大葉山楝根的化學(xué)成分及細(xì)胞毒活性研究

李薇 黃淼 梅文莉 董文化 王軍 蔡彩虹 蓋翠娟 戴好富

摘 要：該研究從大葉山楝根95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分離得到10個化合物，經(jīng)波譜解析分別鑒定為schleicheol 2 （1），β-扶桑甾醇（2），fregenedadiol （3），異巴西紅厚殼素 （4），丁香酯素 （5），表丁香酯素 （6），graminone A （7），sylvatesmin （8），Z-6-十九烯酸甲酯 （9），棕櫚酸 （10）。其中，化合物1-4、化合物7-9為首次從山楝屬植物中分離得到。細(xì)胞毒活性測試結(jié)果表明，化合物1和化合物2對人胃癌細(xì)胞SGC-7901生長具有一定的抑制活性。

關(guān)鍵詞：楝科， 大葉山楝， 化學(xué)成分， 細(xì)胞毒活性

中圖分類號：Q946.8

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）04-0457-06

Abstract：Aphanamixis grandifolia belongs to genus Aphanamixis of family Meliaceae. We made the experiment to clarify the constituents from the roots of A. grandifolia in this paper. The chemical constituents were isolated by silica gel， Sephadex LH-20 column chromatographic methods. The structures were identified by spectral analysis and comparing with the previously reported literatures. The results showed that ten compounds were isolated from the ethyl acetate of ethanol extract from A. grandifolia and identified respectively as schleicheol （1）， β-rosasterol （2）， fregenedadiol （3）， isojacareubin （4）， syringaresinol （5）， episyringaresinol （6）， graminone A （7）， sylvatesmin （8）， methyl-Z-6-nonadecenoate （9）， ralmitic acid （10）. The compounds 1-4， 7-9 were obtained from A. grandifolia for the first time. The results of cytotoxic activity showed that compounds 1 and 2 had certain inhibitory activity on the growth of human gastric cancer cell SGC-7901.

Key words：Meliaceae， Aphanamixis grandifolia， chemical constituents， cytotoxic activity

大葉山楝（Aphanamixis grandifolia）是楝科（Meliaceae）植物，別名山欏（海南）、紅蘿木（廣西）、羅浪果、苦柚木（廣東）、胡桐（云南）、葉好嬌（云南哈尼族語），生長于低海拔至中海拔（500～1 000 m）的山地、溝谷、密林或疏林中。國內(nèi)主要分布在云南省的西雙版納自治州、普洱市和麻栗坡縣，廣西、廣東及海南也有分布。國外主要分布在中南半島，印度尼西亞（爪哇、加里曼丹）至帝汶島，馬來半島和伊里安島，有些地方已引為栽培（如美國夏威夷等）。根據(jù)《新華本草綱要》中的記載，大葉山楝的根及葉具有舒筋活絡(luò)、通痹及祛風(fēng)除濕等功效，在民間用于治療四肢麻木、屈伸不利、拘攣和風(fēng)寒痹痛等疾病，為祛風(fēng)止痛藥。

國內(nèi)外學(xué)者從大葉山楝枝葉、莖皮、果實和種子中分離鑒定出了四環(huán)三萜類、二萜類、倍半萜類等多種化學(xué)成分，但對于大葉山楝地下部分的物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少。為了更全面地掌握大葉山楝的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對大葉山楝根95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物進行了化學(xué)成分的分離鑒定，共得到10個化合物（1-10），并對這10個化合進行了細(xì)胞毒活性測試。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

儀器：AV-500型超導(dǎo)核磁儀（Brucker，German）；N-1000 （2L）立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Autospec-3000質(zhì)譜儀；柱色譜硅膠（200～300目）和薄層層析硅膠（Qingdao Marine Chemical Co. Ltd，China）；Sephadex LH-20（Merck，German）；RP-18反相材料 （20～45 μm）（Fuji Silysia Chemical Co. Ltd，Japan），MCI Gel（75～150 μm）（Mitsubishi chemical corporation，Japan）。

材料：大葉山楝（Aphanamixis grandifolia）樣品于2013 年9 月采自海南省海口市石山鎮(zhèn)，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所劉壽柏博士鑒定，憑證標(biāo)本（No. AG 20130920）存放于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。人胃癌細(xì)胞SGC-7901 和慢性髓原白血病細(xì)胞K562 均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 提取和分離

