美國(guó)西部不同地區(qū)Grayia spinosa核DNA ITS序列分析

成彩霞 蘇雪 高婷 周璇

摘 要：藜科植物Grayia spinosa是美國(guó)西部地區(qū)的特有種，多生長(zhǎng)在干旱鹽堿地，具有重要的生態(tài)價(jià)值。該研究測(cè)定了采自美國(guó)西部猶他州G. spinosa 的nrDNA ITS序列，與GenBank中已提交的G. spinosa 的所有ITS序列以及G. spinosa的四個(gè)近緣種作為外類群進(jìn)行比較，分析了美國(guó)西部不同地區(qū)G. spinosa ITS序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)與其RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變異規(guī)律。結(jié)果表明：所有G. spinosa樣品的nrDNA ITS序列長(zhǎng)度在611～623 bp之間，GC含量在60.35%～61.0%之間，序列間共存在22個(gè)變異位點(diǎn)，5個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。各樣品間的遺傳距離在0.001 8～0.008 9之間，不同樣品間的遺傳距離與地理距離的相關(guān)性不顯著。鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示所有G. spinosa聚為一大支，與外類群形成明顯分支。此外，利用RNAfold在線軟件預(yù)測(cè)了G. spinosa ITS序列的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，將8個(gè)G. spinosa 樣品的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)根據(jù)構(gòu)型差異大體上分為四類，分別記為type A，B，C和D四類，主要變異出現(xiàn)在ITS1和ITS2區(qū)。所不同的是在G. spinosa ITS的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析中GSNE1與GSWA8體現(xiàn)出更近的親緣關(guān)系，但二者的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)差異明顯，同時(shí)GSNE2、GSUT3、GSUT4、GSCA5、GSCA6、GSCO7在ITS序列一級(jí)結(jié)構(gòu)分析中也體現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，但是他們的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)差異明顯。這可能與ITS序列的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中體現(xiàn)出更大的保守性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：Grayia spinosa，ITS 序列變異，二級(jí)結(jié)構(gòu)，藜科

中圖分類號(hào)：Q949.745.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2018）05-0617-09

Abstract：Grayia spinosa，a species endemic to the Western United States，is mainly distributed in arid and saline areas and has important ecological value. ITS sequence of G. spinosa collected from Utah State of the United States was sequenced，and aligned with other sequences from GenBank of this species by Blast. The relationship among G. spinosa from the West United States were analyzed based on ITS sequences and four related species of Grayia were selected as outgroup. ITS sequence variation of G. spinosa and its RNA secondary structure was analyzed in different regions of the United States. The results showed that the length of ITS sequences ranged from 611 bp to 623 bp and the GC contents was 60.35%-61.0%. There were 22 variants sites and five parsimony informative sites in the ITS sequences of G. spinosa from different regions in the United States. Genetic distance ranged from 0.001 8 to 0.008 9 between samples，the correlation was not significant between genetic distances and geographical distances of different samples. The phylogenetic tree constructed by Neighbor-joining method indicated that all samples of G. spinosa were clustered together，forming a distinct branch with the outer group. In addition，the RNA secondary structure of G. spinosa ITS sequence was predicted by RNA fold online software. The RNA secondary structure of G. spinosa samples were roughly divided into four types according to the configuration differences，which were named type A，B，C and D. Unlike the primary structure analysis of G. spinosa ITS sequences，RNA secondary structure did not reflect the more related phylogenetic relationships between GSNE1 and GSWA8. GSUT3，GSUT4，GSCA5，GSCA6 and GSCO7 indicated closer phylogenetic relationships in the primary structure analysis of ITS sequences，but their RNA secondary structures were significantly different，which was related to the higher conservation of RNA secondary structure.

Key words：Grayia spinosa，ITS sequence variation，secondary structure，Chenopodiaceae

藜科植物是被子植物的大科之一，是干旱、荒漠生態(tài)環(huán)境中的主要植物類群，全球共有130 屬，約1 500種。我國(guó)的藜科植物資源相當(dāng)豐富，尤其是在以干旱、鹽堿土為主的西北部大面積生態(tài)脆弱區(qū)，藜科植物成為其植被的最重要構(gòu)成部分之一，具有十分重要的生態(tài)維持與建設(shè)價(jià)值。參考中國(guó)植物志英文版發(fā)現(xiàn)，豬毛菜屬、鹽爪爪屬、堿蓬屬等為我國(guó)西北地區(qū)的主要藜科植物，這些類群大多為草本，植株低矮、葉片較小，花很小無(wú)觀賞性，生長(zhǎng)于農(nóng)田周?chē)虺鞘芯G化區(qū)域，而且多以雜草對(duì)待。Grayia spinosa為藜科中少有的灌木，植物體較大，壽命長(zhǎng)，花被紅色、大而鮮艷，不同于大多數(shù)藜科植物，具有一定的觀賞價(jià)值。此外，G. spinosa耐干旱、鹽堿及貧瘠的能力極強(qiáng)，是植被恢復(fù)重建的極好材料，但僅分布于北美，美國(guó)西部是它最重要的分布區(qū)。

