熱帶念珠菌β—葡聚糖合成酶KRE9基因原核表達(dá)及其比活力測(cè)定

劉政偉 李瑞芳 張瑞玲

摘要：【目的】原核表達(dá)熱帶念珠菌（Candida tropicalis MYA-3404）β-葡聚糖合成酶（KRE9），并進(jìn)行酶比活力測(cè)定，為研究其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能提供參考?！痉椒ā刻崛釒钪榫鶧NA，PCR擴(kuò)增KRE9基因，構(gòu)建其原核表達(dá)載體pET28a-KRE9后轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及組氨酸（His）標(biāo)簽純化樹(shù)脂親和柱純化獲得融合蛋白KRE9，并利用3，5-二硝基水楊酸（DNS）顯色法測(cè)定其比活力?！窘Y(jié)果】克隆獲得的KRE9基因全長(zhǎng)816 bp，編碼271個(gè)氨基酸，與參考基因序列（GenBank登錄號(hào)XM_002547984）的相似性高達(dá)99.75%。將其原核表達(dá)載體pET28a-KRE9轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)及純化獲得重組蛋白KRE9，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其純度較高，大小約35 kD。Western blotting鑒定結(jié)果顯示，重組蛋白KRE9能與抗His抗體發(fā)生特異性結(jié)合。重組蛋白KRE9比活力為9.169×104 U/mg?！窘Y(jié)論】重組蛋白KRE9具有良好的特異性和較高β-葡聚糖合成酶活性，可用于其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究。

關(guān)鍵詞： β-葡聚糖合成酶（KRE9）；熱帶念珠菌；原核表達(dá)；純化；比活力

中圖分類(lèi)號(hào)： S154.39 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）04-0628-07

Gene prokaryotic expression and specific activity determination of β-glucan synthase KRE9 in Candida tropicalis

LIU Zheng-wei， LI Rui-fang*， ZHANG Rui-ling

（College of Biological Engineering， Henan University of Technology， Zhengzhou 450001， China）

Abstract：【Objective】β-glucan synthase KRE9 of Candida tropicalis MYA-3404 was expressed and purified， and its specific activity was analyzed， in order to provide reference for the study on the structure and biological function of β-glucan synthase KRE9. 【Method】The DNA of C. tropicalis was extracted， gene KRE9 was amplified by PCR， and prokaryotic expression vector pET28a-KRE9 was constructed. Competent cell of Escherichia coli BL21（DE3） was transfered.Fusion protein KRE9 was obtained by induction of IPTG as well as histidine（His） tag purificationof resin affinity chromatography， and its specific activity was determined by 3，5-dinitrosalicylic acid（DNS） colorimetricmethod. 【Result】The cloned gene KRE9 was 816 bp in total length， encoding 271 amino acids. The sequencing results showed that gene KRE9 was highly similar to reference genes（GenBank accession number XM_002547984）， which reached 99.75%. The prokaryotic expression vector pET28a-KRE9 was transformed into competent cell of E. coli BL21（DE3）. Then the recombinant protein KRE9 was obtained by induction and purification. SDS-PAGE detection results showed that the recombinant proteins was 35 kDa with high purity.Western blotting identification indicated that there was specific binding between purified recombinant protein KRE9 and His antibody. The specific activity of KRE9 was 9.169×104 U/mg. 【Conclusion】Recombinant protein vegetable proteinis of fine specificity and high β-glucan synthase activity，and it can be used for its structural and biological function research.

