自發(fā)性高血壓大鼠左心室肥厚的蛋白質(zhì)譜研究

劉培 肖隋熙 羅穎 陳偶英 劉天洋 郭心鴿 譚元生 簡維雄

〔摘要〕 目的 研究自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）左心室肥厚心肌組織的蛋白質(zhì)變化。方法 對8只SHR與8只WKY大鼠組織蛋白質(zhì)進行iTRAQ檢測分析；通過對差異蛋白Pathway富集分析選擇與通路相關(guān)的蛋白質(zhì)。結(jié)果 篩選出與通路相關(guān)的40個差異蛋白，SHR與WKY比較上調(diào)的差異蛋白有：1主要組織相容性復(fù)合物、2血小板活化因子乙酰水解酶、3有絲分裂原蛋白激酶、4熱休克27kDa蛋白、5 Ighg3、6 14-3-3γ蛋白、7纖維蛋白原、8蛋白酶體26S、9纖維蛋白原γ鏈、10中性膽固醇酯水解酶、11溶血PAF乙酰轉(zhuǎn)移酶、12纖連蛋白。下調(diào)的差異蛋白有：13絲氨酸蛋白酶、14載脂蛋白H、15血清鋅α2糖蛋白、16泛醌9、17泛醌7、18α2-AP、19激肽原、20肝素2、21未知蛋白、22鈉鉀ATP轉(zhuǎn)移酶、23膠原蛋白、24集聚蛋白、25對羥基苯丙酮酸雙氧化酶、26C反應(yīng)蛋白、27整合素、28凝血因子Ⅻ、29胎球蛋白、30整合素α7、31碳酸酐酶、32CD36、33免疫球蛋白重鏈γ多肽、34轉(zhuǎn)膠蛋白、35血紅蛋白-α。結(jié)論 SHR左心室肥厚發(fā)生涉及心肌凋亡、細(xì)胞增殖增生、炎癥等多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致細(xì)胞損傷與保護作用失衡。

〔關(guān)鍵詞〕 自發(fā)性高血壓大鼠；左心室肥厚；蛋白質(zhì)組學(xué)

〔中圖分類號〕R544.1；R393 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.001

〔Abstract〕 Objective To study the protein changes in the myocardium of left ventricular hypertrophy in spontaneously hypertensive rats （SHR）. Methods The protein of 8 SHR and 8 WKY rats were detected and analyzed by iTRAQ detection and analysis technique. The proteins related to pathway were selected by enrichment analysis of differential protein pathway. Results The 40 differential proteins related to pathways were screened. Upregulated proteins in SHR compared with WKY： 1 major histocompatibility complex， 2 platelet activating factor acetylhydrolase， 3 mitogen activated protein kinase， 4 heat shock protein 27 kDa， 5 Ighg 3， 6 14-3-3 protein gamma， 7 ibrinogen， 8 fibrin and 26 S proteasome， 9 the original gamol/La chain， 10 neutral cholesteryl ester hydrolase， 11 hemolytic PAF acetyltransferase， 12 fibronectin. Down regulated differentially proteins： 13 serine protease， 14 apolipoprotein H， 15 serum zinc alpha 2 glycoprotein， 16 ubiquinone 9， 17 ubiquinone 7， 18 alpha 2-AP， 19 kininogen， 20 heparin cofactor 2， 21 unknown protein， 22 sodium-potassium ATP transferase， 23 collagen， 24 agrin， 25 concentration of HPPD， 26 C reactive protein， 27 integrin， 28 coagulation factor XII， 29 fetuin 30 integrin alpha 7， 31 carbonic anhydrase， 32 CD36， 33 immune globulin heavy chain gamma polypeptide， 34 transgelin， 35 hemoglobin alpha. Conclusion Left ventricular hypertrophy in SHR involves many kinds of cytokines， such as myocardial apoptosis， cell proliferation， proliferation， inflamol / Lation and so on， leading to the imbalance of cell injury and protection.

〔Keywords〕 spontaneously hypertensive rats； left ventricular hypertrophy； proteomics

自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）是研究高血壓疾病的經(jīng)典鼠種，研究發(fā)現(xiàn)在第14周齡時，SHR的左心室質(zhì)量和左心室質(zhì)量指數(shù)已經(jīng)顯著高于對照組，說明此時左室肥厚已經(jīng)基本形成[1]。人體和各種生命物質(zhì)是由蛋白質(zhì)組成的，為了從整體角度分析左室肥厚時細(xì)胞內(nèi)生命過程中動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平、修飾狀況、蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)與其它生物分子之間的相互作用。本項目應(yīng)用相對和絕對定量同位素標(biāo)記（iTRAQ）技術(shù)展開對左心室肥厚干預(yù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

1 材料

1.1 動物

選用SPF級12周齡自發(fā)性高血壓大鼠（SHR） 8只，雄性，同齡血壓正常的（wistar-kyoto，WKY）大鼠8只，雄性，質(zhì)量180～220 g，大鼠及飼料均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供（SHR大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格編號：20141020，飼料購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司），飼養(yǎng)環(huán)境溫度（20.0±2.0） ℃，相對濕度45%～70%。自由飲食飲水，早8點至下午5點自動燈光照明。