將干燥的大葉山楝根粉碎成粗粉（8.5 kg），用95%乙醇加熱回流提取3次，每次3 h。減壓回收乙醇至無醇味，得到乙醇提取物，將乙醇提取物分散于水中成懸濁液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，分別濃縮得浸膏。

將乙酸乙酯萃取物（104.0 g）經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇（1∶0～0∶1）梯度洗脫，得到10個流分（Fr.1-10）。Fr.2（2.8 g）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（以氯仿-甲醇1∶1為洗脫系統(tǒng)）和反復(fù)硅膠柱色譜（以石油醚-乙酸乙酯，石油醚-丙酮為洗脫系統(tǒng)） 得到化合物4（2.4 mg）和10（8.0 mg）。Fr.4（5.1 g）經(jīng)MCI柱色譜、反相RP-18柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜（以氯仿-甲醇1∶1，甲醇為洗脫系統(tǒng)）和反復(fù)硅膠柱色譜（以石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、石油醚-氯仿為洗脫系統(tǒng)）得到化合物1（2.8 mg），2（13.1 mg）和9（29.2 mg）。Fr.5（5.1 g）反相RP-18柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜（以甲醇為洗脫系統(tǒng)）和反復(fù)硅膠柱色譜（以石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、石油醚-氯仿、氯仿-甲醇、氯仿-丙酮為洗脫系統(tǒng)）得到化合物3（6.3 mg），5（8.8 mg），6（9.1 mg），7（3.0 mg） 和8（2.4 mg）。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色針狀結(jié)晶，C30H52O2，ESI-MS m/z：445 [M+H]+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：3.62（1H，m，H-3），5.76（1H，dd，J = 4.2，2.1 Hz，H-6），3.29（1H，m，H-7），0.67（3H，s，CH3-18），1.00（3H，s，CH3-19），0.93（3H，d，J = 5.8 Hz，CH3-21），3.38（3H，s，OCH3-7）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：36.9（C-1，t），31.6（C-2，t），71.6（C-3，d），42.2（C-4，t），146.3（C-5，s），120.9（C-6，d），74.1（C-7，d），37.3（C-8，d），43.0（C-9，d），37.3（C-10，s），20.9（C-11，t），39.2（C-12，t），42.1（C-13，s），49.2（C-14，d），24.4（C-15，t），28.4（C-16，t），55.6（C-17，d），11.6（C-18，q），18.4（C-19，q），36.2（C-20，d），18.9（C-21，q），34.1（C-22，t），26.1（C-23，t），46.0（C-24，d），29.3（C-25，d），19.0（C-26，q），20.0（C-27，q），23.2（C-28，t），12.0（C-29，q），56.9（OCH3-7，q）。經(jīng)鑒定化合物1為 schleicheol 2（George et al，2000；吳少華等，2008）。

化合物2 白色針狀結(jié)晶，C29H50O，ESI-MS m/z 415 [M+H]+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：3.54（1H，m，H-3），5.37（1H，d，J = 5.0 Hz，H-4），0.70（3H，s，H-18），1.03（3H，s，H-19）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：37.3（C-1，t），31.7（C-2，t），71.6（C-3，d），121.6（C-4，d），141.0（C-5，s），25.8（C-6，t），32.0（C-7，t），31.4（C-8，d），50.3（C-9，d），36.6（C-10，s），21.4（C-11，t），39.8（C-12，t），42.2（C-13，s），56.6（C-14，d），24.4（C-15，t），28.4（C-16，t），55.8（C-17，d），12.1（C-18，q），19.2（C-19，q），36.2（C-20，d），18.9（C-21，q），34.1（C-22，t），26.1（C-23，t），46.0（C-24，d），29.3（C-25，d），19.0（C-26，q），20.0（C-27，q），23.2（C-28，t），12.0（C-29，q）。經(jīng)鑒定化合物2為β-扶桑甾醇（Mishra & Sree，2009）。

化合物3 白色油狀，C20H32O2，ESI-MS m/z 303 [M-H]-，1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：2.27（2H，m，H-1），1.99（2H，m，H-2），5.06（1H，dd，J = 6.8，4.4 Hz，H-3），7.00（1H，s，H-6），2.65（2H，m，H-11），4.18（2H，m，H-15），0.96（3H，d，J = 6.7 Hz，H-16），2.30（3H，s，H-17），2.21（3H，s H-18），1.34（3H，s，H-19），1.27（3H，s，H-20）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：24.0（C-1，t），27.4（C-2，t），77.0（C-3，d），38.5（C-4，s），141.6（C-5，s），125.8（C-6，d），134.1（C-7，s），132.2（C-8，s），138.4（C-9，d），129.8（C-10，s），27.0（C-11，t），36.8（C-12，t），30.2（C-13，d），39.4（C-14，t），61.8（C-15，t），19.8（C-16，q），15.2（C-17，q），29.7（C-18，q），25.5（C-19，q），21.1（C-20，q）。經(jīng)鑒定化合物3為 fregenedadiol（Marcos et al，1996）。