Key words： β-glucan synthase（KRE9）； Candida tropicalis； prokaryotic expression； purification； specific activity

0 引言

【研究意義】熱帶念珠菌（Candida tropicalis）在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，通過(guò)葉面噴施可促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)，減少白虱和薊馬侵染，使農(nóng)作物產(chǎn)量明顯增加（Gomaa et al.，2005；Mekki and Ahmed，2005；Amprayn et al.，2012），也可與單胞菌混合降解農(nóng)作物秸稈，為發(fā)酵生產(chǎn)乙醇提供原料（Patle and Lal，2007）。此外，在熱帶念珠菌培養(yǎng)基中加入CuSO4能促進(jìn)其分泌金屬硫蛋白，說(shuō)明其可應(yīng)用于重金屬污染土壤的生物修復(fù)（Radi? et al.，2017）。在熱帶念珠菌細(xì)胞壁合成過(guò)程中需要細(xì)胞壁合成蛋白即β-葡聚糖合成酶（KRE9），其在β-葡聚糖合成、細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育和維持細(xì)胞骨架方面發(fā)揮重要作用（Lesage and Bussey，2006），KRE9缺失會(huì)導(dǎo)致熱帶念珠菌死亡。因此，開(kāi)展熱帶念珠菌KRE9基因表達(dá)及比活力測(cè)定的相關(guān)研究對(duì)揭示KRE9生物學(xué)功能具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，β-葡聚糖合成的相關(guān)基因包括KRE5、BIG1、ROT1、KRE6、SKN1、KRE9和KNH1（Le-sage and Bussey，2006）。其中KRE9基因編碼蛋白是細(xì)胞壁β-葡聚糖的合成途徑中關(guān)鍵催化酶（Lussier et al.，1998）。Mata（2013）研究發(fā)現(xiàn)，KRE9可能與在肝臟內(nèi)皮對(duì)微生物分子如脂多糖或甘露聚糖的促炎反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子IL-1β受體活化有關(guān)。Mostert和Divol（2014）從釀酒酵母發(fā)酵過(guò)程中的蛋白質(zhì)組中分離獲得KRE9蛋白。Weber（2014）發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與KRE9蛋白具有高度同源性的SUP11蛋白，其具有催化合成β-葡聚糖的生物學(xué)功能。張萍等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，Snf1Δ突變株中KRE9基因的表達(dá)量降至野生型的0.49倍，嚴(yán)重影響了酵母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。He等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，KRE9是酵母活性至關(guān)重要的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶（PMT）的作用靶點(diǎn)，KRE9缺失或破壞均會(huì)導(dǎo)致PMT功能喪失，影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。Pan等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，在酵母孢子壁形成過(guò)程中，KRE9對(duì)孢子壁的形成發(fā)揮重要作用。【本研究切入點(diǎn)】目前，雖然已有學(xué)者從基因水平開(kāi)展了KRE9的相關(guān)的研究，但鮮見(jiàn)其原核表達(dá)及酶活性測(cè)定的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以熱帶念珠菌為研究對(duì)象，通過(guò)分子克隆和原核表達(dá)得到KRE9蛋白，并對(duì)進(jìn)行酶比活力測(cè)定，以期為研究其結(jié)構(gòu)和功能提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 菌種與質(zhì)粒 大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、E. coli BL21（DE3）、原核表達(dá)載體pET28a和熱帶念珠菌（C. tropicalis MYA-3404）由河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院9335實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 大腸桿菌培養(yǎng)基LB的配制參照薛正蓮和張珂等（2013）的方法，且加入卡那霉素（Kan），終濃度為10 μg/mL（薛雯雯，2010）；熱帶念珠菌SD培養(yǎng)基的配制參照陸志方（2016）的方法。

1. 1. 3 工具酶和生化試劑 限制性?xún)?nèi)切酶Hind III、BamH I和Protein Marker購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Taq PCR Master Mix和DNA Marker S Plus購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；λDNA/Hind III Marker購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；IPTG和Kan購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1. 1. 4 主要儀器設(shè)備 MG型PCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）、電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、紫外凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）和可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)MALDI-TOF-MS分析結(jié)果，在GenBank上搜索獲得KRE9基因序列（GenBank登錄號(hào)XM_002547984），長(zhǎng)度為816 bp，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物（翟中會(huì)等，2008）。KRE9-F：5'-CTGGATCCATGAGATTCTTT-3'（下劃線為BamH I酶切位點(diǎn)）；KRE9-R：5'-ACAAGCTTTTACTAATCTA