1.2 試劑

Trypsin（Promega公司，美國），三乙胺碳酸氫鹽（Applied Biosystem公司，意大利），TEAB（Applied Biosystem公司，意大利），乙腈（Sigma公司，美國），甲酸（Sigma公司，美國），2-D Quant Kit（GE Healthcare公司，美國），8標(biāo)iTRAQ試劑（Applied Biosystem公司，意大利）。

1.3 儀器

離心機（德國，Eppendorf公司），Milli-Q Advantage超純水系統(tǒng)（美國，密理博），precellys24多功能生物樣品均質(zhì)器（法國，Bertin），VCX130超聲波細(xì)胞粉碎機（美國，Sonics），Mini-PROTEAN Tetra Cell小型垂直電泳槽（美國，伯樂），powerlook2100xl 掃描儀（美國，UMAX），iMark酶聯(lián)免疫吸附儀（美國，伯樂），SCX強陽離子交換液相色譜柱（美國，菲羅門公司），LC-20AD nanoHPLCOnline HPLC（日本，島津公司），C-20AB HPLCOffline HPLC（日本，島津公司），Q EXACTIVE質(zhì)譜儀（中國，賽默飛世），Q-EXACTIVE （ThermoFisher Scientific，San Jose，CA）。

2 方法

2.1 蛋白制劑

2組大鼠處死后，分別剪取心臟左心室部分，每個樣本剪碎后稱取30 mg，用Lysis Buffer含有1 mol/L PMSF和2 mol/L的EDTA（終濃度）萃取。5 min后，10 mol/L DTT（終濃度）加入到樣品中。將懸浮液進行超聲處理，在200 W15 min，然后在4 ℃，30 000 g離心15 min，上清充分混合，上清加入5倍體積預(yù)冷丙酮，在-20攝氏度沉淀2 h，離心在4 ℃下，30 000 g后，棄去上清液。將沉淀物用冷凍丙酮3次。將沉淀風(fēng)干，溶解于裂解緩沖液。將懸浮液進行超聲處理，在200 W15 min，并在4 ℃，30 000 g離心15 min。將上清轉(zhuǎn)移到另一管中。上清液在56攝氏度條件下加入終濃度10 m MDTT處理1 h，還原打開二硫鍵。隨后，加入55 mol/L IAM（終濃度）進行半胱氨酸的烷基化封閉，在暗室孵育1 h。上清充分混合，用5倍體積冷卻的丙酮2 h在-20 ℃以沉淀蛋白質(zhì)。在4 ℃下，30 000 g離心 后，棄去上清液，將沉淀物風(fēng)干5 min，溶解在500 μL的0.5 mol/L的三乙胺碳酸氫鹽中（Applied Biosystems，米蘭，意大利），并超聲處理在200 W 15 min。最后，將樣品在4 ℃，30 000 g離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中并定量。上清液中的蛋白質(zhì)被保存在-80 ℃用于進一步分析。

2.2 分離部分iTRAQ標(biāo)記和SCX分級

每個樣品精確取出100 μg蛋白，然后按蛋白∶酶=30∶1的比例加入Trypsin，37 ℃酶解4 h。按上述比例再補加Trypsin1次，37 ℃繼續(xù)酶解16 h。

胰酶消化后，肽通過真空離心干燥。樣品標(biāo)記用的iTRAQ標(biāo)簽如下：SHR（115標(biāo)記），WKY組（113標(biāo)記）。將肽標(biāo)記的同量異序標(biāo)記，在室溫下孵育2 h。將標(biāo)記后的各組肽段混合，用SCX柱進行液相分離。

采用島津LC-20AB液相系統(tǒng)、分離柱為4.6 mm×250 mm型號的UltremexSCX柱對樣品進行液相分離。將標(biāo)記后抽干的混合肽段用4 mL bufferA（25 mol/L NaH2PO4 in 25%ACN，pH2.7）復(fù)溶。進柱后以1 mL/min的速率進行梯度洗脫：先在5% buffer B（25 mol/L NaH2PO4，1 mol/L KCl in 25%ACN，pH2.7）中洗脫7 min，緊跟著一個20 min的直線梯度使buffer B由5%上升至60%，最后在2 min內(nèi)使buffer B的比例上升至100%并保持1 min，然后恢復(fù)到5%平衡10 min。整個洗脫過程在214 nm吸光度下進行監(jiān)測，經(jīng)過篩選得到12個組分。每個組分分別用StrataX除鹽柱除鹽，然后冷凍抽干。

2.3 質(zhì)譜鑒定

將抽干的每個組分分別用buffer A（2% ACN，0.1% FA）復(fù)溶至約0.5 μg/μL的濃度，20 000 g離心10 min，除去不溶物質(zhì)。每個組分上樣10 μL（約5 μg蛋白），通過島津公司LC-20AD型號的納升液相色譜儀進行分離。所用的柱子柱包括Trap柱和分析柱兩部分。分離程序如下：先以8 μL/min的流速在4 min內(nèi)將樣品loading到Trap柱上，緊接著一個總流速為300 nL/min的分析梯度將樣品帶入分析柱，分離并傳輸至質(zhì)譜系統(tǒng)。先在2% bufferB（98% ACN，0.1% FA）下洗脫5 min，跟著一個35 min的線性梯度使bufferB的比例由2%上升至35%，在接下來的5 min內(nèi)提高到60%，然后在2 min內(nèi)buffer B增加到80%并保持4 min，最后在1 min內(nèi)恢復(fù)至5%并在此條件下平衡10 min。

