• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    賴氨酸C端內(nèi)切酶/胰蛋白酶順序酶切在蛋白質(zhì)組學(xué)樣本制備中的評估

    2017-04-06 17:40李倩馮鈺譚敏佳翟琳輝
    分析化學(xué) 2017年3期

    李倩 馮鈺 譚敏佳 翟琳輝

    摘要采用胰蛋白酶(Trypsin)單獨(dú)酶切與不同酶量的賴氨酸C端內(nèi)切酶(LysC/trypsin)順序酶切兩種方法, 對293T細(xì)胞全蛋白樣本進(jìn)行酶解消化, 系統(tǒng)評估LysC/trypsin順序酶切與Trypsin單一酶切在蛋白質(zhì)組學(xué)樣本制備中的差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, LysC/trypsin順序酶切不僅能顯著提高肽段和蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)目, 同時降低遺漏K酶切位點(diǎn)的數(shù)目及比例, 而且得到的肽段長度有利于質(zhì)譜鑒定, 蛋白質(zhì)覆蓋率明顯提升。 通過對酶的用量進(jìn)行優(yōu)化對比, 最終確定了LysC/trypsin順序酶切時酶的合理用量。本研究結(jié)果對提高蛋白質(zhì)組學(xué)樣本的制備質(zhì)量以及蛋白質(zhì)的序列鑒定覆蓋度具有指導(dǎo)意義。

    關(guān)鍵詞胰蛋白酶; 賴氨酸C端內(nèi)切酶; 順序酶切; 蛋白質(zhì)組學(xué); 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜; 遺漏酶切

    1引 言

    “鳥槍法”蛋白質(zhì)組學(xué)(Shotgun proteomics)鑒定, 是基于高效液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)的“自下而上”(Bottomup)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù), 具有高靈敏度、高通量的特點(diǎn)[1]。該技術(shù)將蛋白質(zhì)經(jīng)特定蛋白酶酶切消化成肽段, 采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LCMS/MS)進(jìn)行分析[2], 將檢測到的肽段圖譜與理論圖譜進(jìn)行匹配, 對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性與定量分析?;谫|(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究, 已經(jīng)建立了幾乎完整的酵母蛋白質(zhì)組表達(dá)譜[3], 并于2014年繪制了第一張人類蛋白質(zhì)組草圖[4]。目前, 臨床蛋白質(zhì)組學(xué)項(xiàng)目已經(jīng)完成了人類結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌等臨床組織的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的分析[5~7]。

    近十年來, “鳥槍法”蛋白質(zhì)組學(xué)在細(xì)胞裂解、肽段分離、質(zhì)譜碎裂方式、生物信息學(xué)分析手段等[8]方法學(xué)研究上取得了重大進(jìn)展, 然而在蛋白質(zhì)酶切中仍然多使用單一的蛋白酶—胰蛋白酶(Trypsin)。Trypsin可特異性識別并切割蛋白質(zhì)/多肽鏈中賴氨酸(K)或精氨酸(R)羧基端, 具有極高的位點(diǎn)特異性, 酶切產(chǎn)生的肽段主要以賴氨酸殘基或精氨酸殘基結(jié)尾, 這些肽段在酸性條件下容易帶二價或更高價態(tài)正電荷而被質(zhì)譜檢測, 因此Trypsin在Shotgun proteomics 研究中廣泛使用。然而, Trypsin也存在一些缺陷, 如酶切時切割蛋白質(zhì)不完全[9], 且切割K、R位點(diǎn)的效率不同, 尤其K酶切位點(diǎn)的遺漏酶切比例較高[10]。樣本制備體系中高濃度的鹽、表面活性劑等都可能抑制Trypsin的活性[9]。Trypsin的這些缺陷將直接影響蛋白質(zhì)鑒定的效率、質(zhì)譜分析的重現(xiàn)性和蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性。