ACCA-3'（下劃線為Hind III酶切位點(diǎn)），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為832 bp。上、下游引物分別稀釋成10 μmol/L備用。

1. 2. 2 DNA提取 參照周小玲等（2004）的方法提取熱帶念珠菌DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?，并?.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1. 2. 3 PCR擴(kuò)增 以熱帶念珠菌DNA為模板，PCR擴(kuò)增KRE9基因。PCR反應(yīng)體系50.0 μL，包括Taq PCR Master Mix 25.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的基因片段，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 4 重組質(zhì)粒pET28a-KRE9構(gòu)建 參照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明從含pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α中提取pET28a質(zhì)粒，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。分別用BamH I和Hind III雙酶切pET28a質(zhì)粒和KRE9基因，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，分別用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行目的條帶回收純化，并將二者用T4 DNA連接酶于16 ℃下過(guò)夜連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。取200.0 μL菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基（含10 μg/mL Kan）上，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，初步篩選出陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆接種于10.0 mL LB液體培養(yǎng)基（含10.0 μg/mL Kan）中，37 ℃下220 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。最后用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切鑒定后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒pET28a-KRE9即為KRE9基因原核表達(dá)載體（圖1）。

1. 2. 5 原核細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá) 參照汪家政和范明（2001）的方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)：將重組質(zhì)粒pET28a-KRE9轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞獲得重組菌株，取100.0 μL菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基（含10 μg/mL Kan）上，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。以含pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）為對(duì)照菌株。

1. 2. 6 SDS-PAGE檢測(cè) 取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，6000 r/min離心5 min收集菌體，用預(yù)冷的無(wú)菌PBS緩沖液清洗菌體3～5次，再用20.0 mL預(yù)冷的無(wú)菌PBS緩沖液重懸菌體，加入苯甲基磺酰氟（PMSF）至其終濃度為1 mmol/L（顧春銀和張震宇，2014），超聲波破碎菌體后，4 ℃下12000 r/min離心10 min，收集上清液和沉淀。取80.0 μL上清液和沉淀分別置于滅菌EP管中，各加入20.0 μL 5×SDS Loading Bu-ffer，100 ℃加熱變性10 min。用16% SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。

1. 2. 7 重組蛋白KRE9純化 重組菌株于20 ℃ 150 r/min培養(yǎng)20 h，收集菌體。菌體用無(wú)菌PBS緩沖液清洗3次，再用無(wú)菌PBS緩沖液重懸，冰浴條件下進(jìn)行超聲波破碎，直至無(wú)明顯菌體，12000 r/min離心20 min，收集上清液。參照Ni-NTA瓊脂糖凝膠（His標(biāo)簽純化樹(shù)脂）6FF說(shuō)明純化重組蛋白KRE9：將收集的上清液加入以5倍體積無(wú)菌PBS緩沖液平衡的His標(biāo)簽純化樹(shù)脂親和柱中，然后用10個(gè)柱體積的Washing Buffer（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑）沖洗層析柱，最后用Elution Buffer（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、250 mmol/L咪唑）洗脫，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在波長(zhǎng)為280 nm處的吸光值，以檢測(cè)收集目的蛋白峰。將含有目的蛋白的洗脫液合并，充分透析后-80 ℃冷凍保存。

1. 2. 8 Western blotting鑒定 將純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，并切下目的條帶，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜上，用3%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Anti-His單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜（魏春紅，2012）。最后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，室溫?fù)u床上孵育1 h后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物顯色試劑盒顯色。