經(jīng)過液相分離的肽段進入到串聯(lián)ESI質(zhì)譜儀：Q-EXACTIVE（ThermoFisher Scientific，San Jose， CA）。一級質(zhì)譜分辨率設(shè)置為70 000，二級分辨率為17 500。在母離子中挑選電荷為2+～5+，峰強度超過20 000的15個母離子進行二級分析，用碰撞能量為（27±12）%的HCD模式對肽段進行碎裂，碎片在Orbi中檢測，動態(tài)排除時間設(shè)定為：色譜半峰寬時長。離子源電壓設(shè)置為1.6 kV。AGC通過orbi來實現(xiàn)，其設(shè)置為：一級3E6到二級1E5。掃描的質(zhì)荷比范圍為一級350～2 000，二級100～1 800。

2.4 蛋白質(zhì)分析方法

2.4.1 數(shù)據(jù)庫選擇 Uniprot Rattus（36508sequences）。

2.4.2 Mascot搜索 采用Mascot 2.3.02版本，操作時以mgf文件為原始文件，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫，然后進行數(shù)據(jù)庫搜索。

2.4.3 蛋白質(zhì)豐度比分布 在相對定量時，如果同一個蛋白質(zhì)的量在兩個樣品間沒有顯著的變化，那么其蛋白質(zhì)豐度比接近于1。當(dāng)?shù)鞍椎呢S度比即差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計檢驗其p-value值小于0.05時，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白。對每個蛋白質(zhì)差異倍數(shù)以2為底取對數(shù)后作出分布如圖1。表達(dá)量上調(diào)的蛋白居于橫坐標(biāo)0位置的右側(cè)，表達(dá)量下調(diào)的蛋白居于橫坐標(biāo)0位置的左側(cè)。

2.4.4 差異蛋白的Pathway富集分析 Pathway顯著性富集分析方法同GO功能富集分析，是以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，找出與所有鑒定到蛋白背景相比，在差異蛋白中顯著性富集的Pathway。通過Pathway顯著性富集能確定差異蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

3 結(jié)果

3.1 肽段匹配誤差分布

Q-Exactive質(zhì)譜儀的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜質(zhì)量精確度都小于2 ppm。但為了防止遺漏鑒定結(jié)果，因此基于數(shù)據(jù)庫搜索策略的肽段匹配誤差控制在0.02 Da以下。圖1顯示了所有匹配到的肽段的相對分子量的真實值與理論值之間的誤差分布。

3.2 蛋白質(zhì)鑒定

3.2.1 基本鑒定信息 二級譜圖總數(shù)（TotalSpectra）344 342，為匹配到的譜圖數(shù)量（Spectra）82 990，為匹配到特有肽段的譜圖數(shù)量（UniqueSpectra）69 574，鑒定到特有肽段序列的數(shù)量（UniquePeptide）11 135，鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量（Protein）2 783。

3.2.2 差異蛋白質(zhì)定量信息統(tǒng)計 在相對定量時，如果同一個蛋白質(zhì)的量在兩個樣品間沒有顯著的變化，那么其蛋白質(zhì)豐度比接近于1。當(dāng)?shù)鞍椎呢S度比即差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計檢驗其P<0.05時，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白。差異結(jié)果表明SHR組與WKY組比較兩組共有183個蛋白達(dá)相差1.2倍以上，其中68個上調(diào)，115個下調(diào)。

3.3 差異蛋白的Pathway富集分析

3.3.1 富集Pathway 見表1。

3.3.2 富集Pathway蛋白質(zhì) 見表2。

4 討論

心肌肥厚是一個因子、多途徑的作用的結(jié)果，單一蛋白的改變是可以導(dǎo)致心肌肥厚，但是多個蛋白失衡的交互作用，可能是關(guān)鍵性要素，為此本項目在篩選出差異蛋白后，結(jié)合蛋白的Pathway通路，從多個蛋白角度出發(fā)，試圖從整體性層面的失衡來解釋SHR左心室肥厚的機理及其藥物干預(yù)的機制。為此是以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，找出與所有鑒定到蛋白背景相比，在差異蛋白中顯著性富集的Pathway。通過Pathway顯著性富集能確定差異蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本項目通過Pathway富集分析篩選出：SHR與WKY比較上調(diào)的差異蛋白有：1主要組織相容性復(fù)合物、2血小板活化因子乙酰水解酶、3有絲分裂原蛋白激酶、4熱休克27 kDa蛋白、5 Ighg3、6 14-3-3γ蛋白、7纖維蛋白原、8蛋白酶體26S、9纖維蛋白原γ鏈、10中性膽固醇酯水解酶、11溶血PAF乙酰轉(zhuǎn)移酶、12纖連蛋白。下調(diào)的差異蛋白有：13絲氨酸蛋白酶、14載脂蛋白H、15血清鋅α2糖蛋白、16泛醌9、17泛醌7、18α2-AP、19激肽原、20肝素2、21未知蛋白、22鈉鉀ATP轉(zhuǎn)移酶、23膠原蛋白、24集聚蛋白、25對羥基苯丙酮酸雙氧化酶、26C反應(yīng)蛋白、27整合素、28凝血因子Ⅻ、29激肽原、30整合素α7、31碳酸酐酶、32CD36、33免疫球蛋白重鏈γ多肽、34轉(zhuǎn)膠蛋白、35血紅蛋白-α。