    賴氨酸C端內(nèi)切酶(LysC)是特異性識別并切割賴氨酸羧基端的蛋白酶, 在強(qiáng)變性條件下仍然具有酶切活性[10]。LysC與Trypsin聯(lián)用, 能夠在一定程度上克服Trypsin的上述缺陷, 使得蛋白質(zhì)酶切更充分。1999年, Link等[11]首次提出將LysC與Trypsin聯(lián)合用于分析大分子復(fù)合物; 隨后, McDonald等[12]提出LysC/trypsin順序酶切(蛋白先經(jīng)LysC酶切, 再用Trypsin進(jìn)一步酶切)方法, 用于復(fù)雜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。Wada等[13]比較了十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)膠內(nèi)酶切時, LysC/trypsin順序酶切與Trypsin單獨(dú)酶切對蛋白鑒定結(jié)果的影響, 結(jié)果表明使用順序酶切得到的肽段長度適宜, 更易于從膠內(nèi)提取出來, 而且更利于質(zhì)譜鑒定。溶液內(nèi)酶切(In solution digestion)由于具有操作簡便、快捷、樣本損失量少等優(yōu)點(diǎn), 是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最為常用的酶切體系[15]。雖然LysC/trypsin順序酶切已廣泛用于溶液內(nèi)消化[16], 但目前很少有對溶液酶切條件下LysC/trypsin順序酶切與Trypsin單獨(dú)酶切進(jìn)行比較的研究報道。2012年, Wisniewski 等[14]使用FASP(Filter aided sample preparation)方法, 發(fā)現(xiàn)順序酶切得到的肽段總量增加了一倍, 且鑒定到的肽段數(shù)目、蛋白質(zhì)數(shù)目均有顯著增加。但該方法先用LysC在超濾管中對蛋白樣本進(jìn)行酶切, 之后離心收集酶切的肽段; 然后再向超濾管中加入Trypsin酶進(jìn)行消化后, 離心收集酶切好的肽段, 最后合并兩次離心得到的肽段樣本。顯然第一次離心收集的肽段因?yàn)閮H用LysC酶切, 得到的肽段中會含有較多的R位點(diǎn)漏切的肽段, 肽段也較長, 在一定程度上不利于質(zhì)譜檢測。Glatter等[17]研究了溶液內(nèi)LysC/trypsin順序酶切的優(yōu)勢, 認(rèn)為利用LysC/trypsin順序酶切能得到較多的全酶切肽段, 從而提高可定量蛋白質(zhì)的數(shù)目及定量結(jié)果的準(zhǔn)確性, 但該研究并沒有深入分析和探討LysC/trypsin順序酶切在蛋白質(zhì)組樣本鑒定方面的差異。目前, 對于LysC/trypsin順序酶切在蛋白質(zhì)組學(xué)樣本制備中的應(yīng)用仍然缺乏系統(tǒng)、全面的評估。

    在順序酶切時, 蛋白質(zhì)與酶的質(zhì)量比不同也可能會影響酶切效果, 常用的LysC質(zhì)量比和Trypsin質(zhì)量比例分別有100∶1和50∶1兩種[18~21]。然而不同酶用量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否有影響, 合適的酶用量是多少, 尚無詳細(xì)和深入的研究報道。

    本研究利用溶液內(nèi)酶切方式, 從鑒定到的肽段數(shù)目、蛋白質(zhì)數(shù)目、遺漏酶切位點(diǎn)數(shù)目、K/R遺漏酶切比例以及肽段長度和蛋白質(zhì)覆蓋率等多個方面, 評估了LysC/trypsin順序酶切與Trypsin單獨(dú)酶切的特性, 并比較了不同酶用量下對最終蛋白質(zhì)組學(xué)樣本檢測結(jié)果的影響, 優(yōu)化了酶切實(shí)驗(yàn)方案, 不僅大大提高了酶切效率, 而且也顯著提高了蛋白質(zhì)組學(xué)樣本的檢測效率和靈敏度。

    2實(shí)驗(yàn)部分

    2.1儀器與試劑

    Orbitrap Fusion三合一質(zhì)譜儀, EASYnLC 1000納升級液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司); DHP9052電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海善志儀器設(shè)備有限公司)。

    293T人腎上皮細(xì)胞(ATCC細(xì)胞庫); DMEM培養(yǎng)基(美國Introvigen公司); 尿素(色譜純)、NH4HCO3、半胱氨酸(純度97%)、色譜純?nèi)宜幔═FA)、質(zhì)譜級甲酸(FA)(德國SigmaAldrich公司); 蛋白酶抑制劑(瑞士Rocher公司); 二硫蘇糖醇(DTT, 純度99%)、碘乙酰胺(IAA, 純度98%)(比利時Acros Organics公司); 增強(qiáng)型BCA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司); 質(zhì)譜純乙腈(美國Thermo Fisher公司); 質(zhì)譜純LysC、Trypsin(北京華利世科技有限公司); 其它試劑均為色譜純。

    2.2實(shí)驗(yàn)方法

    293T細(xì)胞在含10%胎牛血清(FBS)、1×105 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)貼壁培養(yǎng)。生長至對數(shù)期后, 收集細(xì)胞, PBS緩沖溶液洗滌3次, 加入細(xì)胞裂解液(8 mol/L 尿素, 100 mmol/L NH4HCO3, 1×蛋白酶抑制劑, pH 8.0), 冰上裂解30 min, 超聲波破碎, 20000 g離心5 min, BCA法測定上清液蛋白質(zhì)濃度。加入5 mmol/L DTT, 56℃ 反應(yīng)30 min; 再加入15 mmol/L IAA, 避光條件下室溫反應(yīng)30 min; 最后加入30 mmol/L半胱氨酸, 室溫反應(yīng)30 min, 終止烷基化反應(yīng)。

