補腎化瘀方對多囊卵巢綜合征大鼠血清25羥基維生素D3、AMH、T、INS及E2的影響

黃威　魯耀邦　熊樺　崔培梧

〔摘要〕 目的 研究補腎化瘀方對多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）模型大鼠血清25羥基維生素D3[25-（OH）VD3]、抗苗勒管激素（AMH）、血清睪酮（T）、胰島素（INS）及雌二醇（E2）的影響。方法 61只SD雌性大鼠隨機選取8只設(shè)為空白組，剩余大鼠采用來曲唑灌胃法建立PCOS大鼠模型。成模后大鼠隨機分為模型組、中藥組及西藥組，給予相應(yīng)藥物干預(yù)后腹主動脈取血。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定藥物干預(yù)后各組大鼠血清激素[25-（OH）VD3、AMH、T、INS、E2]含量，分析各組血清激素水平的差異。結(jié)果 空白組、中藥組以及西藥組的血清E2與25（OH）VD3濃度高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），而AMH與INS濃度均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 補腎化瘀方對灌服來曲唑所致PCOS模型大鼠血清AMH、INS、25（OH）VD3與E2等激素水平有調(diào)節(jié)作用，能有效改善PCOS的無排卵、卵泡發(fā)育停滯及糖脂代謝紊亂等問題。

〔關(guān)鍵詞〕 多囊卵巢綜合征；25羥基維生素D3；抗苗勒管激素；睪酮；胰島素；雌二醇

〔中圖分類號〕R271；R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.009

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Bushen Huayu decoction on serum vitamin D3， adrenal medullary hyperplasia （AMH）， testosterone （T）， insulin （INS） and estradiol （E2） in polycystic ovary syndrome （PCOS） rats. Methods Eight rats were randomly selected from 61 SD female as the blank group. The remaining rats by gastric perfusion of letrozole were to establishment of PCOS rat models. After modeling， the rats were randomly divided into the model group， the Chinese medicine group and the Western medicine group. The blood of abdominal aorta was taken after the intervention of the corresponding drug intervention. The serum levels of 25（OH）VD3， AMH， T， INS， and E2 in each group after drug intervention were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The difference of serum levels in each group was analyzed. Results The concentrations of serum E2 and 25（OH）VD3 in the blank group， the Chinese medicine group and the western medicine group were higher than those in the model group， the results were significantly different （P<0.05 or P<0.01）. The serum AMH and INS concentrations in the three groups were lower than those in the model group， which were significantly different （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Bushen Huayu decoction can regulate the levels of AMH， INS， 25 （OH）VD3 and E2 in the serum of letrozole-induced polycystic ovary syndrome（PCOS） rat models， which can effectively improve PCOS's anovulatory， follicular development stagnation and disorder of glycolipid metabolism.

〔Keywords〕 polycystic ovary syndrome； 25 （OH） VD3； anti-miillerian hormone； T； INS； E2

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）已成為婦科臨床常見內(nèi)分泌及代謝紊亂性疾病。該病在育齡婦女中發(fā)病率為5%～10%，導(dǎo)致無排卵性不孕的機率為75%，目前其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[1]。補腎化瘀方為尤昭玲教授治療PCOS患者的經(jīng)驗方，臨床案例及動物實驗均顯示其能有效改善PCOS[2-3]。近年來，有研究表明PCOS患者的血清25（OH）VD3水平偏低[4]，而抗苗勒管激素（AMH）水平是正常女性2～3倍[5]。本實驗通過研究補腎化瘀方對PCOS模型大鼠血清25羥基維生素D3[25-（OH）VD3]、抗苗勒管激素（AMH）、睪酮（T）、雌二醇（E2）、胰島素（INS）水平的影響，探討補腎化瘀方改善PCOS的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

TGL16M型高速低溫離心機（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）、海爾-86 ℃超低溫冰箱（海爾公司）、 SC-316（商流）冷藏冰箱（海爾公司）、ELx800酶標儀（美國寶特Bio-Tek公司）。