4.1 上調(diào)蛋白質(zhì)意義

主要組織相容性復(fù)合物（MHC）的功能是以其產(chǎn)物提呈抗原肽而激活T淋巴細(xì)胞，與T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體結(jié)合，實現(xiàn)對抗原和MHC分子的雙重識別。在缺血、缺氧、炎癥反應(yīng)等刺激影響下MHC分子表達(dá)上調(diào)，可被各種炎性因子激活而發(fā)揮作用[2]。炎癥反應(yīng)介導(dǎo)了高血壓病左心室肥厚已經(jīng)是研究者的共識。

血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）具有水解血小板活化因子和相關(guān)磷脂片段并使之失活的作用。血小板活化因子（PAF）能促使血小板和中性粒細(xì)胞聚集；促使多種細(xì)胞使之產(chǎn)生趨化性及化學(xué)激動；參與呼吸暴發(fā)和超氧化物的形成、蛋白質(zhì)的磷酸化；作用于蛋白激酶C（PKC）、花生四烯酸及磷酸肌醇的代謝；促使糖原的分解；促使腫瘤壞死因子的產(chǎn)生；調(diào)節(jié)白介素的分泌、TIMP-1，具有觸發(fā)和放大炎癥的作用[3]。PAF在生物體內(nèi)在溶血PAF乙酰轉(zhuǎn)移酶、與PAF乙酞水解酶（LPCAT）作用下以動態(tài)形式存在，細(xì)胞受到刺激時生成，隨后很快被代謝消除。PAF的代謝失活是由PAF乙酞水解酶水解。溶血PAF乙酰轉(zhuǎn)移酶具有將PAF水解片段，合成PAF的作用[4]。我們推測這個兩個酶水平上調(diào)顯示血小板活化因子體系處于激活狀態(tài)。

絲裂原活化蛋白激酶3（MKK3）是p38 MAPK的上游激活分子，能夠特異性激活p38MAPK。p38 MAPK信號通路除了參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，p38MAPK還參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子生成、細(xì)胞骨架重構(gòu)等生物事件發(fā)揮其重要作用，被認(rèn)為是細(xì)胞信息傳遞的交匯點和共同通路。在正常生理狀態(tài)下細(xì)胞的生長和增殖中有重要作用，在病理性因素刺激引起的心肌細(xì)胞肥大的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中也起到重要作用[5]。

熱休克蛋白27是小熱休克蛋白家族中最具代表性的成員，其水平的增高，是否是心肌細(xì)胞肥大時的代償作用，有學(xué)者的研究證實了這一點。在運動誘導(dǎo)的生理性心肌肥厚模型中，HSF1和熱休克蛋白如Hsp27和Hsp70的表達(dá)明顯上調(diào)。國內(nèi)也有學(xué)者證實心臟特異性高表達(dá)Hsp27具有的誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚的作用，ERKs的激活可能是其中的重要分子通路[6]。

IgG中重鏈CH3功能區(qū)，具有結(jié)合組織細(xì)胞的作用。IgG是屬于抗體，表明各種損傷因素增加，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。

14-3-3是一個調(diào)節(jié)蛋白家族，能與Raf-1，PKC，細(xì)胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（Cdc25C），Ras激酶抑制因子（KSR），Bcr，Ca2+/CaM激酶，Bad和跨膜蛋白受體等多種信號蛋白結(jié)合， 說明14-3-3蛋白在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。而以上這些蛋白在心肌肥厚的過程中發(fā)揮著重要的作用[7]。

纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g）在分子結(jié)構(gòu)上包含三條多肽鏈：Aα、Bβ和γ，分別被纖維蛋白原α（FGA）、纖維蛋白原β（FGB）和纖維蛋白原γ（FGG）三種獨立基因所編碼。近來的研究表明纖維蛋白原β鏈的合成是Fg合成的限速步驟。雖在肝細(xì)胞內(nèi)合成，但也可在上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等合成，并與纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、透明質(zhì)酸等協(xié)同構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)，并通過細(xì)胞間黏附分子-1介導(dǎo)的P38、ERK及JNK通路導(dǎo)致心肌細(xì)胞異常增生[8]。心肌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）由膠原、纖粘連蛋白、層粘連蛋白及彈性蛋白、蛋白聚糖等組成，其中主要成分是膠原。Ⅰ型膠原占膠原總量的85%，有較大的張力，伸展回彈性小，主要聚合成粗纖維網(wǎng)[9-10]。過量的膠原沉積在心肌間質(zhì)，可使膠原網(wǎng)絡(luò)增粗變密，心室被動回彈性下降、心壁硬度增大，心肌順應(yīng)性下降，從而導(dǎo)致心臟舒張功能障礙。不同原因所致的間質(zhì)重構(gòu)，膠原纖維的變化不同。壓力超負(fù)荷性左室肥大時，心肌間質(zhì)膠原合成增加。但心肌缺血或缺血再灌注時心肌膠原纖維出現(xiàn)斷裂，含量減少。壓力負(fù)荷過重導(dǎo)致的左心室肥厚中初期質(zhì)膠原合成增加，而在第4周時肌膠原纖維量減少[11]。

