‘章姬’草莓莖段愈傷組織誘導及高頻植株再生體系的建立

張愛麗 王元忠 黃衡宇 李繼祥 馬利娟

摘 要：該研究以‘章姬脫毒苗帶節(jié)匍匐莖段為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，進行單因素預實驗，選取適合‘章姬草莓生長的植物激素種類和質量濃度范圍，進而通過L9（34）正交實驗研究不同植物激素種類及其質量濃度對愈傷組織誘導、叢芽發(fā)生及植株再生的影響。結果表明：采用的3種基本培養(yǎng)基中，B5和1/2MS對抑制培養(yǎng)過程中的褐化現象明顯優(yōu)于MS，而附加20 g·L-1 Na2S2O3在保證材料存活的前提下，大大降低了褐化率；去除褐化的材料在MS + 0.1 mg·L-1 6-BA + 0.05 mg·L-1 2，4-D + 0.1 mg·L-1 NAA中可同步進行愈傷組織誘導和叢芽發(fā)生；叢芽增殖培養(yǎng)基為MS + 0.1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA，30 d后繁殖系數可達12.86；試管苗生根則在1/2MS + 1.0 g·L-1 AC中進行，35 d后可獲得生長健壯的再生植株，生根率92.50%。再生苗移栽成活率在95%以上。該研究建立了‘章姬草莓體外高效快速繁殖體系，對短期內為‘章姬草莓栽培提供大量種性穩(wěn)定、質量優(yōu)良的種苗具有重要意義，同時為其他草莓品種的體外快繁提供了技術參考。

關鍵詞：‘章姬草莓， 匍匐莖， 正交實驗， 褐化， 繁殖系數

中圖分類號：Q943.1， R282.21

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）04-0482-10

Abstract：In order to cultivate an improved variety with higher potential yield and establish an efficient in vitro regeneration system of strawberry ‘Akihim （Fragaria × ananassa）， callus induction and plant regeneration protocol was designed for solve browning problem. A formal L9（34） orthogonal experiment was designed to investigate the browning research in pri-mary culture using explants of creeping stems excised from aseptic seedlings. Based on the improved medium above， single-factor experiments were conducted to select effective plant growth regulators and appropriate concentrations on blank MS medium. A L9（34） orthogonal experiment was designed to study effects of types and concentrations of plant growth regulators on callus induction， adventitious shoot formation， and plant regeneration. The results indicated that MS medium was inferior to B5 and 1/2MS in inhibiting browning condition. The browning rate was dramatically reduced while the callus still survived on the medium with the addition of 20 g·L-1 Na2S2O3. The callus induction and shoot formation of the explants were observed on MS + 0.1 mg· L-1 6-BA + 0.05 mg·L-1 2， 4-D + 0.1 mg·L-1 NAA with effective inhibiting browning. The optimal medium protocol for multiple shoots proliferation was MS + 0.1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA where the proliferation coefficient was 12.86 after 30 d. Healthily regenerated plants were yielded on culture medium 1/2MS + 1.0 g·L-1 AC after 35 d， with a rooting rate of 92.50%. More than 95% of plantlets survived after transplanting into field. The rapid propagation system is helpful to provide homogeneous progeny and high quality seedlings for cultivation of strawberry ‘Akihime as well as a technical reference for other strawberry species in vitro regeneration.

Key words：strawberry ‘Akihime， creeping stem， orthogonal test， browning， propagation coefficient

草莓（Fragaria × ananassa ）為薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria）多年生草本植物，在園藝學上屬于漿果類果樹（雷慶等，2011），現世界各地均有栽培（李邵等，2014）。目前，公認草莓屬20個種分屬5個不同的染色體倍性類型（x=7），即10種二倍體，4種四倍體，1種五倍體，1種六倍體和4種八倍體（陳丙義等，2012；周歷萍等，2015），栽培種則為8倍體（2n=8x=56）（陳丙義等，2012；周歷萍等，2015）。草莓是果樹中鮮果上市最早的水果，素有“早春第一果”的美稱，其果實鮮美、營養(yǎng)豐富，果肉中含有大量的糖類、有機酸、果膠、鞣花酸和花色苷等物質而深受人們喜愛（Wang & Millner， 2009；Josuttis et al， 2010）。我國草莓自然分布有11個種，約占世界草莓屬植物20個種的一半，是世界野生草莓種類最豐富的國家（陳丙義等，2012）。草莓以無性繁殖為主，而長期無性繁殖容易造成病毒在草莓植株體內積累，表現為植株矮化變形，畸形果比例增加，且有花葉、黃邊、斑駁等多種癥狀，致使草莓種性退化，產量逐年降低（金美芳等，2017；廖詠梅等，2006）。利用組織培養(yǎng)技術進行脫毒、快速繁殖是解決草莓這些問題的有效途徑。國外對草莓的組織培養(yǎng)在20世紀七八十年代的報道較多（Adams， 1972；Boxus， 1974）。我國的草莓組織培養(yǎng)研究始于20世紀80年代末，到目前為止在莖尖脫毒培養(yǎng)、葉片培養(yǎng)、莖段培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)等方面的研究報道亦有不少（廖詠梅等，2006；馬崇堅和廖佩穎，2007；朱海生等，2007；王翡等，2010）。盡管對草莓的研究已有很多，但在消除褐化影響、繁殖系數和周期、移栽成活率及較高成本方面仍存在一些問題，使得脫毒組培苗的整體應用仍處于較低水平。