    酶切消化過程分析進(jìn)行5組實(shí)驗(yàn), 第一組為Trypsin單獨(dú)酶切(Tryp50/tryp100), 其余四組為不同酶用量組合的LysC/trypsin順序酶切(LysC50/tryp50, LysC50/tryp100, LysC100/tryp50, LysC100/tryp100), 如圖1所示。Trypsin單獨(dú)酶切(Tryp50/tryp100)的方法為先將蛋白質(zhì)溶液稀釋4倍, 再按照蛋白質(zhì)與酶質(zhì)量比50∶1加入Trypsin (tryp50), 37℃反應(yīng)16 h后, 按照蛋白質(zhì)與酶質(zhì)量比100∶1補(bǔ)加Trypsin (tryp100), 37℃繼續(xù)反應(yīng)3 h。順序酶切的實(shí)驗(yàn)方法為: 蛋白質(zhì)溶液不經(jīng)稀釋直接按預(yù)定比例(LysC50表示蛋白質(zhì)與LysC的質(zhì)量比為50∶1, LysC100表示蛋白質(zhì)與LysC的質(zhì)量比為100:1)加入LysC, 37℃反應(yīng)3 h, 再將蛋白質(zhì)溶液稀釋4倍, 并按預(yù)定比例加入Trypsin, 37℃繼續(xù)反應(yīng)16 h。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。酶切后的肽段用C18脫鹽柱脫鹽, 轉(zhuǎn)干,

    2.3高效液相色譜和質(zhì)譜方法

    液相色譜分離分析柱為自制毛細(xì)管柱(75 μm×15 cm), 填充C18填料(3 μm粒徑, 100 Dikma Technologies)。流動相A: 甲酸乙腈水=0.1∶2∶98(V/V); 流動相B: 甲酸乙腈水(0.1∶98∶2, V/V)。梯度洗脫: 0~20 min, 8%~13% B; 20~51 min, 13%~26% B; 51~56 min, 26%~45% B; 56~57 min, 45%~80% B; 57~60 min, 80% B。流速: 300 nL/min。

    Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀, 正離子模式檢測, 離子傳輸毛細(xì)管的溫度為300℃, 歸一化碰撞能量為28%。采用數(shù)據(jù)依賴模式(Datadependent acquisition, DDA)進(jìn)行采集, 包含一次MS全掃描(m/z 350~m/z 1300), 分辨率R=120000(m/z 200), 對其中強(qiáng)度最高的10個峰進(jìn)行二級MS/MS掃描分析, 動態(tài)排除時間設(shè)置為60 s。

    2.4數(shù)據(jù)處理

    使用msconvert軟件將質(zhì)譜原始raw文件格式轉(zhuǎn)化為mgf文件。使用Mascot 2.3.0搜索引擎搜索, 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為Uniprot Human(版本: 20130507); 胰酶最大漏切位點(diǎn)數(shù)為2, 母離子質(zhì)量容差為10 ppm, 碎片離子質(zhì)量容差0.5 Da, 固定修飾為半胱氨酸的烷基化修飾, 甲硫氨酸的氧化和蛋白質(zhì)N端的乙?;癁榭勺冃揎棥2捎秒x子分?jǐn)?shù)20分篩選(cutoff)的方式進(jìn)行過濾, 控制蛋白水平的FDR(False discovery rate)為1%。

    3結(jié)果與討論

    3.1鑒定到的肽段數(shù)與蛋白數(shù)

