土牛膝中蛻皮甾酮的正交提取工藝研究

蒙漢富 銀勝高 蔣娟 曾柳燕 李小霞

【摘 要】目的：正交優(yōu)化土牛膝中蛻皮甾酮的提取工藝。方法：采用單因素實(shí)驗(yàn)、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和高效液相色譜法，以色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇∶水=39∶61；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)量體積：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm條件下對(duì)土牛膝中蛻皮甾酮的提取工藝進(jìn)行研究。結(jié)果：蛻皮甾酮在0.117～5.85 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，蛻皮甾酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1 367.7x，r=0.999 8；土牛膝中蛻皮甾酮最佳提取工藝為每0.5 g土牛膝藥材粉末以60倍30%甲醇超聲提取2次每次1.5 h。結(jié)論：該提取工藝簡(jiǎn)便、合理，可為土牛膝中蛻皮甾酮的制備及土牛膝的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

【關(guān)鍵詞】土牛膝；蛻皮甾酮；正交設(shè)計(jì)；提取工藝

【中圖分類號(hào)】R286 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-0688（2018）06-0049-03

土牛膝為莧科植物粗毛牛膝（Achyranthes aspera L.）的干燥根和根莖[1]，其味苦、酸，性微寒，具有清熱毒、除濕邪、調(diào)水道、驅(qū)瘴毒的功效；主治閉經(jīng)、痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、淋證、痢疾、瘴病、痧病、水腫、凍瘡等疾病[2]。目前，臨床上常用于治療白喉、咽喉腫痛、感冒發(fā)熱、流行性腮腺炎、瘧疾、腎炎水腫的治療[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究報(bào)道，土牛膝具明顯的殺菌、鎮(zhèn)痛、降血糖和抗脂質(zhì)過氧化的作用，可以有效降低血清中膽固醇的含量，減少血小板的聚集性作用[4]，且在治療呼吸道、泌尿系統(tǒng)感染上效果顯著[5]，并對(duì)多種疾病具有預(yù)防作用[6-7]。本文對(duì)土牛膝中的藥效成分蛻皮甾酮進(jìn)行正交提取工藝研究。

1 實(shí)驗(yàn)試藥與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的土牛膝根和根莖采集于廣西金秀縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高級(jí)實(shí)驗(yàn)師廖月葵鑒定為莧科植物粗毛土牛膝Achyranthes aspera L.的根和根莖，蛻皮甾酮對(duì)照品（四川維克奇生物科技有限公司；批號(hào)：130428；純度：HPLC≥98%）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（Agilent美國安捷倫）、SQP電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）、L600臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、HWS-2l電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司），等等。

1.3 試劑與溶劑

甲醇（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；去離子水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱量蛻皮甾酮對(duì)照品11.70 mg，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解稀釋至刻度，搖勻，精密移取2 mL置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即可。

2.2 供試品溶液制備

取土牛膝藥材粉末（過三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入30%甲醇溶液30 mL，稱重，超聲處理1.5 h，靜置冷卻后補(bǔ)足失重，離心15 min（轉(zhuǎn)速為4 200 rpm），取上清液置于蒸發(fā)皿中，殘?jiān)貜?fù)做實(shí)驗(yàn)，濃縮至近干，用甲醇溶液定容至5 mL容量瓶，搖勻，取1 mL試液離心15 min（轉(zhuǎn)速為13 000 rpm），即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇∶水=39∶61；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)量體積：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖（如圖1～圖2所示）。結(jié)果表明：蛻皮甾酮峰在16.9 min附近出峰，無干擾。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密吸取蛻皮甾酮對(duì)照品溶液（0.234 mg/mL） 0.5、1、5、10、15、25 μL，注入液相色譜儀，按上述“2.3”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積y與蛻皮甾酮進(jìn)樣量x（μg）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1 367.7x，r=0.999 8。表明蛻皮甾酮在0.117～5.85 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 提取溶液的考察

分別取約0.5 g土牛膝粉末（過50目篩），精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入不同濃度的乙醇（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、水、不同濃度的甲醇（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）提取溶劑30 mL，一式2份，稱重，超聲處理1 h，放冷，稱重，分別加入相應(yīng)的提取溶劑補(bǔ)足重量，搖勻，靜置，取上清液，水浴烘干。用甲醇溶液定容至5 mL的容量瓶中，取溶液1 mL進(jìn)行離心，進(jìn)樣，測(cè)定。將各提取樣品的檢測(cè)峰面積代入蛻皮甾酮的線性方程中進(jìn)行計(jì)算，算出各樣品中蛻皮甾酮的含量。結(jié)果表明30%甲醇對(duì)土牛膝根和根莖藥材中的蛻皮甾酮的提取效果較好。

2.7 其他試驗(yàn)條件正交優(yōu)化研究

以土牛膝中蛻皮甾酮為考察指標(biāo)，以提取時(shí)間（h）、提取次數(shù)、甲醇濃度（%）、加溶劑量倍數(shù)等因素，應(yīng)用L9（34）正交進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體試驗(yàn)因素水平與設(shè)計(jì)見表1、表2。

取土牛膝根和根莖粉末（過50目篩），取各約0.5 g，精密稱定，分別置于錐形瓶中，按表2中的因素水平序號(hào)進(jìn)行正交提取，一式2份。表2中的各因素水平具體見表1。每次提取后都靜置、補(bǔ)足重量，多次提取的，合并上清液，后水浴干燥，用甲醇定容至5 mL。取樣，離心，測(cè)定，得到峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算出各提取樣品中所含的蛻皮甾酮含量。

3 討論

通過蛻皮甾酮對(duì)照品HPLC檢測(cè)的3D圖譜可知蛻皮甾酮的最大吸收峰為250 nm；對(duì)土牛膝樣品進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果表明：以甲醇∶水=39∶61為流動(dòng)相時(shí)，土牛膝樣品中的蛻皮甾酮的分離效果較為理想。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相為甲醇∶水=39∶61。筆者還采用超聲、靜置、加熱回流等不同提取方法對(duì)土牛膝中的蛻皮甾酮效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明超聲提取和回流提取的效果相當(dāng)，均優(yōu)于靜置提取的效果，但由于超聲提取消耗能量較少，且操作簡(jiǎn)便，故選用超聲做為提取。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析得出，各因素對(duì)測(cè)得蛻皮甾酮的含量的影響大小依次如下：提取容劑（D）>提取次數(shù)（B）>甲醇濃度（C）=提取時(shí)間（A）。極差分析數(shù)據(jù)表明：δ31>δ21>δ11；δ22>δ32>δ12；δ23>δ13=δ33；δ34>δ24>δ14。因此，各因素水平最佳的實(shí)驗(yàn)組合為A3B2C2D3，表明土牛膝中的蛻皮甾酮最佳提取工藝為每0.5 g用60倍的30%甲醇超聲提取2次，每次1.5 h。

蛻皮甾酮為土牛膝的主要活性成分之一，可用于調(diào)整人體內(nèi)新陳代謝，提高身體的免疫功能，且對(duì)炎癥、高血糖、抗動(dòng)脈粥硬化等多種疾病的治療效果良好而受到廣泛關(guān)注。本文對(duì)土牛膝中的蛻皮甾酮進(jìn)行正交提取工藝研究，可為土牛膝中蛻皮甾酮的制備及土牛膝的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

參 考 文 獻(xiàn)

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