黃芪解毒方對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡及C-myc基因表達(dá)的影響

宋魏 崔云 張建波 孫淼淼 夏慶欣

摘要 目的：探討黃芪解毒方對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡及C-myc基因表達(dá)的影響。方法：胃癌細(xì)胞SGC7901分別用黃芪解毒湯濃縮液（實(shí)驗(yàn)組）及阿霉素溶液（陽性對(duì)照組）干預(yù)，無任何藥物處理的胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞為對(duì)照組。應(yīng)用MTT法及流式細(xì)胞法分別檢測胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖及凋亡情況，RT-PCR法檢測細(xì)胞中C-myc基因表達(dá)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組隨培養(yǎng)時(shí)間的延長細(xì)胞增殖抑制率均升高（P<0.01），且實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h細(xì)胞增殖抑制率高于陽性對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組（P<0.01），實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組2組間細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組C-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.69±0.63）、（0.68±0.37）、（0.86±0.28），實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組C-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（P<0.01），且實(shí)驗(yàn)組低于陽性對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論：黃芪解毒方可有效抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，并促其凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)C-myc基因表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞 胃癌;黃芪解毒方;SGC-7901細(xì)胞;增殖;凋亡;C-myc基因;阿霉素;表達(dá);惡性腫瘤;Wnt/β-catenin信號(hào)通路

Effects of Huangqi Jiedu Decoction on Proliferation， Apoptosis and C-myc Gene

Expression of Gastric Cancer SGC-7901 Cells

Song Wei， Cui Yun， Zhang Jianbo， Sun Miaomiao， Xia Qingxin

（Tumor Hospital Affiliated to Zhengzhou University， Zhengzhou 450008， China）

Abstract Objective：To investigate the effects of Huangqi Jiedu Decoction on proliferation， apoptosis and C-myc gene expression of gastric cancer SGC-7901 cells. Methods：SGC7901 gastric cancer cells were intervened respectively with Huangqi Jiedu Decoction concentrate （experimental group） and adriacin solution （positive control group）， and SGC7901 cells without any drug treatment were for control group. MTT assay and flow cytometry were used to detect the proliferation and apoptosis of SGC7901 cells， C-myc gene expression in cells was detected by RT-PCR. Results：The inhibitory rate of cell proliferation in experimental group and positive control group increased with the prolongation of culture time （P<0.01）， and the inhibition rate of cell proliferation in experimental group 48 hours and 72 hours after cell culture was higher than those in positive control group （P<0.05）. The apoptosis rate of experimental group and positive control group was significantly higher than that of control group （P<0.01）， but there was no significant difference between experimental group and positive control group （P>0.05）. The relative expression of C-myc mRNA in control group， experimental group and positive control group were （1.69±0.63），（0.68±0.37），（0.86±0.28） respectively. The relative expression of C-myc mRNA in experimental group and positive control group was lower than that in control group （P<0.01）， and experimental group was lower than positive control group （P<0.05）. Conclusion：Huangqi Jiedu Decoction can effectively inhibit the proliferation and promote the apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells， which may be related to the down-regulation of C-myc gene expression.

Key Words Gastric cancer;Huangqi Jiedu Decoction;SGC-7901 cells;Proliferation;Apoptosis;C-myc gene;Doxorubicin;Expression;Malignant tumor;Wnt/beta-catenin signaling pathway

中圖分類號(hào)：R273文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.042

胃癌是一種惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤疾病，病情進(jìn)展迅速，隨著生活方式及周圍環(huán)境的變化，其在臨床發(fā)病率及死亡率均呈升高趨勢，嚴(yán)重威脅患者生命安全。胃癌發(fā)病隱匿，早期易出現(xiàn)局部浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，確診難度較大，就診時(shí)50%的患者已進(jìn)展至中晚期或發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移[1-2]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，異常激活后將導(dǎo)致細(xì)胞生長異常，C-myc是該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的一個(gè)重要的靶基因，與腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)[3]。本研究采用黃芪解毒方劑干預(yù)胃癌SGC-7901細(xì)胞，觀察其對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及C-myc基因的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 胃癌細(xì)胞SGC7901，購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 藥物 黃芪解毒方湯劑（方中黃芪、半枝蓮、薏苡仁、白花蛇舌草各30 g，太子參、玄參、女貞子、龍葵各15 g，浙貝母、白術(shù)、茯苓、麥冬、山慈菇各10 g，甘草6 g，藥物浸浸泡后武火煮沸，文火煎煮30 min，煎煮2次合并藥液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5倍左右，生藥濃度1.467 g/mL，離心將上清過濾后備用）;阿霉素（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：1307E1，生理鹽水配制成1 mg/mL）。