1. 2. 9 重組蛋白酶比活性測(cè)定 參照王衛(wèi)國(guó)（2012）的方法測(cè)定重組蛋白KRE9的比活力：以葡萄糖為酶促反應(yīng)底物，用3，5-二硝基水楊酸（DNS）為顯色劑，測(cè)定KRE9催化合成β-葡聚糖所消耗的葡萄糖量，計(jì)算KRE9比活力。

1. 2. 9. 1 制作葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制濃度為80、160、240、320、400和480 μg/mL的葡萄糖待測(cè)液，分別取2.0 mL加入1.5 mL二硝基水楊酸（DNS）試劑，沸水浴10 min，冷卻后加蒸餾水定容至25.0 mL，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定在540 nm處的吸光值（OD540 nm）。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。最后以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1. 2. 9. 2 KRE9比活力測(cè)定 將6.0 mL葡萄糖溶液25 ℃預(yù)熱10 min后與6.0 mL溶于蒸餾水的重組蛋白KRE9溶液混合，使葡萄糖終濃度為25 mg/mL，KRE9終濃度為10 μg/mL。以100 ℃加熱變性10 min的KRE9溶液為對(duì)照?；旌弦浩骄殖?份，40 ℃下酶促反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)為10、20、30、40、50和60 s，反應(yīng)結(jié)束后立即向酶促反應(yīng)液中加入1.5 mL DNS溶液，沸水浴10 min，冷卻后加蒸餾水定容至25.0 mL，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定在540 nm處的吸光值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定KRE9在合成β-葡聚糖反應(yīng)中單位時(shí)間內(nèi)所消耗的葡萄糖的含量，從而計(jì)算出其比活力（1 mg酶蛋白具有的酶活力單位，X），計(jì)算公式如下：

X（U/mg）=W/（T×M）

其中，W為反應(yīng)消耗的葡萄糖質(zhì)量（μg），T為反應(yīng)時(shí)間（min），M為待測(cè)樣品質(zhì)量（mg），U為1 min消耗1 μg葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2. 1 KRE9基因原核表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果

提取的熱帶念珠菌DNA用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，約在20 kb處有一條明亮條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。以KRE9-F/KRE9-R為引物，熱帶念珠菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約800 bp的條帶，與預(yù)期長(zhǎng)度相符（圖2）。將目的片段連接至pET28a載體，并用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，雙酶切產(chǎn)物中小片段長(zhǎng)度約800 bp的條帶，與KRE9基因長(zhǎng)度基本一致（圖2），說(shuō)明KRE9基因已成功連接至pET28a載體上。

將雙酶切鑒定呈陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN多序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增獲得的KRE9基因長(zhǎng)度為816 bp，編碼271個(gè)氨基酸，與其參考基因序列（GenBank登錄號(hào)XM_002547984）相似性高達(dá)99.75%（圖3），說(shuō)明成功構(gòu)建了KRE9基因的原核表達(dá)載體pET28a-KRE9，可用于蛋白誘導(dǎo)表達(dá)分析。

2. 2 KRE9基因原核表達(dá)及純化結(jié)果

重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示，與對(duì)照菌株的裂解上清液和沉淀相比，重組菌株的裂解上清液和沉淀中含一條特異性目的蛋白條帶，約35 kD，與預(yù)期結(jié)果相符，表明其可能是融合蛋白KRE9（圖4）。利用His標(biāo)簽純化樹(shù)脂親和柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化獲得的蛋白條帶清晰、單一，純度較高，大小約35 kD，與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明已成功誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合蛋白KRE9，純化效果較好。

2. 3 Western blotting鑒定結(jié)果

利用抗His-tag抗體對(duì)純化后的融合蛋白KRE9進(jìn)行Western blotting檢測(cè)分析，結(jié)果顯示在35 kD處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶（圖5），說(shuō)明融合蛋白KRE9能與抗His-tag抗體發(fā)生特異性結(jié)合，該特異條帶為His標(biāo)簽融合蛋白KRE9。