近年來(lái)，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展，DNA序列分析被廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)育分析和遺傳多樣性研究。與此同時(shí)，由這些分子標(biāo)記所揭示的DNA等生物大分子的變異式樣及特征成為了研究了解一個(gè)物種的最為基本和重要的環(huán)節(jié)，并為進(jìn)一步的科學(xué)研究提供基礎(chǔ)。核DNA ITS序列是介于18S至26S之間的非編碼內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包含一個(gè)5.8S編碼區(qū)，由于ITS序列在進(jìn)化過(guò)程中受到的選擇壓力小且進(jìn)化速率較快等特點(diǎn)，被廣泛用于屬及種水平等較低分類階元親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化研究（Jaehav & Shama，2014；Liang & Wu，2017；Guo et al，2016）。近年來(lái)，ITS序列也開(kāi)始應(yīng)用于種內(nèi)系統(tǒng)關(guān)系的研究和藥用植物真?zhèn)纹疯b定等方面（蔣玲艷和郭志剛，2009；Chen et al，2010；Khan et al，2014）。同時(shí)，ITS序列雖然在部分區(qū)域出現(xiàn)較高的突變率，卻可能會(huì)通過(guò)堿基補(bǔ)償替換等方式抵消這些位點(diǎn)的突變對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的干擾，使得在進(jìn)化過(guò)程中其RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)體現(xiàn)出更大的保守性。因此，本研究通過(guò)對(duì)美國(guó)西部不同地區(qū)G. spinosa的ITS序列一級(jí)結(jié)構(gòu)及其RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，以期了解以下問(wèn)題：（1）不同G. spinosa樣品 ITS序列的變異規(guī)律。（2）G. spinosa ITS一級(jí)結(jié)構(gòu)與其RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化是否一致？

1 材料

鑒于該研究的主要目的是探討G. spinosa分布范圍內(nèi)不同區(qū)域ITS序列的變異樣式，取樣地點(diǎn)的選擇以涵蓋其主要分布區(qū)為準(zhǔn)，并且在每個(gè)地區(qū)盡可能取2～3個(gè)不同地點(diǎn)的材料，凡NCBI已有記錄的樣點(diǎn)不再另行采樣而直接下載其序列的相關(guān)信息（包括分布在科羅拉多、加利福尼亞、內(nèi)華達(dá)、華盛頓和猶他州等G. spinosa主要分布區(qū)的所有G. spinosa ITS序列共7個(gè)樣品）。樣品GSUT4由朱格麟教授采自猶他州一野外居群，葉片干燥后測(cè)序。另外，選擇與G. spinosa親緣關(guān)系較近的G. brandegeei、Holmbergia tweedii、Atriplex joaquinana和Chenopodium fremontii為外類群，它們的來(lái)源、產(chǎn)地和序列登錄號(hào)見(jiàn)表1。

2 方法

2.1 基因組DNA的提取

對(duì)采自猶他州的G. spinosa樣品用變色硅膠干燥儲(chǔ)藏，帶回實(shí)驗(yàn)室后采用改良的CTAB法（Doyle，1987）提取基因組總DNA。

2.2 ITS序列的PCR擴(kuò)增

采用ITS通用引物，即ITS1（5′AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GC 3′）和 ITS4（5′TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3′）。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，其中PCR Mix（寶生物公司）10 μL，上下游引物（20 μmol·L-1）及DNA模板各1μL，加ddH2O 至 20 μL 。擴(kuò)增程序：（1）70 ℃預(yù)變性4 min；（2）94 ℃變性1 min，退火溫度52 ℃，退火1 min；（3）72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；（4）保持72 ℃ 4 min；（5）4 ℃保存PCR產(chǎn)物。

2.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)與測(cè)序

PCR產(chǎn)物在經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、EB（溴化乙錠）染色、在紫外燈檢測(cè)后，送蘇州金唯智公司進(jìn)行測(cè)序（為雙向測(cè)序，結(jié)果進(jìn)行互相驗(yàn)證）。