1.1.3 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶，均購于美國Gibco公司;噻唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜購于美國Sigma公司;RNA提取試劑盒、SYBPPremix ExTaqTM及所涉及引物，均購于日本TakaRa公司及其設(shè)計(jì)合成。SW-CJ型超凈工作臺(tái)，購于蘇州凈化集團(tuán)安泰公司;Model 311型CO2培養(yǎng)箱，購自美國Thermo Forma公司;DNM-9602G自動(dòng)酶標(biāo)儀，購于北京普朗新技術(shù)有限公司;ROTOR-GEN 3000型實(shí)時(shí)定量PCR儀，購于澳大利亞Cobette公司;Heal ForeNeofuge13臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，購于上海力申科學(xué)儀器有限公司;CKX41型倒置顯微鏡，購于日本Olympus公司等。

1.2 方法

1.2.1 胃癌SGC7901細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞SGC7901用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d按照1∶3比例傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測黃芪解毒方對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞SGC7901，0.25%胰蛋白酶消化后，按3×104個(gè)/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入黃芪解毒湯濃縮液及阿霉素溶液，8復(fù)孔對(duì)照，為實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組，另設(shè)對(duì)照組（胃癌細(xì)胞SGC7901 200 μL/孔），在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[4]。細(xì)胞培養(yǎng)第24、48、72 h，分別加入5 mg/mL MTT溶液，20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)液，加二甲基亞砜，150 μL/孔，振蕩10 min，用自動(dòng)酶標(biāo)儀測定OD492 nm值。增殖抑制率=（OD492 nm對(duì)照-OD492 nm實(shí)驗(yàn)）/OD492 nm對(duì)照×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測黃芪解毒方對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響 取對(duì)數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞SGC7901，0.25%胰蛋白酶消化后，按3×104個(gè)/mL接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入黃芪解毒湯濃縮液及阿霉素溶液，3復(fù)孔對(duì)照，為實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組，對(duì)照組加等量生理鹽水，48 h后收集每孔細(xì)胞，4 ℃ PBS洗3次，依次加入結(jié)合緩沖液500 μL、Alexa Fluor 488Annxin V和PI 5 μL，避光染色10 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況[5]。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測C-myc mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞培養(yǎng)基處理同1.2.2，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，各樣本取總RNA 5 μg，合成cDNA，取2 μL cDNA行PCR反應(yīng)[6]。PCR擴(kuò)增體系為25 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)含4 ng/mL溴乙錠的TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果分析采用紫外光凝膠成像系統(tǒng)，目的基因C-myc IOD值/β-actin IOD值為mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪解毒方對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞形態(tài)的影響 實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組24 h細(xì)胞增殖抑制率（%）分別為（40.56±1.68）、（39.95±2.77），48 h細(xì)胞增殖抑制率（%）分別為（48.67±2.35）、（46.57±2.96），72 h細(xì)胞增殖抑制率（%）分別為（55.67±3.24）、（53.85±2.87）。實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組隨培養(yǎng)時(shí)間的延長細(xì)胞增殖抑制率均升高（F=12.334、8.231，P<0.01），且實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h細(xì)胞增殖抑制率高于陽性對(duì)照組（P<0.05）。見表1。對(duì)照組胃癌SGC7901細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，數(shù)量較多，而實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組胃癌SGC7901細(xì)胞變圓，皺縮，且有凋亡小體形成。見圖1。

表1 黃芪解毒方對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞

增殖抑制率的影響（±s，%）

注：與陽性對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 黃芪解毒方對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡率的影響 胃癌細(xì)胞SGC7901培養(yǎng)48 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率（%）分別為（1.56±0.18）、（41.23±1.26）、（40.15±1.87），實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組（P<0.01），實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組2組間細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

圖1 顯微鏡觀察黃芪解毒方對(duì)胃癌

SGC7901細(xì)胞形態(tài)的影響

注：×100，1：對(duì)照組，2：實(shí)驗(yàn)組，3：陽性對(duì)照組

表2 黃芪解毒方對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞

凋亡率的影響（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01

2.3 黃芪解毒方對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901C-myc mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR檢測結(jié)果可見，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組C-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.69±0.63）、（0.68±0.37）、（0.86±0.28），實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組C-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（P<0.01），且實(shí)驗(yàn)組低于陽性對(duì)照組（P<0.05）。見圖2。

