超低溫冷凍對益智種子生理生化特性的影響

曾琳 吳怡 何明軍 顧雅坤 王德立

摘 要：益智（ Alpinia oxyphylla）是我國四大南藥之一，其種子為頑拗性種子，不耐干燥和低溫，無法常規(guī)保存。為解決益智種子長期穩(wěn)定保存的問題，該研究以益智種子為材料，從種子含水量以及冷凍方式方面優(yōu)化益智種子超低溫保存方法，并對比液氮冷凍前后種子發(fā)芽率、α-淀粉酶活性、超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性、脫氫酶活性、丙二醛含量等活力指標(biāo)，分析液氮超低溫冷凍對益智種子生理生化特性的影響。結(jié)果表明：直接液氮冷凍含水量13.92%～14.38%范圍的種子是益智種子超低溫保存的最佳條件。液氮冷凍后，隨著超低溫冷凍時(shí)間的延長，益智種子發(fā)芽率先由76.76%下降至52.5%，再上升至65%，最后下降并穩(wěn)定在50%以上。其種子α-淀粉酶活性先下降后上升，然后又下降，最后上升并穩(wěn)定至冷凍前的水平。丙二醛含量則是先上升后下降，最后趨于平穩(wěn)狀態(tài)。過氧化物酶活性是先下降，然后穩(wěn)定在恒定水平。超氧化物歧化酶活性是隨著冷凍時(shí)間的延長而持續(xù)上升，脫氫酶活性則是持續(xù)下降。以上結(jié)果說明，液氮冷凍時(shí)間對益智活力有一定的影響，但對種子有些性能具有一定的促進(jìn)作用。無論是發(fā)芽率，還是生理生化指標(biāo)，都不同程度表明液氮超低溫保存益智種子是可行的。

關(guān)鍵詞：超低溫保存， 益智種子， 含水量， 生理生化特性， 種子發(fā)芽率

中圖分類號：Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）04-0529-07

Abstract：Alpinia oxyphylla was one of the four famous south medicines in China. Its seeds were the recalcitrant seeds， which could not be preserved in dried and frozen environment， therefore， the seeds of Alpinia oxyphylla could not be reserved by regular way， in low temperature and low humidity conservation. In order to solve the A. oxyphylla seeds with long-term and stability storage， we focused on seed moisture content and freezing manner， cryopreservation method optimization， seed vigor indexes under liquid nitrogen， and the effects of cryopreservation on the physiological and biochemical characteristics. The seed vigor indexes， including germination， activity of α-amylase， SOD， POD， dehydrogenase， MDA. The results showed that the A. oxyphylla seeds with water content of 13.92%-14.38% cryopreservated by rapid freezing could obtain the optimum effect. After liquid nitrogen freezing， the germination rate of the seeds decreased significantly， but with the extension of the freezing time， the germination rate was more than 50%. There was no significant effect on the activity of α-amylase and the content of MDA in liquid nitrogen， a decrease in the dehydrogenase and POD activity of seeds after freezing， and the activity of SOD increased with the adding of freezing time. Above results indicate that freezing time have a certain influence on seeds vigor of A. oxyphylla， but it can promote some performance of seeds. Both in germination rate， and physiological and biochemical indexes， show that A. oxyphylla seeds preserved with liquid nitrogen is feasible.

Key words：cryopreservation， seeds of Alpinia oxyphylla， water content， physiological and biochemical characteristics， seed germination rate

益智（Alpinia oxyphylla）為我國四大南藥之一，隸屬姜科山姜屬植物，多年生草本，以成熟果實(shí)入藥，具有溫脾止瀉攝涎，暖腎縮尿固精之功效，是我國常用藥材（黃國琦，2013）。益智以種子繁殖，其種子壽命較短，含水量降至10%以下很快喪失活力，室溫或4 ℃冰箱貯藏6個月后，其種子活力均降至45%以下（曾琳等，2015），不宜用常規(guī)的低溫低濕法貯藏。根據(jù)益智種子不耐干燥和低溫的貯藏行為，可將益智種子歸屬為頑拗性種子（Roberts，1973）。

與傳統(tǒng)的就地保存和遷地保存法相比，超低溫保存法是長期、穩(wěn)定、有效貯藏頑拗性藥用植物種子的最合適的方法（Roberts，1975），在液氮（-196 ℃）超低溫環(huán)境下，植物種子所有細(xì)胞分裂和代謝活動都幾乎停止、處于相對穩(wěn)定的生物學(xué)狀態(tài)（王晗等，2015）。液氮超低溫保存除了對種子活力和萌發(fā)有影響外，還對生理生化指標(biāo)有影響（Byron et al，2013）。Cejas et al（2013）在菜豆種子超低溫貯藏恢復(fù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超低溫冷凍后的菜豆種子苗酚類物質(zhì)和醛含量增加了，蛋白含量減少了。