2.4 數(shù)據(jù)處理

利用NCBI中的Blast進(jìn)行序列比對(duì)，并選擇與G. spinosa親緣關(guān)系近的四個(gè)種作為外類群。用DNAstar軟件包中的EditSeq計(jì)算ITS序列長(zhǎng)度與GC含量，用DNAman計(jì)算遺傳距離，R軟件包vegan做Mantel檢驗(yàn)。用Mage6.0計(jì)算變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（利用1 000次重復(fù)的自展分析檢驗(yàn)各分支的置信度）。利用RNAfold（RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)軟件，http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）預(yù)測(cè)G. spinosa的 ITS序列的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，該軟件采用最小自由能原理，參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

利用1.5%的瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖1。ITS序列條帶清晰，與DL2000 bp的DNA Marker比對(duì)后長(zhǎng)度在500～750 bp，符合ITS序列的長(zhǎng)度范圍。

3.2 不同樣品ITS序列比較

對(duì)8個(gè)G. spinosa樣品進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，除GSCA6的ITS序列不完整（575 bp）外，其余來(lái)自不同地區(qū)的7個(gè)G. spinosa 樣品ITS區(qū)（包括ITS1、5.8S和ITS2序列）長(zhǎng)度范圍為 611～623 bp，長(zhǎng)度變化12 bp。其中各樣品ITS1區(qū)長(zhǎng)度除GSNE1為223 bp外其他均為222 bp，長(zhǎng)度變化不大。多數(shù)樣品5.8S區(qū)的長(zhǎng)度為164 bp，僅GSWA8出現(xiàn)了3個(gè)堿基的缺失。美國(guó)西部不同地區(qū)G. spinosa ITS2區(qū)的變化范圍在225～237 bp之間，但GSCA6的ITS2區(qū)長(zhǎng)度僅為189 bp。ITS序列的GC含量為60.35%～61.0%，ITS1與ITS2的GC量相近且較5.8S高（表 2）。ITS區(qū)全序列排列后長(zhǎng)度為623 bp，共22個(gè)變異位點(diǎn)，5個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，其中ITS1區(qū)含5個(gè)變異位點(diǎn)，位點(diǎn)79、103、113為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，位點(diǎn)88為堿基G顛換為堿基T，且包含有一個(gè)簡(jiǎn)并堿基，位點(diǎn)111為堿基C轉(zhuǎn)換為堿基T。 5.8S區(qū)含3個(gè)變異位點(diǎn)，無(wú)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，其中位點(diǎn)223、248為堿基C轉(zhuǎn)換為T(mén)，位點(diǎn)266為堿基G轉(zhuǎn)換為堿基C。ITS2區(qū)有14個(gè)變異位點(diǎn)，其中除位點(diǎn)425、616為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)外，其余均為變異位點(diǎn)，其中位點(diǎn)563、590、601、614、615為堿基G-C之間的轉(zhuǎn)換，位點(diǎn)613為堿基T顛換為堿基G，448為堿基C顛換為堿基T，位點(diǎn)600出現(xiàn)了堿基G-C間的轉(zhuǎn)換以及堿基G-T間的顛換。位點(diǎn)542、622為堿基G-A間的顛換，位點(diǎn)617為堿基A顛換為堿基C，位點(diǎn)621為堿基C顛換為堿基A。表3結(jié)果表明，各樣品間的長(zhǎng)度變化主要出現(xiàn)在ITS2區(qū)。GC含量ITS2區(qū)較高，ITS1區(qū)次之，5.8S區(qū)較低。此外，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)ITS1區(qū)較ITS2區(qū)多一個(gè)，而就變異位點(diǎn)而言，ITS2區(qū)變異位點(diǎn)較ITS1區(qū)多，5.8S區(qū)除個(gè)別樣品可能存在有變異位點(diǎn)外，其他位點(diǎn)均未出現(xiàn)變異。因此，ITS序列的主要變異也出現(xiàn)在ITS2區(qū)。G. spinosa的ITS序列堿基的主要變化是堿基的缺失，堿基的轉(zhuǎn)換主要出現(xiàn)在G-C間，堿基的顛換主要出現(xiàn)在G-T間，而與分布區(qū)間并沒(méi)有表現(xiàn)出相關(guān)聯(lián)系。整個(gè)ITS區(qū)變異位點(diǎn)與簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)分別占總位點(diǎn)的3.53%和0.80%。