    首先對其鑒定到的肽段匹配譜圖數(shù)(Peptidespectrum match, PSM)、非冗余肽段數(shù)目、蛋白獨(dú)有肽段數(shù)目和蛋白質(zhì)數(shù)目進(jìn)行對比分析, 結(jié)果如圖2A和2B所示, LysC/trypsin順序酶切的肽段鑒定數(shù)目、蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目等均比Trypsin單獨(dú)酶切高, 其中LysC100/tryp50組鑒定到的肽段數(shù)目、蛋白數(shù)目均最高。對順序酶切相比單獨(dú)酶切鑒定到的蛋白質(zhì)和肽段提升的比例進(jìn)行分析(圖2C和圖2D), 發(fā)現(xiàn)LysC100/tryp50組提高的比例為11%~14%, LysC50/tryp50組其次, 提高了4%~7%。表明采用順序酶切能夠使蛋白質(zhì)酶切消化更充分, 從而提高蛋白質(zhì)和肽段的鑒定水平。此外, 研究結(jié)果還顯示, 鑒定到的獨(dú)有肽段數(shù)目也顯著增加, 在進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析時可以進(jìn)一步提高定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    對比順序酶切不同組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(LysC50/tryp50組與LysC50/tryp100組, LysC100/tryp50組與LysC100/tryp100 組, 圖2C和圖2D), 發(fā)現(xiàn)當(dāng)增加第二步中使用的Trypsin量時, PSM數(shù)目、肽段鑒定數(shù)目、蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目等都有顯著提升, 說明在酶解過程中使用足量的Trypsin, 能進(jìn)一步確保蛋白質(zhì)的酶切程度, 對于提高蛋白鑒定水平具有顯著意義。但是, 對比LysC50/tryp100組與LysC100/tryp100組、 LysC50/tryp50組與LysC100/tryp50組的結(jié)果發(fā)現(xiàn), 增加第一步LysC酶的用量并不能提高最終的樣本檢測水平, 肽段、蛋白質(zhì)等的鑒定水平反而有所降低。推測是由于隨著第一步LysC酶的用量增加, 導(dǎo)致在第二步加入Trypsin進(jìn)行酶切時, LysC酶仍然保留有較強(qiáng)的酶切活性, 造成在該環(huán)節(jié)中LysC酶對Trypsin酶發(fā)生了一定的酶切反應(yīng), 從而降低了第二步Trypsin的酶切效率及程度。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在進(jìn)行順序酶切時, 第二步Trypsin酶切環(huán)節(jié)應(yīng)該使用足量的酶, 以保證蛋白質(zhì)被充分消化; 同時第一步加入LysC酶的量不宜過多, 避免其對Trypsin酶的切割, 導(dǎo)致樣本最終的酶解不徹底。

    3.2遺漏酶切位點(diǎn)數(shù)目及比例

    通過統(tǒng)計(jì)了各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果中遺漏酶切的位點(diǎn)數(shù)目及比例, 進(jìn)一步分析LysC/trypsin順序酶切比Trypsin單獨(dú)酶切能更有效提高鑒定肽段、蛋白質(zhì)數(shù)目的原因。如圖3所示, 使用Trypsin單獨(dú)酶切時, 遺漏酶切位點(diǎn)的比例約為27%, 其中近80%為K遺漏酶切位點(diǎn), 這與文獻(xiàn)[13]報道的結(jié)果相符。而進(jìn)行LysC/trypsin順序酶切時, K位點(diǎn)遺漏酶切的比例顯著降低。推測這不僅是由于LysC酶對賴氨酸具有高特異性酶切的特性, 而且在8 mol/L尿素的強(qiáng)變性條件下, 蛋白處于充分伸展?fàn)顟B(tài), 使LysC酶能更加充分的對蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切。因此, LysC酶和Trypsin酶進(jìn)行順序酶切能顯著降低遺漏酶切位點(diǎn)數(shù)目和K位點(diǎn)遺漏酶切的比例, 從而提高質(zhì)譜鑒定的重現(xiàn)性和定量分析的準(zhǔn)確性。

    3.3肽段長度分布

    利用質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)肽段樣本檢測時, 肽段過長或過短都不利于質(zhì)譜檢測與鑒定。對各組實(shí)驗(yàn)鑒定到的肽段長度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果如圖4所示。LysC50/tryp50與LysC100/tryp50兩組鑒定到肽段的長度集中在7~21氨基酸殘基(aa), 且此長度區(qū)間的肽段數(shù)目明顯高于其它3組, 而長度大于32 aa的肽段數(shù)目明顯低于其余3組。對比LysC50/tryp50組與LysC50/tryp100組、LysC100/tryp50組與LysC100/tryp100組發(fā)現(xiàn), 當(dāng)?shù)诙絋rypsin酶使用量少時, 樣本中鑒定到的肽段長度普遍較長, 統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)主要是由于產(chǎn)生的遺漏酶切肽段較多導(dǎo)致的, 這與上文中當(dāng)Trypsin酶的用量減少時導(dǎo)致的遺漏酶切比例升高的現(xiàn)象一致。

    3.4蛋白質(zhì)序列覆蓋度

    在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析中, 蛋白質(zhì)鑒定和定量的準(zhǔn)確性與蛋白質(zhì)序列的鑒定覆蓋度密切相關(guān)。分別統(tǒng)計(jì)了各實(shí)驗(yàn)組中蛋白序列覆蓋度在20~30%、30~40%、>40%區(qū)間的蛋白數(shù)目, 結(jié)果見圖5。第二步Trypsin使用量較高的兩組(LysC50/tryp50組與LysC100/tryp50組), 在以上蛋白質(zhì)序列覆蓋度區(qū)間的蛋白數(shù)均最高, 說明順序酶切時第二步使用足量的Trypsin能夠增加蛋白質(zhì)的序列覆蓋度, 進(jìn)一步證明其使得蛋白質(zhì)被酶切的更加完全。此外, 序列覆蓋度較高(>30%)的蛋白質(zhì)中, LysC50/tryp50組的蛋白質(zhì)數(shù)目均低于LysC100/tryp50組的數(shù)目, 提示第一步LysC酶的用量增大會導(dǎo)致第二步Trypsin效率的降低, 從而使得鑒定到的蛋白序列覆蓋度低。