‘章姬草莓是日本育成的早熟品種，為云南省主要栽培品種，該品種生長勢旺盛、、果形美觀、口感佳、風味好，且抗逆性強。金真等（2015）通過對‘章姬草莓莖尖進行不同培養(yǎng)基和外源激素的組合處理，建立了高效的‘章姬草莓莖尖組培快繁體系。肖君澤等（2011）采用花藥組織培養(yǎng)法，進行了‘章姬草莓脫毒苗的快速繁殖。但還未見有關采用帶節(jié)匍匐莖段作為外植體進行‘章姬草莓快繁的報道。本課題組在研究的前期預實驗中發(fā)現，‘章姬草莓脫毒苗帶節(jié)匍匐的莖段，具有很強的脫分化能力。鑒于此，本研究以‘章姬草莓脫毒苗帶節(jié)匍匐莖段為外植體，通過正交實驗建立其高效的體外再生體系，對在短期內為‘章姬草莓推廣栽培提供大量性狀穩(wěn)定、質量優(yōu)良的種苗具有重要意義和價值，同時也可為其他草莓品種的體外快繁提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料由云南省玉溪市祥馨農產品種植基地提供的 ‘章姬（Akihime）脫毒苗，2014年5月選取生長健壯、無病蟲害、當年生匍匐莖第一節(jié)部分為外植體。外植體按地皮消（呂美萍等，2016）的方法進行處理，備用。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 參照李鸝等（2015）的配置方法。基本培養(yǎng)基：MS，B5，1/2MS，根據需要附加不同種類及質量濃度植物激素，蔗糖添加量MS為3%，B5為2%； 瓊脂0.46%， pH值為5.8～6.0。培養(yǎng)基在121 ℃滅菌22 min備用。

抑制褐化培養(yǎng)基：采用L9（34 ） 正交實驗，因素分別為基本培養(yǎng)基、Na2S2O3、VC，其組合見表1。所有組合均附加1.0 g·L-1 AC，7 d轉接，轉接3次后，統(tǒng)計外植體存活率。單因素預實驗培養(yǎng)基：單獨添加不同種類及不同質量濃度植物激素的MS培養(yǎng)基進行單因素預實驗，其中6-BA和2， 4-D質量濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg·L-1； NAA和IBA質量濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、1.5 mg·L-1，20 d后觀察各實驗組生長情況，篩選出適宜的植物激素種類及其質量濃度范圍。愈傷組織誘導、叢芽發(fā)生和增殖培養(yǎng)基：根據單因素預實驗結果，采用L9（34 ） 正交試驗，因素分別為植物激素6-BA、2，4-D、NAA，其組合見表2。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計愈傷組織誘導率、叢芽發(fā)生率和繁殖系數。生根培養(yǎng)基：選取長約3～4 cm、長勢基本一致的不定芽， 接種于附加1.0 g·L-1 AC、且分別添加0、0.1、0.5、1.0 mg·L-1 NAA的1/2MS培養(yǎng)基中進行生根誘導。35 d后統(tǒng)計生根率和根粗壯度。

1.2.2 培養(yǎng)條件 參照李鸝等（2015）中的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)室溫度控制在（22±1）℃，光照度1 500～2 000 lx，光照時間10 h·d-1。

1.2.3 煉苗移栽 煉苗移栽參考文獻（呂美萍等，2016）中所使用的方法。待幼苗長至約6 cm高時，將生根瓶置于室溫下煉苗3 d后，從培養(yǎng)基中取出幼苗，將殘留培養(yǎng)基清洗干凈，移栽至消毒后的沙土基質中保溫保濕培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計幼苗成活率及生長狀況。