化合物4 黃色針狀結(jié)晶，C18H14O6，ESI-MS m/z 325 [M-H]-。1H-NMR （500 MHz， CDCl3）δ：6.20（1H， s， H-2），6.95（1H， d， J = 9.0 Hz， H-7），7.45（1H，d，J = 9.0 Hz，H-8），5.76（1H，d，J = 10.0 Hz，H-3′），7.04（1H，d，J = 10.0 Hz，H-4′），1.48（6H，s，CH3-5′，6′）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：163.0（C-1，s），99.1（C-2，d），160.0（C-3，s），102.9（C-4，s），132.8（C-5，s），152.7（C-6，s），115.4（C-7，d），116.3（C-8，d），180.8（C-9，s），78.7（C-2′，s），128.1（C-3′，d），113.8（C-4′，d），28.1（C-5′，6′，q），152.1（C-4a，s），146.2（C-4b，s），113.7（C-8a，s），101.5（C-8b，s），經(jīng)鑒定化合物4為異巴西紅厚殼素（金媛媛，2006；張淏，2008；Wu et al，1998）。

化合物5 白色粉末，C22H26O8，ESI-MS m/z 441 [M+Na]+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：6.58（2H，s，H-2，H-6），4.72（1H，d，J = 4.5 Hz，H-7），3.09（1H，m，H-8），4.27（1H，dd，J = 9.0，6.0 Hz，H-9a），3.73（1H，m，H-9b），6.58（1H，s，H-2′），6.58（1H，s，H-6′），4.72（1H，d，J = 4.5 Hz，H-7′），3.09（1H，m，H-8′），4.27（1H，dd，J = 9.0，6.0 Hz，H-9′a），3.73（1H，m，H-9′b），3.89（12H，s，OCH3-3，5，3′，5′）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：133.2（C-1，s），104.4（C-2，d），148.6（C-3，s），136.1（C-4，s），148.6（C-5，s），104.4（C-6，d），86.8（C-7，d），55.3（C-8，d），72.3（C-9，t），133.2（C-1′，s），104.4（C-2′，d），148.6（C-3′，s），136.1（C-4′，s），148.6（C-5′，s），104.4（C-6′，d），86.8（C-7′，d），55.3（C-8′，d），72.3（C-9′，t），56.6（OCH3-3，5，3′，5′，q）。經(jīng)鑒定化合物5為丁香脂素（于洋等，2010）。

化合物6 白色粉末，C22H26O8，ESI-MS m/z 441 [M+Na]+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：6.60（2H，s，H-2，H-6），4.86（1H，d，J = 4.5 Hz，H-7），3.35（2H，m，H-8，H-9a），3.83（1H，m，H-9b），6.66（2H，s，H-2′，H-6′），4.41（1H，d，J = 6.6 Hz，H-7′），2.94（1H，m，H-8′），4.13（1H，d，J = 9.0 Hz，H-9′a），3.83（1H，m，H-9′b），3.85（12H，s，OCH3-3，5，3′，5′）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：129.5（C-1，s），102.5（C-2，d），147.1（C-3，s），133.8（C-4，s），147.1（C-5，s），102.5（C-6，d），82.0（C-7，d），50.2（C-8，d），69.5（C-9，t），132.3（C-1′，s），102.9（C-2′，d），147.3（C-3′，s），134.4（C-4′，s），147.3（C-5′，s），102.9（C-6′，d），88.0（C-7′，d），54.7（C-8′，d），71.1（C-9′，t），56.5（OCH3-3，5，3′，5′，q）。經(jīng)鑒定化合物6為表丁香脂素（叢悅等，2011）。