    4結(jié) 論

    本研究從鑒定蛋白質(zhì)數(shù)目、肽段數(shù)目、遺漏酶切位點(diǎn)數(shù)目與比例、肽段長度和蛋白質(zhì)序列覆蓋度等方面, 對蛋白質(zhì)組學(xué)樣品溶液消化中的順序酶切與單獨(dú)酶切方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明, 順序酶切能夠使蛋白質(zhì)被酶切的更完全, 從而降低遺漏酶切位點(diǎn)數(shù)目, 得到的肽段長度有利于進(jìn)行質(zhì)譜鑒定, 肽段數(shù)目、蛋白質(zhì)數(shù)目以及蛋白質(zhì)序列覆蓋度均有所增加。順序酶切時, 所用的酶量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響, 第二步使用足量的Trypsin能夠更充分酶切蛋白質(zhì), 而第一步使用過量的LysC反而會影響到隨后Trypsin的酶切效果, 使得蛋白質(zhì)的酶切程度不徹底。本研究結(jié)果為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ), 對于提高蛋白組學(xué)樣本檢測的效率和靈敏度, 以及蛋白質(zhì)組學(xué)的定量分析準(zhǔn)確性具有參考意義。

    References

    1Malmstrm E, Kilsgrd O, Hauri S, Smeds E, Herwald H, Malmstrm L, Malmstrm J. Nat. Commun., 2016, 7: 10261-10270

    2Link A J, Eng J, Schieltz D M, Carmack E, Mize G J, Morris D R, Garvik B M, Yates J R. Nat. Biotechnol., 1999, 17(7): 676-682

    3de Godoy L M, Olsen J V, Cox J, Nielsen M L, Hubner N C, Mann M. Nature, 2008, 455(7217): 1251-1254

    4Wilhelm M, Schlegl J, Hahne H, Gholami A M, Lieberenz M, Butzmann L, Gerstmair A, Faerber F, Kuster B. Nature, 2014, 509(7502): 582-587

    5Zhang B, Wang J, Wang X, Zhu J, Liu Q, Shi Z, Chambers M C, Davies S R, Coffey R J, Slebos R J, Liebler D C. Nature, 2014, 513(7518): 382-387

    6Lawrence R T, Perez E M, Hernandez D, Miller C P, Haas K M, Irie H Y, Lee S I, Blau C A, Villen J. Cell. Rep., 2015, 11(4): 630-644

    7Lawrence R T, Perez E M, Hernandez D, Miller C P, Haas K M, Irie H Y, Lee S I, Blau C A, Villen J. Nat. Commun., 2016, 7: 12645

    8Tsiatsiani L, Heck A J. FEBS. J., 2015, 282(14): 2612-2626

    9Saveliev S, Bratz M, Zubarev R. Nat. Methods, 2013, 10 (11): i-ii

    10Huesgen P F, Lange P F, Rogers L D. Nat. Methods, 2015, 12(1): 55-58

    11Link A J, Eng J, Schieltz D M, Carmack E, Morris D R, Garvik B M, Yates J R. Nat. Biotechnol., 1999, 17(7): 676-682

    12McDonald W H, Ohi R, Miyamoto D T, Mitchison T J, Yates J R. Int. J. Mass. Spectrom., 2002, 219: 245-251

    13Wada Y, Kadoya M. J. Mass. Spectrom., 2003, 38(1): 117-118

    14Wisniewski J R, Mann M. Anal. Chem., 2012, 84(6): 2631-2367

    15Wisniewski J R, Zougman A, Nagaraj N, Mann M. Nat. Methods, 2009, 6(5): 359-362

    16Scheltema R A, Hauschild J P, Lange O, Makarov A, Mann M. Mol. Cell. Proteomics, 2014, 13(12): 3698-3708

    17Glatter T, Ludwig C, Ahrné E, Aebersold R, Heck A J, Schmidt A. J. Proteome Res., 2012, 11(11): 5145-5156

    18Mertins P, Mani D R, Ruggles K V, Gillette M A, Paulovich A G, Fenyo D, Ellis M J, Carr S A. Nature, 2016, 534(7605): 55-62

    19Cox J, Hein M Y, Luber C A, Paron I, Nagaraj N, Mann M. Mol. Cell. Proteomics, 2014, 13(9): 2513-2526

    20Paulo J A, Gigy S P. Proteomics, 2015, 15(23): 474-486

    21Hebert A S, Richards A L, Coon J J. Mol. Cell. Proteomics, 2014, 13(1): 339-347

    AbstractEndoproteinase LysC/trypsin sequential digestion and trypsin digestion were used in 293T cell proteomics sample preparation and the results of LysC/trypsin sequential digestion and trypsin digestion in proteomics sample preparation was systematically evaluated. It was found that the number of identified peptides and proteins increased significantly, and missed cleavage sites, especially K sites decreased dramatically through LysC/trypsin sequential digestion. And the average sequence coverage of identified proteins in LysC/trypsin sequential digestion sample was higher than that in trypsin digestion sample. Besides, different amount of enzymes was tested to select the optimal usage of enzymes in LysC/trypsin sequential digestion. This study provided the references for proteomics sample preparation.