1.2.4 統(tǒng)計指標 統(tǒng)計外植體存活率（%）、愈傷組織誘導率（%）、叢芽發(fā)生率（%）、叢芽增殖系數、增殖系數、生根率（%）等指標，參照李鸝等（2015）的計算方法。所得數據利用Excel和SPSS（19.0）軟件進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 啟動培養(yǎng)中的褐化現象及改善措施

‘章姬草莓接種后3 d即出現褐化現象（圖1：A），7 d后褐化加劇，材料逐漸死亡（圖1：B）。抑制褐化正交實驗結果見表3，方差分析見表4。

表3極差分析顯示，基本培養(yǎng)基類型是抑制褐化、保障培養(yǎng)材料存活的關鍵因素；其次是Na2S2O3，這兩個因素的極差值均遠大于空白對照（3.16），而VC的極差值（1.84）小于空白對照（3.16）。表4進一步驗證了基本培養(yǎng)基類型和Na2S2O3對‘章姬草莓莖段培養(yǎng)在抑制褐化、保證材料存活率方面具顯著性差異（P<0.05），VC則無顯著性差異（P>0.05）。通過平均值分析，降低褐化、提高培養(yǎng)材料存活率的最佳組合為A2B1，即B5 +20 g·L-1 Na2S2O3。外植體材料經消毒處理，轉入B5 + 20 g·L-1 Na2S2O3 + 1.0 g·L-1 AC后，間隔7 d進行一次轉接，3次后褐化現象得到明顯改善（圖1：C），且可以保持外植體活力（圖1：D）。

2.2 單因素預實驗和植物激素種類的選擇

單因素實驗結果表明，6-BA和2，4-D均能促進外植體基部產生愈傷組織，尤以0.5～1.0 mg·L-1 6-BA和0.05～0.1 mg·L-1 2，4-D為好。NAA和IBA作用類似，均有利于外植體節(jié)上不定根和葉片的萌發(fā)。

2.3 愈傷組織誘導、叢芽發(fā)生與芽增殖培養(yǎng)

以6-BA、2，4-D和NAA為因素，進行L9（34） 正交試驗，20 d后其愈傷組織誘導率和叢芽發(fā)生率的極差分析結果如表5所示。表5結果顯示，6-BA為‘章姬草莓莖段愈傷組織誘導最主要的影響因子，其次為2，4-D和NAA；3個因子的極差值均大于空白列（1.13），表明在愈傷組織誘導上這3個因素的效應是可靠的。方差分析（表6）表明，6-BA和2，4-D 對誘導愈傷組織有顯著影響（P<0.05），NAA則無顯著影響（P>0.05）。對6-BA和2，4-D 3個水平的Duncan檢驗（表7、8）表明，6-BA在水平1（0.1 mg·L-1）上對愈傷組織誘導率影響最大，與水平2、3均具顯著性差異，其均值明顯高于這兩個水平；而2，4-D則在水平2（0.05 mg·L-1）上對愈傷組織誘導率影響最大，與水平1、3均具顯著性差異，均值亦明顯高于這兩個水平。由平均值分析可知，‘章姬草莓莖段愈傷組織誘導的最佳激素組合為A1B2C2，即0.1 mg·L-1 6-BA + 0.05 mg·L-1 2，4-D + 0.1 mg·L-1 NAA。

表5顯示，對于叢芽發(fā)生6-BA亦為最主要的影響因子。3個因素對叢芽發(fā)生率影響大小依次為6-BA>NAA>2，4-D，由K值大小可以看出，各因素不同水平對叢芽發(fā)生率影響大小的主次順序分別為A1>A2>A3，B2>B1>B3，C2>C3>C1；6-BA和NAA極差均大于空白列（6.66），說明這兩個因素的效應可靠，而2，4-D極差小于空白列，說明其在叢芽發(fā)生率上的效應不可靠。表9顯示，6-BA和NAA對叢芽發(fā)生具顯著性影響（P<0.05），2，4-D則無顯著影響（P>0.05）。表10和表11表明，6-BA在水平1、2（0.1～0.5 mg·L-1）上對叢芽發(fā)生率影響最大，與水平3均具顯著性差異；而NAA則在水平2（0.1 mg·L-1）上對叢芽發(fā)生率影響最大，與水平1、3均具顯著性差異，均值亦明顯高于這兩個水平。由平均值分析可知，‘章姬草莓莖段愈傷組織誘導叢芽發(fā)生的最佳激素組合為A1C2，即0.1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA。