化合物7 棕色粉末，C20H20O7，ESI-MS m/z 395 [M+Na]+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：3.49（1H，dd，J = 9.2，3.8 Hz，H-1），5.32（1H，d，J = 3.9 Hz，H-2），4.04（1H，dd，J = 9.4，5.7 Hz，H-4a），4.33（1H，dd，J = 9.4，5.7 Hz，H-4b），3.26（1H，m，H-5），5.34（1H，d，J = 3.8 Hz，H-6），3.90（6H，s，OCH3-3′，3′′），5.65（1H，s，OH），5.72（1H，s，OH）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：53.4（C-1，d），83.5（C-2，d），72.8（C-4，t），50.1（C-5，d），84.8（C-6，d），177.1（C-8，s），131.2（C-1′，s），114.5（C-2′，d），146.8（C-3′，s），107.9（C-4′，d），147.1（C-5′，s），114.8（C-6′，d），132.4（C-1′′，s），108.5（C-2′′，d），146.1（C-3′′，s），108.2（C-4′′，d），145.4（C-5′′，s），117.9（C-6′，s），56.1（OCH3-3′，3′′，q）。經(jīng)鑒定化合物7為 graminone A（Liu et al，2013）。

化合物8 淡黃色粉末，C21H26O6，ESI-MS m/z 395 [M+Na]+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：2.83（1H，m，H-1），4.38（1H，d，J = 7.2 Hz，H-2），3.66（1H，m，H-4a），3.14（1H，m，H-4b），3.38（1H，m，H-5），4.84（1H，d，J = 5.5 Hz，H-6），4.10（1H，m，H-8a），3.78（1H，m，H-8b），3.92（3H，s，OCH3-3′），3.93（3H，s，OCH3-3′′），3.94（3H，s，OCH3-4′′），5.59（1H，s，OH）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：53.9（C-1，d），87.1（C-2，d），69.2（C-4，t），49.5（C-5，d），81.4（C-6，d），69.9（C-8，t），132.4（C-1′，s），110.3（C-2′，d），147.6（C-3′，s），145.8（C-4′，s），115.0（C-5′，d），118.7（C-6′，d），131.2（C-1′′，s），109.3（C-2′′，d），148.6（C-3′′，s），147.8（C-4′′，s），111.5（C-5′′，d），117.9（C-6′′，d），55.7（OCH3-3′，q）。經(jīng)鑒定化合物8為 sylvatesmin（彭雙等，2012）。

化合物9 白色油狀，C20H38O2，ESI-MS m/z：333 [M + Na]+，643 [2M + Na]+，并且含有特征的M-CH3OH 的碎片峰，由此可知化合物為脂肪酸甲酯。由13C-NMR數(shù)據(jù) δ 129.9 和 130.1 可知它是一個含-CH=CH-基團的不飽和脂肪酸甲酯。從1H-NMR中的烯質(zhì)子的耦合常數(shù)為 4.6 Hz 可知雙鍵為順式。經(jīng)鑒定化合物9為Z-6-十九烯酸甲酯（曾隴梅等，1990；王冬梅等，2010）。

化合物10 白色粉末，C21H26O6，ESI-MS m/z 279 [M+Na]+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：0.900（3H，t，J = 7.0 Hz）為末端 CH3 質(zhì)子信號，δ 1.64（2H，m），δ 1.28（24H，m）為其他一系列 CH2 質(zhì)子信號，δ 2.38（2H，m）為羧基旁的 CH2 質(zhì)子信號。13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ：14.1 為 CH3 的碳信號，δ 22.7，24.7，29.1，29.2，29.4，29.6，29.7，31.9，34.0等為亞甲基碳信號，δ 179.7 為 COOH 的碳信號。經(jīng)鑒定化合物10為棕櫚酸（十六烷酸）（任冰如等，2009）。

3 生物活性測試

采用MTT法（以DMSO溶劑為陰性對照組和紫杉醇為陽性對照組）將所有的待測樣品分別設(shè)為5個濃度梯度，測定化合物1-10對三株腫瘤細(xì)胞K562、SGC-7901和BEL-7402的細(xì)胞毒活性（Mosmann，1983；吳嬌等，2011）。實驗結(jié)果表明，化合物1和化合物2對人胃癌細(xì)胞SGC-7901有生長具有一定的抑制活性，其IC50值分別為29.2和29.8 mg·mL-1。

4 結(jié)論

本研究從大葉山楝根95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分離鑒定出10個化合物，其中化合物1-4和化合物7-9均為首次從山楝屬植物中分離得到。對化合物1-10的細(xì)胞毒活性測試結(jié)果顯示，化合物1和化合物2對人胃癌細(xì)胞SGC-7901有生長具有一定的抑制活性其IC50值分別為29.2、29.8 μg·mL-1。本研究豐富了大葉山楝的化學(xué)成分與生物活性，為該藥用植物的進一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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