2. 4 融合蛋白KRE9比活性測(cè)定結(jié)果

以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。線性回歸方程為y=0.0011x-0.0229，相關(guān)系數(shù)R?=0.994，說(shuō)明相關(guān)性較好，可作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

融合蛋白KRE9比活力測(cè)定結(jié)果如圖7所示。在葡萄糖溶液中加入融合蛋白KRE9后，0～40 s酶促反應(yīng)速度較快，葡萄糖含量明顯減少，40 s后進(jìn)入反應(yīng)平緩期，60 s時(shí)反應(yīng)結(jié)束。結(jié)合葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)比活力計(jì)算公式得出KRE9比活力為9.169×104 U/mg，表明誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白KRE9有較高的酶活性。

3 討論

本研究利用PCR擴(kuò)增獲得KRE9基因，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體pET28a-KRE9，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21（DE3）后，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及His標(biāo)簽純化樹(shù)脂純化成功獲得融合蛋白KRE9，但SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示其多數(shù)以包涵體存在，少數(shù)為可溶性蛋白。為了實(shí)現(xiàn)融合蛋白KRE9可溶性表達(dá)，本研究預(yù)先優(yōu)化了誘導(dǎo)溫度、時(shí)間及IPTG濃度，雖然對(duì)其表達(dá)形式有明顯改善，但仍未獲得大量可溶性蛋白，可能是在優(yōu)化條件下部分表達(dá)宿主不表達(dá)或表達(dá)過(guò)低導(dǎo)致表達(dá)目的蛋白總量減少，與關(guān)波（2014）、王靖瑤等（2014）研究結(jié)論相似，也可能是KRE9參與了細(xì)胞壁的合成，影響表達(dá)宿主的生理代謝活動(dòng)，從而導(dǎo)致其表達(dá)量減少。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，傳統(tǒng)測(cè)定KRE9活力的方法是以放射性的二磷酸尿苷（Uridine diphosphate，UDP）-[14C]葡萄糖為底物，通過(guò)檢測(cè)UDP-[14C]葡萄糖放射活性的變化來(lái)確定酶活力（李鵬，2012）。而本研究中測(cè)定KRE9活力的方法無(wú)需使用含有放射性的葡萄糖，不僅安全性高，而且靈敏度強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單快捷。另外，本研究根據(jù)KRE9蛋白合成β-葡聚糖的功能，參照王衛(wèi)國(guó)（2012）的方法，檢測(cè)到純化的重組蛋白KRE9具有較高的酶活性。該方法與趙麗洋（2006）通過(guò)制備KRE9蛋白單克隆抗體檢測(cè)KRE9蛋白活性的原理和操作完全不同。二者相比，本研究的方法具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、耗時(shí)少的特點(diǎn)。

4 結(jié)論

采用原核表達(dá)成功獲得高純度的重組蛋白KRE9，純化的KRE9蛋白具有良好的生物學(xué)活性，可促進(jìn)葡萄糖合成β-葡聚糖，為進(jìn)一步研究其在熱帶念珠菌生長(zhǎng)過(guò)程中所發(fā)揮作用提供參考。

參考文獻(xiàn)：

顧春銀，張震宇. 2014. 利用蛋白標(biāo)簽純化釀酒酵母RAVE-V1復(fù)合物[J]. 生物加工過(guò)程，12（5）：34-38. [Gu C Y，Zhang Z Y. 2014. Purification of RAVE-V1 complex from Sa-ccharomyces cerevisiae via protein tagging[J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering，12（5）：34-38.]

關(guān)波. 2014. 改良人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中分泌表達(dá)的研究[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué). [Guan B. 2014. Improvement of secretory expression of human serum albumin fusion protein in Pichia pastoris[D]. Wuxi：Jiangnan University.]

李鵬. 2012. 灰樹(shù)花β-葡聚糖合成酶的提取、純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 鄭州：河南工業(yè)大學(xué). [Li P. 2012. Extraction， purification and characterization of Grifola frondosa β-glucan synthase[D]. Zhengzhou：Henan University of Technology.]