3.3 樣品間遺傳距離分析

G.spinosa各樣品間的遺傳距離在0.0 018～0.008 9之間（表4），其中GSNE1與GSWA8、GSNE2與GSUT4、GSUT3與GSUT4、GSUT4與GSCA5、GSUT4與GSCA6間的遺傳距離最小均為0.001 8。GSCO7與GSWA8 間的遺傳距離最大，為0.008 9。外類群與G. spinosa各樣品間的遺傳距離均較G. spinosa各樣品間的遺傳距離大，在0.010 7～0.081 5之間。GSNE1與GBCO9間的遺傳距離相對(duì)較小，為0.010 7，GSWA8與CFCA12間的遺傳距離最大為0.081 5。對(duì)不同產(chǎn)地G. spinosa地理距離和遺傳距離的Mantel檢驗(yàn)表明，來(lái)自不同地區(qū)G. spinosa各樣品間的遺傳距離與地理距離的相關(guān)性不顯著（R2=0.325，P=0.359）。

3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2，各分支的支持率均達(dá)到50以上。8個(gè)G. spinosa樣品聚為一支，支持率為93，并與同屬的GBCO9為姊妹群關(guān)系。其中，GSUT3，GSUT4，GSCA5，GSCA6，GSCO7與GSNE2聚為一支，GSNE1與GSWA8聚為一支，但均分布于內(nèi)華達(dá)地區(qū)的GSNE1與GSNE2卻分屬于這兩支。由此可見(jiàn)，分布在同一地區(qū)的G. spinosa并未表現(xiàn)出更近的親緣關(guān)系。

由于GSCA6未提交完整ITS2序列，且GSCO7與GSWA8（GSCO7和GSWA8的5.8S區(qū)出現(xiàn)了堿基的缺失與轉(zhuǎn)換）可能存在假基因，因此我們僅以ITS1區(qū)序列重新構(gòu)建了鄰接樹(shù)（圖3）。結(jié)果與基于ITS全序列構(gòu)建的鄰接樹(shù)的分支結(jié)構(gòu)相同，不同僅表現(xiàn)在支持率較低、分支長(zhǎng)度較短。

3.5 ITS序列RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線軟件RNAfold對(duì)美國(guó)西部不同分布區(qū)G. spinosa ITS的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)（圖4）。ITS1區(qū)與ITS2區(qū)均含有封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，8個(gè)G. spinosa ITS序列的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)依它們的相似狀況大體上可以分為四類，分別記為type A，B，C和D。GSNE1、GSNE2與GSUT3三者的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象相似記為type A。

RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象相似的GSUT4和GSCA6記為type B，他們?cè)?.8S區(qū)與ITS2區(qū)均出現(xiàn)了差異，且GSCA6的最小自由能更低，推測(cè)與GSCA6 ITS序列的缺失有關(guān)。GSCA5與GSWA8（type C）的構(gòu)象相似，主要差異出現(xiàn)在ITS1區(qū)，由于GSWA8的最小自由能較GSCA5的高，因此推測(cè)GSCA5較GSWA8的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。GSCO7（type D）在ITS1區(qū)出現(xiàn)了兩個(gè)封閉的環(huán)，其RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)均不同于以上三類構(gòu)象，在ITS1區(qū)出現(xiàn)了兩個(gè)封閉的環(huán)?？傮w而言，G. spinosa ITS序列RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)在ITS1，ITS2區(qū)以及5.8S區(qū)均出現(xiàn)了差異。雖然8個(gè)G. spinosa ITS樣品彼此間RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性狀況與一級(jí)結(jié)構(gòu)的并不相同，但同樣與其地理分布區(qū)間沒(méi)有體現(xiàn)出一定的相關(guān)性。

