷公藤。據文獻報道[5]，從遺傳分類角度分析，雷公藤與昆明山海棠之間存在大量的中間類型，使種間界限模糊，而東北雷公藤可作為一個獨立的物種。有定量分析表明[13]，雷公藤和昆明山海棠中19種化合物的含量存在顯著性差異。但是，對不同種群和個體的雷公藤屬植物進行雷公藤甲素含量測定，發(fā)現東北雷公藤中雷公藤甲素含量很低，而雷公藤和昆明山海棠中雷公藤甲素含量，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）[17]。此外，還有文獻指出[4]，東北雷公藤和昆明山海棠中11個化學成分的含量，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0001）。本實驗參照藥用植物化學分類研究方法，基于萜類成分對樣品進行系統(tǒng)聚類分析，通過系統(tǒng)聚類分析發(fā)現東北雷公藤與雷公藤可明顯區(qū)分，2者化學親緣關系較遠，而昆明山海棠混在2者之間，與2者無明顯區(qū)分。

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