研究還發(fā)現(xiàn)，超低溫冷凍后的玉蟬花種子可溶性蛋白含量、過氧化物酶（POD）活性和菊花莖尖超氧化物歧化酶（SOD）活性降低了（宋紅等，2016；程志英，2006），而超低溫冷凍后的菊花莖尖可溶性糖含量、POD活性和花燭胚性細(xì)胞可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、SOD、POD活性以及大苞鞘石斛原球莖可溶性蛋白含量、丙二醛（MDA）含量都增加了（程志英，2006；王更亮，2011；劉曉東等，2013）。所以在對植物種子進(jìn)行超低溫長期儲藏前，應(yīng)該對這些指標(biāo)進(jìn)行檢測。曾琳等（2015）已對益智種子進(jìn)行了液氮超低溫保存實(shí)驗(yàn)探究，并已證明液氮超低溫保存益智種子是可行的。但是，對益智種子超低溫保存后生理生化指標(biāo)是否發(fā)生變化、變化規(guī)律均不明了。

本研究對益智種子超低溫保存方法進(jìn)行優(yōu)化，并測定冷凍前后種子發(fā)芽率、α-淀粉酶活性、脫氫酶活性、超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性和丙二醛含量的變化情況，以期探討超低溫冷凍對益智種子生理生化特性的影響，為益智種質(zhì)資源保護(hù)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟的益智種子采自于海南省五指山水滿鄉(xiāng)水滿新村，由國家南藥基因資源庫提供，其初始含水量為18.64%，初始發(fā)芽率為85%，密封保存于于4 ℃冰箱中備用。

1.2 種子水分測定方法

將種子放于盛有硅膠的干燥器中，根據(jù)初始含水量和預(yù)測干燥速度（河英虎等，2013），分別干燥0、6、10、14、20、24、32 h，獲得含水量為18.64%、16.39%、14.38%、13.92%、12.29%、11.55%和10.36%的實(shí)驗(yàn)種子。根據(jù)國家農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程第六章（GB/T 3543.6）水分測定法，選用低溫[（103±2） ℃]烘干法，烘16 h后，測定種子的含水量。

1.3 種子超低溫冷凍

經(jīng)過干燥的種子，分為四組，一組為對照組，直接發(fā)芽或生理生化實(shí)驗(yàn)；另三組用于液氮冷凍。本實(shí)驗(yàn)采用緩慢冷凍法、快速冷凍法和玻璃化冷凍法對益智種子進(jìn)行超低溫保存實(shí)驗(yàn)，以期獲得益智種子超低溫冷凍最適條件。（1）緩慢冷凍組：將種子放入加有冷凍保護(hù)劑PVS2（室溫）的凍存管中，置于4 ℃冰箱中0.5 h，取出立即放入-20 ℃冰柜中1 h，1 h后迅速投入液氮罐內(nèi)。（2）直接冷凍組：將放有種子的凍存管直接投入液氮冷凍。（3）玻璃化冷凍組：將種子放入加有裝載液LS的凍存管中，室溫處理20 min后，傾倒裝載液，加入冷凍保護(hù)劑PVS2并置于冰上30 min，而后更換成新鮮的預(yù)冷過的PVS2（0 ℃），并迅速投入至液氮罐中保存。冷凍保護(hù)劑（PVS2）為30%甘油+15%乙二醇+15%二甲亞砜+0.4 mol·L-1蔗糖；裝載液（LS）為2 mol·L-1甘油+0.4 mol·L-1蔗糖的MS液體液。

1.4 解凍和發(fā)芽

24 h后取出液氮凍存的種子，40 ℃水浴解凍5 min，后將玻璃化冷凍和緩慢冷凍處理的種子用洗滌液US洗滌3次，每次5 min，再用無菌水洗滌2次，每次10 min。將洗滌后的種子用濾紙吸干表面水分后，轉(zhuǎn)移至發(fā)芽盒培養(yǎng)，置于人工氣候培養(yǎng)箱中（25～30 ℃），保持發(fā)芽盒內(nèi)濾紙表面濕潤，每天檢查并記錄種子的萌發(fā)情況。