蛋白酶體可分為20S蛋白酶體和26S蛋白酶體兩種形式，細(xì)胞內(nèi)最普遍存在的蛋白酶體是26S蛋白酶體，它是一種包含有1個20S核心顆粒和2個19S調(diào)節(jié)顆粒的桶狀結(jié)構(gòu)，也是一種依賴ATP的蛋白水解復(fù)合體盡管蛋白酶體在心肌肥厚中的具體作用有待研究，但在一些心肌肥厚的模型中檢測出了蛋白酶體亞單位蛋白質(zhì)表達(dá)的增強，這是因為蛋白酶體促進了心肌肥厚的抑制因子的降解，如早期誘導(dǎo)環(huán)腺苷酸抑制因子。此外蛋白酶體還參與了蛋白質(zhì)降解、修改延長因子的活動等機制[12]。

中性膽固醇酯水解酶1（nCEHs），在中性PH環(huán)境下，催化膽固醇酯（CE）水解作用的酶有多種，被稱為中性膽固醇酯水解酶。不僅可以清除已蓄積于泡沫細(xì)胞中的CE，而且能夠防止CE的積聚。nCEHs可不同程度的影響炎癥CD40-CD40L系統(tǒng)，從而參與炎癥反應(yīng)過程，與心室重構(gòu)有著密切的關(guān)系[13]。

纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)n）作為細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中重要的黏附分子之一，通過與細(xì)胞膜上的整合素受體（avβ3，avβ1，avβ5，α4β1，α9 β1）結(jié)合，從而刺激P38 MAPK下在促進心肌細(xì)胞黏附、遷移、增殖等過程中發(fā)揮著重要作用[14-15]。

4.2 下調(diào)蛋白質(zhì)意義

血清鋅α2糖蛋白（ZAG）對目前的熱點如瘦素，脂聯(lián)素（APN）等脂肪因子有強烈的調(diào)節(jié)作用，能夠上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)[16]。而APN通過抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路，激活磷酸腺苷活性蛋白酶（AMPK）抑制心肌細(xì)胞的肥大[17]。

激肽原1（HKa）是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中的成員之一，作用極其復(fù)雜。已經(jīng)肯定的功效是增強機體的血管舒張能力，促進免疫炎癥反應(yīng)。被證實具有抗粘附特性，HKa能夠與帶負(fù)電荷物質(zhì)表面上的粘附蛋白結(jié)合并將其置換出來；HKa能競爭性抑制纖維蛋白原和體外連接蛋白（VN）等粘附蛋白與細(xì)胞表面結(jié)合；HKa能抑制細(xì)胞粘附到蛋白包被的表面上。激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）具有強大的心血管保護作用，通過抑制JNK/P38MAPK的磷酸化，抑制NF-KB-DNA結(jié)合活性后，抑制了MCP-1，VCAM-1從損傷部位的釋放，抑制心肌肥厚的形成的作用[18]。

近年來大量研究顯示，載脂蛋白H及其抗體與動脈樣硬化和體內(nèi)血栓形成血壓增高有較大的相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白H沉積在缺血性心肌病心肌中而在其他病變心肌樣本中沒有發(fā)現(xiàn)的沉積。推測存在心肌中的載脂蛋白H與炎癥過程有關(guān)[19]，進一步研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白H可以調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活力，而腺苷酸環(huán)化酶具有心肌細(xì)胞的保護作用[20]，抑制心肌肥厚。

α2-AP中α-2 抗纖溶酶是纖維蛋白溶解酶的重要抑制因子，其表達(dá)的下調(diào)可導(dǎo)致活化的纖維蛋白溶解酶含量增高，而后者則會改變ECM的完整性，從而影響纖維化的發(fā)生，在一項肝纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)肝纖維化組織中α2-AP 水平含量降低，而經(jīng)干預(yù)后肝纖維化程度降低后，α2-AP水平上調(diào)。心室肥厚也存在心肌纖維化，α2-AP也可能呈現(xiàn)下調(diào)趨勢[21]。

肝素2是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族之一，是存在于體內(nèi)外的另外一種主要的抗凝血酶物質(zhì)，還參與炎癥反應(yīng)過程，可以被中性粒細(xì)胞釋放的彈性蛋白酶水解，釋放出來的N端多肽片段對中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞具有趨化作用，在肺內(nèi)的作用可能是防止肺內(nèi)纖維蛋白的沉積的作用[21-22]。在心室肥厚中水平下調(diào)可能是炎癥過程中分解的結(jié)果。

凝血因子Ⅶ （FXII）是肝臟合成的一種絲氨酸蛋白酶，是凝血接觸途徑的重要組成因子，在高分子量激肽（HK）和血漿激肽釋放酶（PK）共同參與下激活內(nèi)源性凝血途徑[23]。還具有促炎癥作用，主要通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集和脫顆粒，以及面通過高分子量激膚（HK）生成緩激肽，進一步增強血管壁通透性等功能。在心室肥厚的作用有待進一步探索。

對羥基苯丙酮酸雙氧化酶（HPPD）是近年來在除草劑靶標(biāo)探索中發(fā)現(xiàn)的一種靶標(biāo)酶，參與植物中質(zhì)體酮和生育酚的生物合成，同時也參與了大多數(shù)生物體的酪氨酸和苯丙氨酸分解代謝。HPPD在人及其它哺乳動物體內(nèi)的主要作用是促進酪氨酸的代謝涉及泛醌等萜醌生物合成[24]。輔酶Q又稱泛醌，輔酶Q作為心肌線粒體內(nèi)膜的一種遞氫體，參于電子傳遞過程，是細(xì)胞呼吸和代謝的激活劑。以人類輔酶Q10，節(jié)心肌細(xì)胞的代謝功能，能減輕心肌細(xì)胞因缺血或充血造成的組織損傷，從而保護心肌功能，并提供充足的ATP[25]。