將啟動培養(yǎng)消除褐化后的帶節(jié)莖段接入MS + 6-BA 0.1 mg·L-1 + 0.05 mg·L-1 2，4-D + 0.1 mg·L-1 NAA中，5 d后在其節(jié)部和基部出現愈傷組織，得愈率為98.87%；10 d后愈傷組織增殖迅速，其表面開始出現綠色芽點（圖2：A）；15 d后分化出不定芽叢（圖2：B），叢芽分化率100%；20 d后叢芽分化率可達6.32（圖2：C，D）。

將愈傷組織誘導出的不定叢芽分割為2～3株一叢（圖3：A）， 轉接至MS + 0.1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA中，在愈傷組織增殖、芽叢生長為叢芽的同時，新的芽點不斷出現，培養(yǎng)15 d后叢芽大量繁殖（圖3：B，C）；30 d后可獲得生長健壯的試管苗，其不定芽發(fā)生系數可達12.86（圖3：D）。

2.4 生根培養(yǎng)和煉苗移栽

瓶內生根結果顯示在1/2MS培養(yǎng)基中加入活性炭有利于不定根的誘導， 而添加生長素NAA則不利于試管苗的生長。加入NAA后，不定根變細，葉片兩端向上卷曲，且根韌性下降。實驗表明，適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS + 1.0 g·L-1 AC。試管苗在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后， 基部開始出現不定根（圖4：A）；20 d后可見明顯的根生長量（圖4：B）；35 d后可獲得根系粗壯發(fā)達且生長健壯的生根苗（圖4：C-E），生根率達92.50%。煉苗后移栽至沙土基質中， 30 d后即有新葉長出（圖4：F），成活率達95%以上；45 d后，再生苗生長健壯（圖4：G），此時可移至大棚內下地生長（圖4：H）。

3 討論與結論

3.1 褐化現象及改善措施

‘章姬草莓匍匐莖段外植體在初代培養(yǎng)過程中存在褐化嚴重的問題，本課題組前期在MS培養(yǎng)基中附加不同植物激素的預實驗中，褐化率幾乎是100%，2周內培養(yǎng)物全部死亡。與“豐香”草莓（馬崇堅和廖佩穎，2007）外植體先死亡再褐化的現象不同，‘章姬草莓是外植體先褐化后死亡。因此，控制褐化率是‘章姬草莓體外快繁的關鍵。

褐化是外植體切口附近的細胞受到傷害，細胞膜結構發(fā)生變化，細胞內區(qū)隔化被破壞使多酚物質接觸空氣，在多酚氧化酶（PPO）的作用下被氧化，形成顏色較深的醌類物質所致（代小梅等，2015a，2015b；馮代弟等，2015）。到目前為止，已有相當多的學者對外植體褐化的發(fā)生機理、發(fā)生因素和控制措施等進行了研究，指出外植體類型、外植體生長部位及生理狀態(tài)、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等是產生褐化現象的主要原因，并提出了各自不同的處理措施（劉洋等，2007；段艷欣和郭斌，2009；馬文卿等，2010；夏亞男等，2014；吳玲利等，2015），其中改變基本培養(yǎng)基類型和添加抗氧化劑是抑制褐化現象的重要手段。令人困惑的是，有關草莓組織培養(yǎng)中存在褐化現象的報道不多（牛紅云等，2004；馬崇堅和廖佩穎，2007； Ko et al， 2009），均只提及出現褐化且很容易得到解決。

本研究結果表明，基本培養(yǎng)基類型是‘章姬草莓發(fā)生褐化的主要原因，其次是抗氧化劑的添加。推測培養(yǎng)基中較低水平的無機鹽濃度在‘章姬草莓初代培養(yǎng)中具抑制褐化現象的作用；而抗氧化劑Na2S2O3的添加，則進一步降低了褐化率，與在甜葉懸鉤子中的研究（郭治友等，2009）類似，外植體存活率會隨Na2S2O3濃度的增加而降低，說明抗氧化劑使用濃度過高對外植體會產生一定的毒害作用。研究表明，‘章姬草莓最佳初代培養(yǎng)基為B5 + 20 g·L-1 Na2S2O3，每間隔7 d進行一次轉接，3次后可徹底消除褐化現象，外植體成活率亦可達85%以上。此外，減少外植體在空氣中的裸露時間，做到“現采現用”；轉接時，瓶對瓶，盡量減少外植體與空氣的接觸；在外植體接入培養(yǎng)瓶后，利用酒精燈外焰加熱瓶壁，使瓶內空氣盡可能排除等，均是降低褐化率的有效方法。