1.5 種子生理生化指標(biāo)測定

分別取冷凍0 h、1 d、7 d、30 d、60 d、90 d、180 d、365 d的對照組和最佳冷凍組的種子各50顆，回濕吸脹處理24 h，測定以下指標(biāo)。α-淀粉酶活性測定采用 3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）（王麗娜等，2009）；脫氫酶活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑法（NBT法）（李合生，2000）；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法（張淑珍等，2012）；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法（張慧茹，1999）測定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)益智種子發(fā)芽數(shù)，按公式計(jì)算發(fā)芽率：發(fā)芽率=種子發(fā)芽數(shù)/實(shí)驗(yàn)種子數(shù)×100%。使用SAS 9.3軟件對酶活性及發(fā)芽率等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，利用EXCEL（2016）軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超低溫冷凍對種子發(fā)芽率的影響

由表1可知，未經(jīng)液氮冷凍的益智種子發(fā)芽率隨著含水量的下降而降低，超低溫冷凍后益智種子發(fā)芽率隨含水量的下降而呈先上升后下降趨勢。同一含水量時(shí)，冷凍前的種子發(fā)芽率顯著高于冷凍后的種子發(fā)芽率。這表明益智種子不耐脫水和低溫，按種子貯藏特性劃分，益智種子為頑拗性種子。

不同含水量的種子，直接冷凍組的發(fā)芽率均顯著高于緩慢冷凍組和玻璃化冷凍組。含水量在13.92%～14.38%時(shí)，三個冷凍組的種子發(fā)芽率都高于其他含水量，且直接冷凍組的種子發(fā)芽率均在52%以上。由此表明，含水量13.92%～14.38%是益智種子超低溫保存的最適含水量范圍，直接冷凍法是益智種子超低溫保存的最適冷凍方式。

2.2 超低溫冷凍時(shí)間對種子發(fā)芽率的影響

從理論上來講，植物的種子一旦成功冷凍到-196 ℃，種子在液氮中的保存期就可能無限延長（Sakai et al，1990）。圖1和表2顯示，液氮分別冷凍0 h、1 d、7 d、30 d、60 d、90 d、180 d、365 d后的益智種子發(fā)芽率，隨著超低溫冷凍時(shí)間延長，呈先下降后上升再下降最后趨于平穩(wěn)態(tài)勢。冷凍7 d的益智種子發(fā)芽率較冷凍前急劇下降，冷凍7 d之后種子發(fā)芽率呈緩慢上升趨勢，冷凍90 d后又開始下降，180 d后發(fā)芽率趨于平穩(wěn)。益智種子發(fā)芽率在超低溫冷凍過程中雖有上升下降，但總體看發(fā)芽率均在50%以上。

2.3 超低溫保存對種子生理生化特性的影響

如圖2和表2所示，隨著超低溫保存時(shí)間的延長，益智種子α-淀粉酶活性呈下降、上升又下降、上升趨勢，最后與冷凍前無差異；益智種子丙二醛含量呈先上升后下降最后趨于平穩(wěn)狀態(tài)， 這表明超低溫保存對益智種子可溶性糖和MDA含量影響不大。益智種子SOD活性隨超低溫保存時(shí)間的延長而顯著上升，這表明在液氮冷凍刺激下，種子清除自由基的能力增強(qiáng)了，從而抵制活性氧水平的升高，對抗氧自由基對種子活力造成的損傷。隨著超低溫保存時(shí)間的延長，益智種子POD活性呈先下降后趨于平穩(wěn)態(tài)勢，這說明超低溫冷凍使種子受損，其種子活性氧水平升高，從而使其抗氧化能力減弱，活性下降；90 d后趨于平穩(wěn)，有可能是經(jīng)過液氮冷凍90 d，種子內(nèi)部過氧化物酶活性到了臨界點(diǎn)。種子脫氫酶活性隨著超低溫冷凍時(shí)間的延長而顯著下降，液氮冷凍使得種子催化氧化還原的酶活性降低了。