鈉鉀ATP酶，或稱鈉泵、鈉鉀離子激活的腺苷-5'-三磷酸酶。Na+-K+-ATP的主要功能是將細(xì)胞內(nèi)的Na+泵出和將胞外的K+泵入，平衡細(xì)胞內(nèi)外Na+、K+，是生物電產(chǎn)生的基礎(chǔ)， 也是細(xì)胞膜繼發(fā)性主動轉(zhuǎn)動的能量來源；Ca2+-ATP的主要功能是將細(xì)胞內(nèi) Ca2+泵入肌漿網(wǎng)，它同Na+-Ca2+交換共同維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)。心肌肥厚時Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性下降，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+、Na+增多。胞內(nèi)Na+增多引起Na+-Ca2+交換增加，進一步加劇細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，從而引起心肌細(xì)胞凋亡[26]。

碳酸酐酶3（CA3）的可能生理作用主要有清除胞內(nèi)CO2、調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH值、維持組織酸堿平衡、抗氧化、能量代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面均發(fā)揮重要的作用。由于CA3具有磷酸酶活性作為一種的新的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶（PTP），它可能參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。鑒于PTP可作為酪氨酸激酶的天然拮抗劑，因此CA3很可能對依賴?yán)野彼崃姿峄男盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)通路會產(chǎn)生負(fù)面影響。而酪氨酸激酶與MAPK級聯(lián)反應(yīng)參與細(xì)胞的生長、增殖、分化，在高血壓左心室肥厚心肌中呈現(xiàn)高表達(dá)[27]。這種碳酸酐酶3水平的降低將導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，而增高將有助于抑制心肌細(xì)胞的進一步肥大、增生。

Transgelin也稱轉(zhuǎn)膠蛋白，是一種肌動蛋白壓力纖維素相關(guān)的蛋白質(zhì)，與凝膠劑起反應(yīng)并能穩(wěn)定體外的肌動蛋白凝膠劑。最本源功能是和肌動蛋白結(jié)合，從而參與細(xì)胞骨架重構(gòu)和調(diào)整?？山档蚏ho激酶相關(guān)信號通路并增加肌動蛋白解聚，最終降低肌球蛋白輕鏈磷酸化。在心肌肥厚時Rho激酶相關(guān)信號通路被激活，Rho mRNA呈現(xiàn)出高表達(dá)[28]。Transgelin基因敲除小鼠研究表明該基因敲除后能改變血管平滑肌形態(tài)，增加ROS表達(dá)，激活NF-KB 等炎癥通路[29]。

有報道顯示血紅蛋白-α（Hb-α）與脂多糖的相互反應(yīng)能使脂多糖的生物學(xué)活性顯著增加。此外脂多糖的致命性毒素的侵蝕性由Hb-α的出現(xiàn)而加強。Hb-α是通過裂解脂多糖來加強其生物學(xué)活性的。進一步的研究顯示交鏈Hb-α與?；瘍?nèi)毒素的相互反應(yīng)有靜電性也有非靜電的疏水性，這種性質(zhì)使內(nèi)毒素由非惰性轉(zhuǎn)為活性形式， 不同交聯(lián)Hb-α的濃度和不同的反應(yīng)溫度對Hb-α與內(nèi)毒素的反應(yīng)均有影響[30]。而脂多糖（LPS）廣泛存在的致熱原，是最常見誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的物質(zhì)之一，它能夠通過誘導(dǎo)NF-KB信號通路心肌細(xì)胞肥大[31]。在心室肥厚的作用有待進一步探索。

CD36基因（亦成為脂肪酸轉(zhuǎn)位酶基因）編碼有助于脂肪酸吸收及組織代謝的蛋白，在多種細(xì)胞表面表達(dá)，CD36在大鼠模型中對心肌有保護性作用。研究發(fā)現(xiàn)，CD36缺乏大鼠的心臟質(zhì)量/體重指數(shù)比正常大鼠高10%，并且CD36缺乏的大鼠心肌對缺血的耐受力下降，表明CD36與左心室肥大相關(guān)[32]。

整合素家族是一類細(xì)胞粘附受體蛋白，其不僅能夠介導(dǎo)細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間的粘附，還可以調(diào)節(jié)并整合胞內(nèi)外信號激活相關(guān)信號通路從而影響多種細(xì)胞生物學(xué)功能。心臟中的心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞都表達(dá)整合素， 研究表明， 整合素可以介導(dǎo)堿性成纖維生長因子（bFGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），而這兩種因子在促心肌細(xì)胞的肥大中重要的作用[33]。在心室肥厚的作用有待進一步探索。

集聚蛋白對免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白多糖具有聚集作用，將疏散狀態(tài)變成成簇狀態(tài)以至能緊密結(jié)合[34]。蜱抗凝血肽（TAP）是從毛白鈍緣蜱中分離的Xa因子的抑制劑。TAP是新型絲氨酸蛋白酶抑制劑，由60個氨基酸組成的單鏈酸性多肽，包括6個半胱氨酸殘基，體外實驗顯示能抑制正常人血漿的凝固。在心室肥厚中的變化有待進一步探討。