陸志方. 2016. 固相合成抗菌肽CGA-N46及其衍生物生物信息學(xué)分析和生物活性研究[D]. 鄭州：河南工業(yè)大學(xué). [Lu Z F. 2016. Study of solid phase synthesis of antifungal peptide CGA-N46 and its derivatives of bioinforma-tics analysis and biological activity[D]. Zhengzhou：Henan University of Technology.]

汪家政，范明. 2001. 蛋白技術(shù)手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)技術(shù)出版社. [Wang J Z，F(xiàn)an M. 2001. Handbook of Protein Technology[M]. Beijing：Science and Technology Press.]

王靖瑤，王天女，盧磊，張帥，趙敏. 2014. 大腸桿菌I型分泌表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展及提高蛋白表達(dá)量的策略[J]. 中國(guó)生物工程雜志，34（6）：98-104. [Wang J Y，Wang T N，Lu L，Zhang S，Zhao M. 2014. Research advances in secretary production of recombinant protein using Escherichia coli type I secretion systen and strategies for enhancement of secretion of type I pathway[J]. Journal of Chinese Biotechnology，34（6）：98-104.]

王衛(wèi)國(guó). 2012. 一種測(cè)定β-葡聚糖合成酶活力的方法：102443621B[P]. 2012-05-09. [Wang W G. 2012. Method for detecting activity of β-glucan synthase：102443621B[P]. 2012-05-09.]

魏春紅. 2012. 現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社. [Wei C H. 2012. Experiment Technology for Modern Molecular Biology[M]. Beijing：Higher Education Press.]

薛雯雯. 2010. CGA-N46基因在枯草芽孢桿菌中的多順?lè)醋颖磉_(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化[D]. 鄭州：河南工業(yè)大學(xué). [Xue W W. 2010. Polycistronic expression of CGA-N46 gene in Bacillus subtilis and its fermentation optimization[D]. Zhengzhou：Henan University of Technology.]

薛正蓮， 張珂. 2013. 表達(dá)重組谷氨酸脫羧酶工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志，26（1）：100-104. [Xue Z L，Zhang K. 2013. Optimization of fermentation condition of recombinant E. coli for expression of glutamate decarboxylase[J]. Chinese Journal of Biologicals，26（1）：100-104.]

趙麗洋. 2006. 白色念珠菌β-1，3-葡聚糖合成酶抑制劑篩選模型的建立及研究 白色念珠菌β-1，3-葡聚糖合成酶調(diào)節(jié)亞基CaRho的克隆表達(dá)[D]. 北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué). [Zhao L P. 2006. Establishment and study of a screening model for β-1，3-glucan synthetase inhibitors of Candida albicans Cloning and expression of the regulatory subunit CaRho of Candida albicans β-1，3-glucan synthase[D]. Beijing：Peking Union Medical College.]

翟中會(huì)，陳希南，王娟. 2008. 利用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[J]. 西北醫(yī)學(xué)教育，16（4）：695-698. [Zhai Z H，Chen X N，Wang J. 2008. Primer design with primer premier 5.0[J]. Northwestern Medical Education，16（4）：695-698.]

張萍，趙強(qiáng)，魏東盛，楊嬌，朱項(xiàng)陽(yáng)，朱旭東. 2016. 釀酒酵母Snf1/AMPK蛋白激酶通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的表達(dá)影響細(xì)胞壁完整性[J]. 微生物學(xué)報(bào)，56（7）：1132-1140. [Zhang P，Zhao Q，Wei D S，Yang J，Zhu X Y，Zhu X D. 2016. Snf1/AMPK affects cell wall integrity through regulating the transcription of cell wall as sembly-related genes in Saccharomyces cerevisiae[J]. Microbiology China，56（7）：1132-1140.]