    KeywordsTrypsin; LysC; Sequential digestion; Proteomics; Liquid chromatographytandem mass spectrometry; Missed cleavage

    av国产久精品久网站免费入址| 欧美变态另类bdsm刘玥| 青春草国产在线视频| 国产精品久久久久成人av| 久久久久久久精品精品| 欧美日韩一级在线毛片| 久久久久人妻精品一区果冻| av电影中文网址| 亚洲av综合色区一区| 在线观看免费视频网站a站| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| av在线观看视频网站免费| 一级片'在线观看视频| 国产在视频线精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久女婷五月综合色啪小说| 色婷婷av一区二区三区视频| 我要看黄色一级片免费的| 久久精品国产a三级三级三级| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 亚洲精品一二三| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品久久久久成人av| 高清在线视频一区二区三区| 久久人妻熟女aⅴ| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 人人澡人人妻人| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲,欧美精品.| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美成人午夜免费资源| 叶爱在线成人免费视频播放| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 9191精品国产免费久久| 国产野战对白在线观看| 在线看a的网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 好男人视频免费观看在线| 丝瓜视频免费看黄片| www.av在线官网国产| 国产 一区精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 99热全是精品| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美日韩精品成人综合77777| 黑人欧美特级aaaaaa片| 18禁动态无遮挡网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 欧美日韩视频精品一区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产成人欧美| 欧美日本中文国产一区发布| 久久这里只有精品19| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲久久久国产精品| 黄片无遮挡物在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 中文字幕亚洲精品专区| 叶爱在线成人免费视频播放| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 秋霞在线观看毛片| 在线天堂中文资源库| 久久精品国产自在天天线| 高清不卡的av网站| 日本91视频免费播放| 美女脱内裤让男人舔精品视频| av片东京热男人的天堂| 久久国内精品自在自线图片| 午夜免费观看性视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品欧美亚洲77777| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 人妻 亚洲 视频| 国产成人精品久久二区二区91 | 亚洲欧洲日产国产| 超碰97精品在线观看| 国产在线视频一区二区| 精品国产一区二区久久| 亚洲精品国产av成人精品| 天天影视国产精品| 国产极品天堂在线| 久久韩国三级中文字幕| 色吧在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| h视频一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久ye,这里只有精品| 日韩一区二区三区影片| 亚洲中文av在线| 精品国产一区二区久久| av电影中文网址| 一级爰片在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 黄片播放在线免费| 久久精品人人爽人人爽视色| 性高湖久久久久久久久免费观看| 99热网站在线观看| 综合色丁香网| 下体分泌物呈黄色| 精品少妇内射三级| 亚洲情色 制服丝袜| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产亚洲欧美精品永久| 久久影院123| 精品久久久精品久久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 中文字幕亚洲精品专区| 国产av一区二区精品久久| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产黄色免费在线视频| 日本wwww免费看| 国产高清国产精品国产三级| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产成人欧美| 一区福利在线观看| 国产欧美亚洲国产| 午夜日本视频在线| 精品久久蜜臀av无| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产一级毛片在线| 久久人妻熟女aⅴ| www.精华液| 国产亚洲一区二区精品| 久久久久久久久久人人人人人人| av一本久久久久| 亚洲成人一二三区av| www.av在线官网国产| 七月丁香在线播放| 男人爽女人下面视频在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 青草久久国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产探花极品一区二区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 欧美国产精品一级二级三级| 性色av一级| 99re6热这里在线精品视频| 国产国语露脸激情在线看| av电影中文网址| 在线观看免费视频网站a站| 国产黄频视频在线观看| 亚洲综合精品二区| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲综合色惰| 啦啦啦啦在线视频资源| 黄频高清免费视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲精品一区蜜桃| 只有这里有精品99| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久久a久久爽久久v久久| av网站免费在线观看视频| 一区二区三区四区激情视频| 精品一品国产午夜福利视频| 人人妻人人澡人人看| 春色校园在线视频观看| 亚洲,欧美,日韩| 少妇人妻久久综合中文| 激情视频va一区二区三区| 国产成人精品福利久久| 免费av中文字幕在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美精品一区二区大全| 国产成人免费无遮挡视频| 丝袜喷水一区| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美在线黄色| av福利片在线| 秋霞在线观看毛片| 国产熟女欧美一区二区| 国产成人av激情在线播放| av在线app专区| 一级片免费观看大全| 精品少妇久久久久久888优播| videos熟女内射| 母亲3免费完整高清在线观看 | 亚洲精品一二三| 少妇人妻 视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 宅男免费午夜| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 中文字幕人妻丝袜制服| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 波多野结衣一区麻豆| 日韩免费高清中文字幕av| 