多項研究證實在高血壓狀態(tài)時C反應(yīng)蛋白水平增高，且具有促進心室肥厚的作用，本項目研究顯示在左室肥厚時下調(diào)，其反常變化需進一步探索。

4.3 SHR左心室肥厚的機制

血流動力學(xué)超負(fù)荷通過機械拉伸的直接作用及激活神經(jīng)體液因子的間接作用引起是引起高血壓左心室肥厚的起始動因。高血壓時心肌細(xì)胞受到機械拉伸力的作用。從而導(dǎo)致細(xì)胞膜、以及細(xì)胞器上離子通道、跨膜蛋白的的改變引起細(xì)胞內(nèi)因子及其介導(dǎo)的信號通路的傳導(dǎo)，而激活的信號途徑又會導(dǎo)致多種因子的活化，影響到細(xì)胞凋亡、炎性表達(dá)、細(xì)胞增殖分化，而促進心肌肥大，以代償機械拉伸力。由于增高血壓的持續(xù)性，導(dǎo)致細(xì)胞因子→信號途徑→細(xì)胞因子呈現(xiàn)出惡性循環(huán)狀態(tài)。本項目研究顯示主要涉及Ca2+介導(dǎo)的信號通路；有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路；蛋白激酶C（PKC）信號通路；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路；核因子-kb信號通路。

乙酰水解酶與乙酞水解酶屬血小板活化因子體系，兩者水平的上調(diào)表明血小板活化因子呈激活狀態(tài)這將介導(dǎo)蛋白激酶C（PKC）信號通路，另外14-3-3蛋白、纖維蛋白原、α2-AP蛋白水平上調(diào)也會激活PKC，過量表達(dá)的 PKC可顯著誘導(dǎo)心肌肥厚。

絲裂原活化蛋白激酶3、中性膽固醇酯水解酶1（nCEHs）、纖連蛋白（Fn）過度表達(dá)可以激活P38 MAPK途徑，而激肽原1、碳酸酐酶3（CA3）的低表達(dá)可以解除對P38 MAPK途徑抑制，過量表達(dá)的P38 MAPK途徑可以促進細(xì)胞的肥大以及基質(zhì)的增生。

纖維蛋白原水平上調(diào)可以激活ERK途徑，血清鋅α2糖蛋白（AG）水平下調(diào)可以解除脂聯(lián)素對ERK途徑的抑制，激活ERK途徑致使熱休克蛋白代償性增高，最終導(dǎo)致心室向心性肥厚。

14-3-3蛋白、纖維蛋白原水平上調(diào)可以激活Ca2+介導(dǎo)的信號通路，導(dǎo)致鈉鉀ATP水平水平降低，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，發(fā)生心肌肥厚。

血清鋅α2糖蛋白（ZAG）、載脂蛋白H水平下調(diào)導(dǎo)致AMPK途徑下調(diào)，而AMPK可以保護心肌缺血損傷， 限制各種因素所致的心肌肥厚。

中性膽固醇酯水解酶1（nCEHs）水平上調(diào)激活NF-kb途徑、膠轉(zhuǎn)蛋白水平下調(diào)可以解除對核因子NF-kb途徑抑制，共同導(dǎo)致NF-kb途徑表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致心肌肥厚。通過上述5條信號通路的協(xié)同作用，從心肌凋亡、細(xì)胞增殖增生、炎癥等不同角度導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白合成增加，細(xì)胞基底膜增生導(dǎo)致心室肥厚的發(fā)生，其余的蛋白則從促進抑制心肌肥厚蛋白降解（蛋白酶體），調(diào)節(jié)心肌能量代謝（HPPD、輔酶Q10），缺乏心肌保護（CD36）免疫反應(yīng)（Ighg3）促心肌肥厚的作用。

4.4 小結(jié)

通過前期研究[35]及對以上變化蛋白質(zhì)生物機制的研判：SHR左心室肥厚發(fā)生涉及心肌凋亡、細(xì)胞增殖增生、炎癥等多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致細(xì)胞損傷與保護作用失衡。

參考文獻(xiàn)：

[1] 熊興江.補腎降壓理論及補腎降壓方對自發(fā)性高血壓大鼠miR-1調(diào)控心室肥厚ERK通路的影響[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院，2013.

[2] NAGARAJU K， RABEN N， LOEFFLER L， et al. Conditional upregulation of MHC class I in skeletal muscle leads to self-sustaining autoimol/Lune myositis and myositis-specific autoantibodies. Proc Natl Acad Sci USA， 2000，97（16）：9209-9214.

[3] NINIO E. Phospholipid mediators in the vessel wall： involvement in atherosclerosis[J]. Curr Opin Clin Nutr Metab Care， 2005，8（2）：123-131.

[4] NAKANISHI H， SHHDOU H， HISHIKAWA D， et a1. Cloning and characterization of mouselung-type acyl-CoA： lysophosphatidylcholine acyltransferase 1（LPCATl）. Expression inalveolar type II cells and possible involvement in s-urfactant production[J]. J Biol Chem， 2006，281（29）：20140-20147.

[5] 黃朝陽，朱建華.絲裂原活化蛋白激酶信號途徑在心肌肥厚中的作用進[J].中國病理生理雜志，2005，21（4）：1435-1439.

[6] 余 鵬，涂 飛，張 霞，等.熱休克蛋白27心肌特異性高表達(dá)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生心肌肥厚[J].實用老年醫(yī)學(xué)，2014，28（6）：506-509.

