HBV睞CLF患者外周血和肝臟IL32的表達(dá)水平與肝損傷的相關(guān)性

鄒勇　鄭常龍　楊小安

【摘要】目的探討HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭（HBVACLF）患者外周血和肝臟IL32的表達(dá)水平與肝損傷的相關(guān)性。方法選擇需肝移植手術(shù)的HBVACLF患者及輕度慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者各20例。收集HBVACLF患者和CHB患者外周血血清，HBVACLF患者手術(shù)中切除的肝組織及輕度CHB患者肝穿刺標(biāo)本，另收集5例手術(shù)切除肝血管瘤患者的血液標(biāo)本及遠(yuǎn)離腫瘤的正常肝組織作為正常對照。分別利用ELISA和免疫組織化學(xué)染色檢測輕度CHB患者和HBVACLF患者外周血血清及肝組織中IL32的水平。分析外周血和肝臟IL32的表達(dá)水平及與肝損傷程度（總膽紅素水平）的相關(guān)性。結(jié)果HBVACLF患者外周血IL32水平高于輕度CHB患者及正常對照者（P均<0001）；HBVACLF患者肝組織中IL32的水平亦高于輕度CHB患者及正常對照者（P均<0001）。HBVACLF患者外周血和肝臟IL32水平與血清總膽紅素水平均呈正相關(guān)（rs分別為0686和0544，P均<005）。 結(jié)論促炎細(xì)胞因子IL32高表達(dá)可能是導(dǎo)致HBVACLF免疫性肝損傷加劇、肝細(xì)胞大量凋亡和壞死的重要因素。

【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒；肝衰竭；白介素32；促炎細(xì)胞因子

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation between the expression levels of interleukin32 （IL32） in the peripheral blood and liver and liver injury in patients diagnosed with hepatitis B virusrelated acuteonchronic liver failure （HBVACLF） MethodsTwenty HBVACLF patients scheduled to undergo liver transplantation and 20 counterparts diagnosed with mild chronic hepatitis B （CHB） were enrolled in this study Peripheral blood serum samples were obtained from HBVACLF and CHB patients Liver tissues were collected from HBVACLF patients by surgical resection， and those were obtained from CHB patients via needle biopsy Another 5 cases of surgical resection of hepatic hemangioma were removed from normal liver tissue as a normal control The expression levels of IL32 in the peripheral blood and liver tissues were quantitatively measured by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） and immmunohistochemical staining The correlation between the expression levels of IL32 in the peripheral blood and liver and liver injury （total bilirubin， TBIL level） was analyzed ResultsThe expression level of IL32 in the peripheral blood of HBVACLF patients was remarkably higher than those of mild CHB counterparts and normal controls （all P<0001） The expression level of IL32 in the liver of HBVACLF patients was significantly upregulated compared with that in those with mild CHB and normal liver tissues （all P<0001） The expression levels of IL32 in the peripheral blood and liver of HBVACLF patients were positively correlated with the serum TBIL levels with correlation coefficients of 0686 and 0544（both P<005） ConclusionThe significantly upregulated expression of IL32， as a proinflammatory cytokine， is a potential biomarker which aggravates immunitymediated liver injury and promotes hepatic cellular apoptosis and necrosis in HBVACLF patients

【Key words】Hepatitis B virus； Liver failure； Interleukin32； Proinflammatory cytokine

HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭（HBVACLF）是在慢性乙型病毒性肝炎（CHB）的基礎(chǔ)上，因急性誘因如HBV再激活、感染、酒精、藥物、未知的肝毒等因素作用下發(fā)生的急性或亞急性肝功能失代償?shù)呐R床癥候群，臨床表現(xiàn)為黃疸和凝血障礙，失代償性腹水，伴或不伴有肝性腦病[12]。其病情兇險，發(fā)展迅猛，許多患者在數(shù)周甚至數(shù)日內(nèi)即出現(xiàn)大片肝細(xì)胞壞死，廣泛的炎性細(xì)胞浸潤和纖維蛋白的沉積，最后發(fā)展為肝衰竭。目前臨床上缺乏特異、有效的治療和干預(yù)手段，除非實施緊急肝移植（國外以肝移植為主要治療手段，肝移植后1年存活率約為50%～60%），否則絕大部分患者預(yù)后不良。HBVACLF已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人民健康的惡性疾病，因此深入研究其發(fā)病機(jī)制對于降低肝衰竭患者的病死率及改善預(yù)后有著重要意義。HBVACLF的發(fā)生、發(fā)展與大量促炎細(xì)胞因子的生成和暴發(fā)密切相關(guān)。大量促炎細(xì)胞因子如TNF、IL2、IL6、IL10、IL17等通過一系列的級聯(lián)反應(yīng)形成炎性因子的“瀑布效應(yīng)”及SIRS等，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞的變性、壞死、凋亡及功能衰竭，并可導(dǎo)致MODS[35]。本研究通過檢測HBVACLF患者外周血和肝臟促炎細(xì)胞因子IL32的表達(dá)水平，探討其與肝損傷的相關(guān)性，旨在為揭示HBVACLF的發(fā)病機(jī)制提供新的思路和理論依據(jù)。

一、研究對象

HBVACLF和CHB患者均來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝臟外科和感染科。研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬

簽署知情同意書后，收集20例住院輕度CHB患者外周血血清樣本和肝組織穿刺標(biāo)本，20例行肝移植手術(shù)的HBVACLF患者術(shù)前外周血血清樣本和術(shù)中切除的肝組織標(biāo)本。另收集5例手術(shù)切除肝血管瘤患者的血清樣本及遠(yuǎn)離腫瘤的正常肝組織作為正常對照。輕度CHB和HBVACLF的診斷參考《CHB防治指南（2010年版）》和《肝衰竭診治指南（2012年版）》的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。同時排除合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒，HIV、真菌、細(xì)菌等其他病原體感染以及自身免疫性肝病、酒精性肝病和原發(fā)性肝癌患者。正常對照者、輕度CHB患者及HBVACLF患者的一般資料見表1。