4 討論

ITS序列是近年來(lái)用于探討植物近緣屬間、種間系統(tǒng)關(guān)系和種內(nèi)變異的重要分子標(biāo)記。被子植物的ITS區(qū)長(zhǎng)度比較穩(wěn)定，包括5.8S rDNA在內(nèi)，總長(zhǎng)度為600～700 bp。該研究序列分析結(jié)果顯示，8個(gè)G. spinosa ITS序列的長(zhǎng)度僅GSNE1為623 bp，其余均為622 bp，符合被子植物ITS序列長(zhǎng)度的變化范圍。G. spinosa ITS1區(qū)序列長(zhǎng)度保守，除GSNE1為223 bp外，其余均為222 bp，ITS序列長(zhǎng)度的主要變化出現(xiàn)在ITS2區(qū)，多數(shù)樣品5.8S區(qū)長(zhǎng)度為164 bp，但是GSWA8為161 bp。Baldwin（1992）最早對(duì)被子植物ITS序列假基因的研究表明：被子植物5.8 S序列一般長(zhǎng)度都在163～164 bp之間，若出現(xiàn)了插入或缺失就有可能形成假基因（人們把含有不具編碼功能5.8S區(qū)ITS序列定義為ITS假基因）。G. spinosa ITS序列包括22個(gè)變異位點(diǎn)，說(shuō)明ITS序列在G. spinosa系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析中能夠提供足夠的證據(jù)。5.8S區(qū)最為保守，無(wú)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，變異位點(diǎn)少。從ITS序列的變異位點(diǎn)來(lái)看，G. spinosa共有22個(gè)變異位點(diǎn)，這些變異位點(diǎn)主要存在于ITS2區(qū)，包含14個(gè)變異位點(diǎn)，占總變異位點(diǎn)數(shù)的63.63%，ITS1區(qū)僅有5個(gè)變異位點(diǎn)，5.8S區(qū)最為保守，含3個(gè)變異位點(diǎn)，無(wú)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，因此僅以ITS1區(qū)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并不能提供足夠信息量。屈良鵠和陳月琴（1999）通過(guò)對(duì)不同生物類群的ITS序列的比較得出：被子植物大多數(shù)科屬I(mǎi)TS序列的種間差異值為1.2%～10.2%，曾明等（2003）和車(chē)建等（2007）在利用ITS序列分別對(duì)葛根和西紅花正偽品的鑒定中均認(rèn)為ITS序列種內(nèi)差異值小于1%。該研究測(cè)得5個(gè)地區(qū)的8個(gè)G. spinosa樣品在ITS區(qū)的堿基差異為3.53 %，表現(xiàn)出較大的遺傳分化。同樣，在對(duì)同一地區(qū)的G. spinosa樣品系統(tǒng)發(fā)育分析中得出分布在內(nèi)華達(dá)的GSNE1與GSNE2、猶他州的GSUT3與GSUT4以及分布在加利福利亞的GSCA5與GSCA6，相互間的遺傳距離除GSUT3與GSUT4外，其余并非最小，采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，顯示出同一地區(qū)的GSNE1與GSNE2也未聚在一起。這與地理距離與遺傳距離Mantel檢驗(yàn)的結(jié)果相吻合。

由于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)比一級(jí)結(jié)構(gòu)更具保守性，因此可以通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)反映一級(jí)結(jié)構(gòu)所反映不出的生物信息。該研究對(duì)8個(gè)G. spinosa樣品的ITS序列RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)主要差異出現(xiàn)在ITS1區(qū)和ITS2區(qū)，這與ITS序列一級(jí)結(jié)構(gòu)分析中其主要的變異位于ITS1區(qū)和ITS2區(qū)的結(jié)論相一致。

但是，有研究表明多數(shù)真核生物中ITS1區(qū)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)具有較高保守性（Musters et al，1990），并且3′端無(wú)論是在ITS序列一級(jí)結(jié)構(gòu)還是其RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中都比5′端更保守。而在我們的研究中對(duì)8個(gè)G. spinosa樣品的ITS序列RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較中發(fā)現(xiàn)僅GSUT4與GSCA6的ITS2區(qū)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與其他6個(gè)樣品較大的不同，較ITS1區(qū)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)更為保守，這與ITS2區(qū)在進(jìn)化中所受的選擇壓力較高有關(guān)。該研究對(duì)ITS序列一級(jí)結(jié)構(gòu)與其RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析還發(fā)現(xiàn)，在ITS序列一級(jí)結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育分析中GSNE1與GSWA8體現(xiàn)出更近的親緣關(guān)系，但是二者的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)差異明顯，分屬于2個(gè)不同的類型中，同時(shí)GSNE2，GSUT3，GSUT4，GSCA5，GSCA6，GSCO7在ITS序列一級(jí)結(jié)構(gòu)分析中也體現(xiàn)了較近的親緣關(guān)系，但是在它們的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)，GSNE2卻與在一級(jí)結(jié)構(gòu)分析中處在另一分支上的GSNE1的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致，相似的情況也出現(xiàn)在GSWA8與GSCA5之間。研究發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)若位于莖區(qū)，則有可能使二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，若突變發(fā)生在環(huán)上或自由基則對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響不大，這可能與環(huán)狀結(jié)構(gòu)與維持RNA的功能有關(guān)。比較該研究中 8個(gè)G. spinosa樣品ITS一級(jí)結(jié)構(gòu)的突變位點(diǎn)僅ITS1區(qū)的位點(diǎn)88、103、111，ITS2區(qū)的位點(diǎn)621、622位于莖區(qū)，其余均位于環(huán)上，則對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響不大?？傊?，G. spinosa樣品ITS一級(jí)結(jié)構(gòu)與其RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化并未表現(xiàn)出完美的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)體現(xiàn)出了更高的保守性。

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