周小玲，沈微，饒志明，王正祥，諸葛健. 2004. 一種快速提取真菌染色體DNA的方法[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，31（4）：89-92. [Zhou X L，Shen W，Rao Z M，Wang Z X，Zhuge J. 2004. A rapid method for preparation of fungal chromosome DNA[J]. Microbiology China，31（4）：89-92.]

Amprayn K，Rose M T，Kecskés M，Pereg L，Nguyen H T，Kennedy I R. 2012. Plant growth promoting characteristics of soil yeast（Candida tropicalis HY） and its effectiveness for promoting rice growth[J]. Applied Soil Eco-logy，61（5）：295-299.

Douglas C M，Marrinan J A，Li W，Kurtz M B. 1994. A Saccharomyces cerevisiae mutant with echinocandin-resistant 1，3-beta-D-glucan synthase[J]. Journal of Bacteriology，176（18）：5686-5696.

Gomaa A M，Moawad S S，Ebadah I M A，Salim H A. 2005. Application of bio-organic farming and its influence on certain pests infestion，growth and productivity of potato plants[J]. Research Journal of Applied Sciences，1（2）：2005-2211.

He Z，Luo L，Keyhani N O，Yu X，Ying S，Zhang Y. 2017. The C-terminal MIR-containing region in the Pmt1 O-mannosyltransferase restrains sporulation and is dispen-sable for virulence in Beauveria bassiana[J]. Applied Microbiology & Biotechnology，101（3）：1143-1161.

Lesage G，Bussey H. 2006. Cell wall assembly in Saccharomyces cerevisiae[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，70（2）：317-343.

Lussier M，Sdicu A M，Shahinian S，Bussey H. 1998. The Candida albicans KRE9 gene is required for cell wall β-1，6-glucan synthesis and is essential for growth on glucose[J]. Proceedings of the National Academy of Scien-ces of the United States of America，95（17）：9825-9830.

Mata D C. 2013. Producción de la proteína recombinante Kre9 del hongo patógeno Candida albicans con actividad proinflamatoria y protumoral[D]. Spain：Universidad del País Vasco.

Mekki B B，Ahmed A G. 2005. Growth，yield and seed quality of soybean（Glycine max L） as affected by organic，biofertilizer and yeast application[J]. Research Journal of Agriculture & Biological Sciences，1（4）：320-324.

Mostert T T，Divol B. 2014. Investigating the proteins released by yeasts in synthetic wine fermentations[J]. International Journal of Food Microbiology，171（5）：108-118.

Pan H P，Wang N，Tachikawa H，Nakanishi H，Gao X D. 2017. β-1，6-glucan synthesis-associated genes are required for proper spore wall formation in Saccharomyces cerevisiae： Yeast spore wall and β-1，6-glucan[J]. Yeast，doi： 10.1002/yea.3244.

Patle S，Lal B. 2007. Ethanol production from hydrolysed agricultural wastes using mixed culture of Zymomonas mobilis and candida tropicalis[J]. Biotechnology Letters，29（12）：1839-1843.

Puppala K R，Naik T，Shaik A，Dastager S，Ravi K V，Khire J，Dharne M. 2018. Evaluation of Candida tropicalis（NCIM 3321） extracellular phytase having plant growth promo-ting potential and process development[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，13：225-235.

Radi? D S，Pavlovi? V P，Lazovi? M M，Jovi?i?-Petrovi? J P，Karli?i? V M，Lalevi? B T，Rai?evi? V B. 2017. Copper-tolerant yeasts：Raman spectroscopy in determination of bioaccumulation mechanism[J]. Environmental Science & Pollution Research，24（27）：21885-21893.

Weber L. 2014. Characterization of Schizosachharomyces po-

mbe Sup11p， a protein involved in beta-1，6-glucan bio

synthesis[D]. Heidelberg：Ruperto-Carola University of

Heidelberg.

（責(zé)任編輯 陳 燕）