圖2 黃芪解毒方對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901C-myc

mRNA表達(dá)的影響

注：1：對(duì)照組;2：實(shí)驗(yàn)組;3：陽性對(duì)照組

3 討論

手術(shù)切除及術(shù)后放化療治療胃癌在臨床已得到普遍應(yīng)用，雖取得一定進(jìn)展，但并未明顯提高總體治療水平。中醫(yī)藥在我國腫瘤的防治中有著悠久的歷史，近年來中藥有效成份抗腫瘤作用的研究也逐漸增多，張少楠等[7]研究表明，姜黃素可抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖和侵襲能力。謝軍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可改變肝癌HepG2細(xì)胞線粒體膜電位誘導(dǎo)其凋亡，進(jìn)而有效抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖。因此非常有必要探索惡性腫瘤新的治療模型，使癌癥患者從中獲益。

胃癌術(shù)后屬于中醫(yī)“傷科”范疇，患者多正氣虧損、氣血虛弱，夾雜風(fēng)寒濕邪等乘虛而入，應(yīng)以活血化瘀為主要治療原則，同時(shí)，術(shù)后患者需要進(jìn)行常規(guī)放化療進(jìn)一步防止惡性腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，但放化療藥物對(duì)機(jī)體造成的不良反應(yīng)也不容小覷。本研究所采用的黃芪解毒方中，黃芪健脾補(bǔ)中、益衛(wèi)固表、升陽舉陷、托毒生肌為君藥，太子參補(bǔ)氣健脾、生津潤肺為臣，兩者主扶正，共奏益氣健脾養(yǎng)陰之功;白術(shù)溫補(bǔ)脾氣，茯苓滲濕健脾、補(bǔ)益心神、寧心安神，兩者同用，加強(qiáng)益氣健脾除濕之功;玄參滋陰、瀉火解毒、清熱涼血，薏苡仁滲濕健脾、利水消腫，麥冬養(yǎng)陰生津、潤肺清心，半枝蓮與白花蛇舌草清熱解毒、利濕通淋消腫，女貞子滋補(bǔ)肝腎;龍葵利水，浙貝母清熱，兩者可用于散結(jié)，甘草養(yǎng)胃和中，調(diào)和諸藥為使，全方共奏益氣養(yǎng)陰解毒功效。本研究觀察黃芪解毒方對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901體外的作用機(jī)制，采用MTT法觀察其對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用，并觀察其對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的影響，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組隨培養(yǎng)時(shí)間的延長細(xì)胞增殖抑制率均升高，且實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h細(xì)胞增殖抑制率高于陽性對(duì)照組。對(duì)照組胃癌SGC7901細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，數(shù)量較多，而實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組胃癌SGC7901細(xì)胞變圓，皺縮，且有凋亡小體形成。表明黃芪解毒方和阿霉素均對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞生長有一定抑制作用，且可引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的變化，造成細(xì)胞壞死及凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡失衡是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖的關(guān)鍵因素，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是臨床治療腫瘤性疾病的有效手段之一[9]。本研究采用流式細(xì)胞法進(jìn)一步檢測胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，2組間細(xì)胞凋亡率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示黃芪解毒方可通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的無限制增殖。

Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活，致使β-catenin水平失控是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[10-11]。封閉異?；罨腤nt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的，目前已成為臨床抗腫瘤治療的熱點(diǎn)方向。C-myc是由原癌基因myc編碼的一種轉(zhuǎn)錄因子，有研究[12-13]顯示，C-myc蛋白的含量決定了細(xì)胞發(fā)生凋亡的速度及其對(duì)誘導(dǎo)因素的敏感性;C-myc還可調(diào)控端粒酶活性，一旦C-myc水平升高將誘導(dǎo)端粒酶的活化進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[14]。本研究采用RT-PCR法檢測胃癌細(xì)胞SGC7901中C-myc基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組C-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組低于陽性對(duì)照組，提示黃芪解毒方可能是通過下調(diào)C-myc基因表達(dá)水平進(jìn)而從多方面抑制腫瘤的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，具有較好的抗腫瘤治療作用。

綜上所述，黃芪解毒方可有效抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，并促其凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)C-myc基因表達(dá)相關(guān)，但是該方劑為中藥煎劑，藥物組成及成分較多，因此需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究探討及具體作用機(jī)制，以更好的指導(dǎo)其在臨床的應(yīng)用。

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