3 討論與結(jié)論

超低溫保存技術(shù)就是將植物種質(zhì)在液氮溫度下冷凍，使細(xì)胞保持在完全不活動的狀態(tài)。從理論上講，若能建立良好的超低溫保存體系，使植物種質(zhì)經(jīng)液氮冷凍后仍有多數(shù)細(xì)胞能復(fù)活，那么植物種質(zhì)就可無限期地在液氮中貯藏（程志英，2006）。植物種子含水量和超低溫冷凍方式是影響種子超低溫保存體系建立的關(guān)鍵因素。種子含水量無論是過高還是過低，都會給種子帶來嚴(yán)重傷害（曾琳等，2014a）。種子只有在適宜的含水量范圍內(nèi)，采用合適的冷凍方式才能有效進(jìn)行超低溫保存，高良姜種子超低溫冷凍適宜含水量范圍為12.78%～13.58%， 最適冷凍方式為玻璃化冷凍法（曾琳等，2014b）；白木香種子超低溫冷凍適宜適含水量為7.35%，冷凍方式為直接冷凍法（劉軍民等，2007）；降香黃檀種子超低溫冷凍適宜含水量范圍為10.54%～12.35%，冷凍方式為玻璃化冷凍法（曾琳等，2014a）。本研究結(jié)果，益智種子超低溫保存體系為含水量13.92%～14.38%，直接冷凍法。

液氮主要是對種子發(fā)芽率和生理生化指標(biāo)有影響。淀粉酶是種子萌發(fā)初期物質(zhì)能量代謝快速啟動的基本保證，是種子順利萌發(fā)的重要生理基礎(chǔ)，而α-淀粉酶是淀粉酶重要的水解酶（趙玉錦和王臺，2001）。本研究結(jié)果顯示，隨著液氮冷凍時(shí)間的延長，益智種子發(fā)芽率稍有下降，但均在50%以上，且超低溫冷凍對益智種子α-淀粉酶活性影響不大。

SOD、POD和脫氫酶是植物種子重要的保護(hù)酶，為植物細(xì)胞提供高效而專一的活性氧清除體系（錢紅格，2009），其活性與植物種子的超低溫耐性密不可分（宋紅等，2016）。SOD是種子細(xì)胞自由基清除系統(tǒng)中專一清除的抗氧化酶，跟種子抗低溫能力相關(guān)。王更亮（2011）在花燭胚性懸浮細(xì)胞超低溫保存實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，液氮冷凍后的花燭SOD活性提高了，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，說明液氮冷凍增強(qiáng)了種子清除自由基的能力，有助于抵制活性氧水平的升高，從而降低超低溫對種子活力的損傷。POD可為種子萌發(fā)過程中清除細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的毒害，宋紅等（2016）等在對玉蟬花種子進(jìn)行液氮冷凍實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，液氮冷凍后的玉蟬花種子POD活性降低了，而程志英（2006）和王更亮（2011）分別對菊花莖尖和花燭胚性細(xì)胞進(jìn)行超低溫冷凍時(shí)發(fā)現(xiàn)，液氮冷凍使菊花莖尖和花燭胚性細(xì)胞的POD活性提高了。本實(shí)驗(yàn)益智種子POD活性隨著液氮冷凍時(shí)間的延長而有所下降，說明在液氮冷凍刺激下，種子抗氧化能力減弱了。脫氫酶的活性與種子生命活動強(qiáng)弱有著重要相關(guān)性（史鋒厚等，2005），益智種子發(fā)芽率隨著液氮冷凍時(shí)間的延長而有所下降，而種子脫氫酶活性隨著超低溫冷凍時(shí)間的延長顯著下降，說明脫氫酶活性與種子發(fā)芽率呈正相關(guān)。

丙二醛是膜質(zhì)過氧化物產(chǎn)物之一，會抑制細(xì)胞保護(hù)酶的活性，降低抗氧化物的含量（錢紅格，2009；唐祖君和宋明，1999）。劉曉東等（2013）在對大苞鞘石斛原球莖進(jìn)行液氮冷凍處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，液氮超低溫處理使得大苞鞘石斛原球莖MDA的含量升高了。而益智種子經(jīng)液氮冷凍后， MDA含量先是呈上升趨勢，表明超低溫冷凍過程中細(xì)胞膜質(zhì)過氧化作物不斷加重；但凍存90 d后益智種子MDA含量開始下降，直至趨于穩(wěn)定，說明隨著凍存時(shí)間的延長，益智種子細(xì)胞活動已逐漸停止，達(dá)到生態(tài)穩(wěn)定狀態(tài)。

超低溫保存方法成功與否，通常是以液氮處理種子一段時(shí)間后是否還有一定活力來判定的（唐安軍和龍春林，2007）。本研究結(jié)果顯示，液氮冷凍時(shí)間對益智活力有一定的影響，但對種子的有些性能具有一定的促進(jìn)作用。無論是發(fā)芽率，還是生理生化指標(biāo)，都不同程度表明液氮超低溫保存益智種子是可行的。

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