值得注意的是，外植體褐化一旦消除，在以后各階段培養(yǎng)過程中，即使不再對培養(yǎng)基進行處理（如更換基本培養(yǎng)基類型或添加抗氧化劑），只要按時轉接均少見褐化。從酶促褐化發(fā)生的機理來看，這個現象是否暗示外植體材料只要能正常脫分化和再分化，在以后的生長過程中就能釋放抑制相關酶產生的物質，從而達到了去除褐化的效果？這一問題值得進一步進行研究。

3.2 外源激素對‘章姬草莓體外快繁的影響

單因素和正交實驗結果表明，6-BA、2，4-D、NAA的配合使用在愈傷組織誘導方面均顯著優(yōu)于單獨使用，表現出極佳的協(xié)同效果。其中6-BA在愈傷組織誘導和芽叢分化上均具顯著性差異，表明6-BA在‘章姬草莓莖段培養(yǎng)中除具促進細胞分裂、促進非分化組織分化的作用外，還具強烈誘導不定芽分化和生長的作用；2，4-D在愈傷組織誘導上具強烈促進作用，但在一定程度上抑制了不定芽的發(fā)生；NAA則在愈傷組織誘導中表現出非常理想的協(xié)同促進效果，而在下一步的叢芽繁殖生長中具顯著性作用。

本研究實現了‘章姬草莓同步進行愈傷組織誘導和叢芽分化，解決了牛紅云等（2004）未能同步誘導愈傷組織和芽叢分化的問題。與前人（牛紅云等，2004；廖詠梅等，2006；馬崇堅和廖佩穎，2007；朱海生等，2007；Ko et al， 2009；王翡等，2010）對草莓其他品種的研究結果不同，在‘章姬草莓的再生體系中，所用植物激素質量濃度水平均較低，而生根培養(yǎng)階段在無植物激素的1/2MS上亦能正常長出大量根系。但是，金真等（2015）在不同培養(yǎng)基和外源激素對‘章姬草莓莖尖培養(yǎng)影響的研究中也發(fā)現，不添加激素的1/2MS+蔗糖培養(yǎng)基不僅能滿足草莓苗生根的要求，且根系粗壯，有利于后期草莓苗的移栽成活。這與本研究結果一致。本研究發(fā)現加入低質量濃度NAA反而抑制了試管苗的生長，與黃衡宇和王美蓉（2014）和李鸝等（2015）研究的一些物種類似。推測‘章姬草莓匍匐莖節(jié)部內源激素水平很低導致對外源激素非常敏感，附加較低濃度的外源激素就能刺激其快速生長；而叢生苗在增殖培養(yǎng)過程中，可將部分外源激素特別是生長素類集積于叢苗基部，甚至部分轉化為內源激素，繼而在無植物激素的培養(yǎng)基中亦能正常生根生長。這說明不同草莓品種、即使是同一品種的不同外植體部位，植物激素的使用也存較大差異，使用的種類和濃度主要取決于不同品種、不同外植體類型的反應。

‘章姬草莓體外快繁的培養(yǎng)周期為25～35 d，在此時間段進行增殖或生根轉接，試管苗生長速度快，且長勢健壯，根系發(fā)達粗壯；超過35 d，培養(yǎng)物基部褐化導致培養(yǎng)物不能正常生長，而且一旦褐化，在以后的培養(yǎng)中很難去除，只能舍棄不用。這說明培養(yǎng)周期也是影響‘章姬草莓體外快繁的重要因素之一。

目前，盡管對草莓的研究已有很多，但在消除褐化影響、繁殖系數和周期、移栽成活率及較高成本方面仍存在很多問題，使得脫毒組培苗的整體應用處于較低水平。本研究解決了草莓組織培養(yǎng)過程中褐化現象嚴重的問題，成功建立了‘章姬品種體外高頻再生體系。以‘章姬脫毒苗匍匐莖段為外植體，在B5 + 20 g·L-1 Na2S2O3中進行抑制褐化處理；將消除褐化后的外植體接入MS + 0.1 mg·L-1 6-BA + 0.05 mg·L-1 2，4-D + 0.1 mg·L-1 NAA中同步進行愈傷組織誘導和叢芽發(fā)生；將愈傷組織誘導出的不定芽叢轉接至MS + 0.1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA中進行增殖培養(yǎng)，30 d一個生長繁殖周期后增殖系數可達12.86；試管苗不定根誘導在1/2MS + 1.0 g·L-1 AC進行，煉苗移栽后可獲得完整植株。對‘章姬草莓離體快速繁殖和種性保持具有重要意義，同時為其他草莓品種的體外快繁提供了技術參考。

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