[7] 潘偉男，陳 鋒，封 芬，等.14-3-3蛋白的研究進展[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志，2007，27（3）：262-265.

[8] 林 威.纖維蛋白原β-455G_A、Arg448Lys基因多態(tài)性與血漿纖維蛋白原濃度、下肢深靜脈血栓[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2009.

[9] BORG T K， BURGESS M L. Holding it all together：organization and function of the extracellular matrix in the heart[J]. Heart failure， 1993，9（8）：30-23.

[10] SAHINGUR S E， SHARMA A， G ENCO R J， et al. A ssociation of increased levels of fibrinogen and the 455G/A fib rinogen gene polym orphism with ch ronic periodontitis[J]. J Periodon to l， 2003， 74：329-337.

[11] 郭志坤，武俊芳，單衛(wèi)華，等.異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠肥厚心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)[J].解剖學(xué)報2012，43（1）：93-97.

[12] 張文斌，唐其柱，李 金.泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與心肌肥厚[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2014，43（11）：9-12.

[13] 孟 磊，譚艷美，袁中華.中性膽固醇酯水解酶與動脈粥樣硬化[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2015，43（2）：217-221.

[14] 馮 兵，王德文，何作云，等.細(xì)胞外間質(zhì)整合素在牽張刺激心肌細(xì)胞肥大中的作用[J].生物物理學(xué)報，2000，16（2）：346-351.

[15] 李亞楠，李京寶，商 澎，等.調(diào)控纖連蛋白表達(dá)的信號通路[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2013，35（1）：98-103.

[16] 饒志堅，袁海平，史仍飛.鋅α2糖蛋白生物學(xué)功能[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2014，30（12）：1197-1201.

[17] CHAN A， SOLTYS C L， YOUNG M， et al. Activation of AMP-activated protein kinase inhibits protein synthesis associated with hypertrophy in the cardiac myocyte[J]. J Biol Chem， 2004， 279（31）：32771-32779.

[18] 汪 濤，康 毅，婁建石.激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的心血管領(lǐng)域研究進展[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2003，17（6）：466-470.

[19] NIESSEN H W， LAGRAND W K， RENSINK H J， et al. Apolipoprotein H， a new mediator in the inflamol/Latory changes ensuring in jeopardised human myocardium[J]. Clin Pathol， 2000， 53（11）：863-867.

[20] 曲春雁.載脂蛋白H基因多態(tài)性與冠心病及血脂代謝關(guān)系的研究[D].青島：青島大學(xué)，2007.

[21] 陳懷霞.抗凝血酶-Ⅲ和肝素輔因子Ⅱ在兩種易栓性風(fēng)濕免疫病中的測定及意義[D].青島：青島大學(xué)，2012.

[22] 鄧明揚，張廣森.肝素輔因子Ⅱ的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)輸血及血液學(xué)分冊，2003，62（2）：128-131.

[23] 韓艷蠢.中國健康人群凝血因子XII正常值水平及其基因?qū)W研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)院，2015.

[24] 劉海春.HPPD酶結(jié)構(gòu)與功能理論研究及其抑制劑設(shè)計[D].杭州：浙江大學(xué)，2006.

[25] 桑艷雙，魏敏吉.輔酶Q10的生化作用機理和藥物臨床應(yīng)用進展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2005，7（5）：371-372.

[26] 黃志華，李良東，曾 靖，等.拳參正丁醇提取物對大鼠心肌肥厚時鈉鉀及鈣ATP酶活性的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21（1）：112-123.

[27] 尚西亮，鮑苑苑，任惠民，等.碳酸酐酶III在疾病和肌肉疲勞發(fā)生發(fā)展中的作用[J].生命科學(xué)，2011，23（5）：429-433.

[28] 管 楠，王文倩，徐玉東.肌動蛋白結(jié)合蛋白2 （Transgelin-2）生物學(xué)特性和功能研究進展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2015，15（14）：2774-2776，2779.

[29] 張 穎，王學(xué)春.Transgelin研究新進展[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報.2011，32（1）：78-80.

[30] 王 貝，韓世愈.血紅蛋白α、血紅蛋白β與卵巢癌的相關(guān)性[J]. 中國優(yōu)生與遺傳雜志，2008，16（11）：125-126.

[31] 周振華，王洪新，趙素玲，等.黃芪多糖對脂多糖誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大的保護作用[J].中草藥，2012，43（3）：524-528.

[32] IRIE H， KRUKENKAMP I B， BRINKMANN J F， et al. Myocardial recovery from ischemia is impaired in CD36 null mice and restored by myocyte CD36 expression or mediumchain fatty acids[J]. Proc Natl Acad Sci USA ， 2003， 100：6819-6824.

[33] 井 超.1miR-17/20a調(diào)控TGF-β通路抑制食管癌浸潤轉(zhuǎn)移的機制研究2.miR-92b調(diào)控ITGAV抑制食管癌浸潤轉(zhuǎn)移的機制研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2015.

[34] 武衛(wèi)華.蜱抗凝血肽RGDS雙功能分子的構(gòu)建和表達(dá)[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2004.

[35] 簡維雄，肖隋熙，劉 培，等.自發(fā)性高血壓大鼠左心室肥厚的代謝組學(xué)研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，38（4）：365-371.

（本文編輯 楊 瑛）