国产午夜精品一二区理论片| av免费在线看不卡| 蜜桃国产av成人99| 男女边摸边吃奶| 国产成人免费无遮挡视频| 日韩电影二区| 美女国产视频在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日韩欧美精品免费久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 热99国产精品久久久久久7| 黄片小视频在线播放| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 高清av免费在线| 在线观看一区二区三区激情| 日本av免费视频播放| 亚洲综合精品二区| 国产一区二区激情短视频 | 欧美黄色片欧美黄色片| 国产男女内射视频| 十八禁高潮呻吟视频| 国产黄色免费在线视频| 春色校园在线视频观看| 黄色配什么色好看| 丰满乱子伦码专区| 丝袜喷水一区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 午夜老司机福利剧场| 尾随美女入室| 中文字幕色久视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产成人免费无遮挡视频| 在线观看免费视频网站a站| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲一区中文字幕在线| 黄色配什么色好看| 精品午夜福利在线看| 国产精品蜜桃在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 国产av国产精品国产| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 2022亚洲国产成人精品| 五月天丁香电影| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 少妇的丰满在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 在线看a的网站| 日日爽夜夜爽网站| 伦精品一区二区三区| 精品久久蜜臀av无| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲一区中文字幕在线| 国产精品.久久久| 一级片'在线观看视频| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲精品视频女| 毛片一级片免费看久久久久| 不卡视频在线观看欧美| 国产高清国产精品国产三级| 日韩欧美一区视频在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久久久久人妻| 男女啪啪激烈高潮av片| av电影中文网址| 欧美人与善性xxx| 亚洲综合色网址| 如何舔出高潮| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产有黄有色有爽视频| 99久久综合免费| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久久久国产一级毛片高清牌| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区国产| 满18在线观看网站| 高清欧美精品videossex| 深夜精品福利| 多毛熟女@视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产成人精品福利久久| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久99精品国语久久久| a级毛片黄视频| 免费大片黄手机在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 如何舔出高潮| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 五月天丁香电影| 精品酒店卫生间| av一本久久久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 一区在线观看完整版| 亚洲欧美一区二区三区国产| 黄频高清免费视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 最近的中文字幕免费完整| 久久久久久久久久久免费av| 久久精品久久精品一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 999精品在线视频| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 男女啪啪激烈高潮av片| 99久国产av精品国产电影| 免费大片黄手机在线观看| 色哟哟·www| 日日啪夜夜爽| 五月伊人婷婷丁香| 激情视频va一区二区三区| 寂寞人妻少妇视频99o| 国精品久久久久久国模美| 赤兔流量卡办理| 一级毛片 在线播放| 激情视频va一区二区三区| 久久99一区二区三区| 午夜福利视频精品| 亚洲久久久国产精品| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美成人午夜免费资源| 国产熟女午夜一区二区三区| 人妻少妇偷人精品九色| 免费观看av网站的网址| 美女福利国产在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产1区2区3区精品| 亚洲精品一二三| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久精品国产综合久久久| 亚洲第一青青草原| 国产精品免费大片| 男女午夜视频在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲精品,欧美精品| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲经典国产精华液单| 中文字幕av电影在线播放| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 伊人久久国产一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲成人一二三区av| 精品人妻偷拍中文字幕| 男人爽女人下面视频在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美精品国产亚洲| 国产一区有黄有色的免费视频| 人人妻人人澡人人看| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久99精品国语久久久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩av在线免费看完整版不卡| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久久久久久久久人人人人人人| 毛片一级片免费看久久久久| 久久女婷五月综合色啪小说| av电影中文网址| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲伊人色综图| 搡女人真爽免费视频火全软件| 男人舔女人的私密视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| av线在线观看网站| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 欧美激情高清一区二区三区 | 丝袜喷水一区| 一级片'在线观看视频| 欧美在线黄色| 欧美另类一区| 国产毛片在线视频| 国产综合精华液| 国产成人一区二区在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 在线精品无人区一区二区三| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲中文av在线| 国产精品久久久久久av不卡| 黑丝袜美女国产一区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 香蕉丝袜av| 我要看黄色一级片免费的| 日本-黄色视频高清免费观看| 日韩免费高清中文字幕av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 不卡av一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久男人| 一本久久精品| 男女下面插进去视频免费观看| 下体分泌物呈黄色| 日韩一本色道免费dvd| 少妇熟女欧美另类| 国产精品一国产av| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产深夜福利视频在线观看| av.