二、儀器與試劑

包括7170A型全自動生化分析儀（日本日立公司），ELX800酶標(biāo)儀（美國寶特公司）；Human IL32 DuoSet ELISA試劑盒（美國R&D公司），Purified antihuman IL32αβγδ（美國BioLegend公司）；HRP酶標(biāo)二抗（丹麥DAKO公司）。

三、研究方法

1血清IL32水平的檢測

用ELISA檢測3組受試者血清IL32水平，嚴(yán)格按照說明書操作。

2肝組織IL32水平的檢測

免疫組織化學(xué)染色的步驟如下：①石蠟切片脫蠟至水；②抗原修復(fù)（001 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液，pH=60），微波中高檔5 min 3次，每次間隔1 min，自然冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液浸泡3 min；③3%過氧化氫溶液浸泡15 min，Tris緩沖液振洗5 min共3次；④ 1∶[KG-*2]20正常兔血清室溫孵育30 min；⑤倒去溶液，不沖洗，滴加50 μl（1∶[KG-*2]100）鼠抗人IL32單克隆混合抗體于切片上，置濕盒內(nèi)37℃孵育1 h；⑥Tris緩沖液沖洗5 min共3次，每張切片加入50～100 μl辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗，濕盒中孵育30 min，Tris緩沖液沖洗2 min共3次；⑦滴加足以覆蓋組織的現(xiàn)配二苯聯(lián)苯胺工作液，鏡下觀察顯色情況，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)；⑧滴加足以覆蓋組織的紅色堿性磷酸酶工作液，孵育5～20 min，鏡下觀察顯色情況，蒸餾水沖洗終止顯色；⑨通風(fēng)櫥吹干玻片，封片劑封片。利用ImagePro Plus 60圖像分析軟件分析肝組織IL32的相對表達(dá)量。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 150進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布的計量資料以[AKx-D]±s表示，多組間均數(shù)的比較采單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSDt檢驗；非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（最小值～最大值）表示。相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

[JZ]結(jié)果

一、HBVACLF、輕度CHB患者和正常對照者的血清IL32水平比較

HBVACLF患者外周血血清IL32水平為（8367±2297）ng/L，輕度CHB患者外周血血清

IL32水平為（1862±386）ng/L，正常對照者外周血血清IL32水平為（712±92）ng/L，HBVACLF患者外周血血清IL32水平均高于輕度CHB患者和正常對照者（3者比較F=104058、P<0001，兩兩比較P均<0001），見圖1。

二、HBVACLF、輕度CHB患者和正常對照者的肝組織IL32相對表達(dá)量比較

HBVACLF患者肝組織IL32表達(dá)水平為1763±369，高于輕度CHB患者的326±76和正常對照者的153±57（3者比較F=188922、P<0001，兩兩比較P均<0001），見圖2及圖3。

三、外周血和肝臟IL32的表達(dá)水平與肝損傷的相關(guān)性分析

討論

IL32是一種新發(fā)現(xiàn)的促炎細(xì)胞因子，主要由T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、上皮細(xì)胞分泌，具有促炎介質(zhì)的特性，可通過激活NFκB、AP1和p38 MAPK等通路誘導(dǎo)IL1β、TNFα、IL6等細(xì)胞因子的表達(dá)[67]。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，IL32作為促炎細(xì)胞因子在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、特異性皮炎、胰腺炎、CHB、慢性丙型病毒性肝炎等炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[814]。本研究顯示，HBVACLF患者外周血和肝組織IL32水平均高于輕度CHB患者及正常對照者，并且與肝損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)，表明IL32在HBVACLF肝細(xì)胞的凋亡和壞死中可能發(fā)揮著重要作用。

然而，IL32是如何促進(jìn)HBVACLF免疫介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷？我們推測可能有以下機(jī)制：①HBVACLF的發(fā)病與促炎細(xì)胞因子的生成和暴發(fā)密切相關(guān)。大量促炎細(xì)胞因子如IL1β、TNFα、IL2、IL18、IFNγ等均可誘導(dǎo)T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、外周血單個核細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)IL32。IL32亦可誘導(dǎo)肝臟免疫細(xì)胞分泌TNFα、IL1β、IL6、IFNγ等促炎細(xì)胞因子和IL8、巨噬細(xì)胞炎性蛋白2、CC類趨化因子配體5等趨化因子，激活細(xì)胞因子“瀑布級聯(lián)效應(yīng)”，募集

大量炎癥細(xì)胞，從而進(jìn)一步加重免疫細(xì)胞介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。②IL32可能通過活化凋亡相關(guān)蛋白Caspase3通路誘導(dǎo)HBV感染細(xì)胞凋亡，加重肝細(xì)胞損傷。③IL32可能通過增強免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞的殺傷活性，促進(jìn)免疫介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。IL32促進(jìn)肝細(xì)胞損傷的確切機(jī)制值得深入研究。

綜上所述， IL32表達(dá)與HBVACLF肝損傷密切相關(guān)，提示血清或肝臟IL32水平可作為反映肝衰竭患者病情危重程度的指標(biāo)之一，進(jìn)一步深入研究IL32介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷機(jī)制將有助于為臨床治療提供新的分子靶點和理論依據(jù)。

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（收稿日期：20170920）

（本文編輯：林燕薇）