在线天堂| 黄色怎么调成土黄色| 18+在线观看网站| 欧美精品国产亚洲| 18禁观看日本| 日韩av不卡免费在线播放| 国产成人a∨麻豆精品| 熟女av电影| 亚洲av男天堂| 桃花免费在线播放| 久久午夜福利片| 两个人免费观看高清视频| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲综合精品二区| kizo精华| 一本色道久久久久久精品综合| 国产精品久久久久久久久免| av网站免费在线观看视频| 男男h啪啪无遮挡| 欧美人与善性xxx| 国产片内射在线| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产精品偷伦视频观看了| av女优亚洲男人天堂| 制服丝袜香蕉在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 两性夫妻黄色片| 丝袜在线中文字幕| 亚洲综合色惰| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产亚洲最大av| 深夜精品福利| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久韩国三级中文字幕| 久久久精品免费免费高清| 制服人妻中文乱码| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本av手机在线免费观看| 亚洲经典国产精华液单| 在现免费观看毛片| 午夜日本视频在线| 丝袜在线中文字幕| 美女国产视频在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 精品第一国产精品| 亚洲中文av在线| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲av国产av综合av卡| 丝袜在线中文字幕| 成人国语在线视频| 人妻 亚洲 视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久久久精品性色| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 丝袜在线中文字幕| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产成人精品福利久久| 欧美国产精品va在线观看不卡| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久久久久人人人人人| 成人国语在线视频| 国产不卡av网站在线观看| 免费观看性生交大片5| 亚洲成人av在线免费| 人妻少妇偷人精品九色| 免费观看a级毛片全部| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 大话2 男鬼变身卡| 啦啦啦啦在线视频资源| 七月丁香在线播放| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 精品国产一区二区久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 一级毛片电影观看| 精品酒店卫生间| 热99国产精品久久久久久7| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产av一区二区精品久久| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 女人久久www免费人成看片| 在现免费观看毛片| 两性夫妻黄色片| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久ye,这里只有精品| 黄色一级大片看看| 老司机影院成人| 国产精品成人在线| 日本91视频免费播放| 男女高潮啪啪啪动态图| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久久精品亚洲av国产电影网| 高清在线视频一区二区三区| 伦理电影免费视频| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国精品久久久久久国模美| 永久网站在线| 三级国产精品片| 日韩制服骚丝袜av| 丁香六月天网| 伦理电影免费视频| 亚洲成人av在线免费| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 免费少妇av软件| 久久久久久久久免费视频了| 免费观看在线日韩| 韩国高清视频一区二区三区| 中国三级夫妇交换| 亚洲欧美成人精品一区二区| 毛片一级片免费看久久久久| 久久久久久久久久久久大奶| 九九爱精品视频在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 国产一区二区三区综合在线观看| 女性被躁到高潮视频| 午夜av观看不卡| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲国产精品一区三区| 精品国产乱码久久久久久男人| 三级国产精品片| 一级毛片 在线播放| 亚洲,欧美精品.| 美国免费a级毛片| 免费人妻精品一区二区三区视频| 97在线人人人人妻| 成人漫画全彩无遮挡| 精品国产乱码久久久久久男人| 韩国高清视频一区二区三区| 久久久久视频综合| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲国产精品成人久久小说| 人人妻人人澡人人看| 少妇的逼水好多| 国产一区二区三区综合在线观看| 老司机亚洲免费影院| 黄片无遮挡物在线观看| 免费少妇av软件| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品久久久久久久久免| 国产成人精品婷婷| www.av在线官网国产| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲欧洲国产日韩| 少妇的逼水好多| 一级毛片我不卡| 久久精品亚洲av国产电影网| 天天影视国产精品| av国产精品久久久久影院| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| √禁漫天堂资源中文www| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久久久网色| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 午夜老司机福利剧场| 91aial.com中文字幕在线观看| 精品一区二区三卡| 中文字幕av电影在线播放| 日韩av在线免费看完整版不卡| av在线app专区| 午夜免费鲁丝| 久久久久久久久久久久大奶| 高清在线视频一区二区三区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产视频首页在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产成人欧美| 欧美国产精品一级二级三级| 人体艺术视频欧美日本| 另类精品久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 90打野战视频偷拍视频| 在线观看www视频免费| 高清av免费在线| 久久久久久久久久人人人人人人| 免费看av在线观看网站| www.精华液| 精品国产露脸久久av麻豆| 免费看av在线观看网站| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 五月开心婷婷网| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 90打野战视频偷拍视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 国产成人一区二区在线| 亚洲国产最新在线播放| 精品福利永久在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品人妻久久久影院| 女人久久www免费人成看片|