1.2 藥品與試劑

來曲唑（批號：16113057，規(guī)格：25 mg/片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）、補腎化瘀湯每劑含生藥85 g（處方調(diào)整為紫石英15 g，補骨脂8 g，澤蘭8 g，菟絲子8 g，澤瀉8 g，桑寄生8 g，土鱉蟲8 g，覆盆子8 g，茺蔚子5 g，三七3 g，蓮子心3 g，甘草3 g），以上兩種藥物均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；炔雌醇環(huán)丙孕酮片（達英-35）（批號：331B，規(guī)格：2 mg/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司）購自養(yǎng)天和大藥房；AMH、T、E2、25（OH）VD3、INS檢測免疫試劑盒均由上海紀寧實業(yè)有限公司提供；水合氯醛由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。

1.3 動物

60日齡的SPF級雌性SD大鼠61只，體質(zhì)量（226.690±0.008） g，許可證號SCXK（湘）2014-0011，飼料墊料均由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心動物房飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 PCOS大鼠模型建立

隨機選取53只SD雌性大鼠，按照8 mL/kg劑量灌服濃度為0.125 mg/mL的來曲唑—羧甲基纖維素溶液[6]，每天1次，共21 d。其余8只按照8 mL/kg（大鼠體質(zhì)量）的劑量同期灌服1%羧甲基纖維素水溶液，每天1次，共21 d。隨機取3只造模大鼠，通過觀察光鏡下卵巢組織形態(tài)驗證模型是否成功。

2.2 藥物干預(yù)

剩余模型大鼠隨機分為三組，模型組16只大鼠按1 mL/150 g灌服生理鹽水；中藥組17只大鼠按1 mL/150 g灌服1.32 g/mL中藥湯液；西藥組17只大鼠按1 mL/150 g灌服0.0317 mg/mL達英-35?？瞻捉M8只大鼠按1 mL/150 g灌服生理鹽水。四組均為1次/d，連續(xù)灌服3 d后停藥1 d，為1周期。共16個周期。

2.3 標本采集

藥物干預(yù)結(jié)束后，停食1 d。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后腹主動脈取血，待血液凝固后，4 500 g， 低溫離心5 min，取上清凍存于-85 ℃冰箱備用。

2.4 血清指標檢測

將凍存的血清（空白組5只，模型組、中藥組、西藥組6只）于4 ℃冰箱解凍，采用酶聯(lián)免疫吸附法，按試劑盒說明書操作分別檢測血清25（OH）VD3、AMH、T、INS、E2等激素水平；每個樣本平行測量3次后取均值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)用“x±s”表示。組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnetts T3檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 PCOS大鼠模型驗證

肉眼觀察模型大鼠的卵巢表面泛白；光鏡下查看卵巢組織形態(tài)：卵泡發(fā)育停滯且卵巢呈多囊性擴張，卵泡內(nèi)未見卵細胞為空卵泡，另見大量小竇狀卵泡集聚，符合多囊卵巢綜合征的卵巢組織形態(tài)病變，表明造模成功。見圖1。

3.2 各組大鼠血清激素檢驗結(jié)果

與空白組比較，模型組血清25（OH）VD3、E2水平均降低，AMH、INS水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；與模型組相比，中藥組、西藥組的血清激素25（OH）VD3、E2濃度均升高，而血清AMH、INS濃度均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，其他3組的血清激素T濃度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。西藥組與中藥組比較，血清各激素水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

4 討論

當前，PCOS已成為婦科臨床最為常見的內(nèi)分泌及代謝紊亂性疾病之一，其不僅導(dǎo)致育齡期婦女不孕不育，還能增加患者罹患心腦血管疾病和婦科腫瘤的風(fēng)險[7]。因該病的病因病機較為復(fù)雜且病患的癥狀表征具有高度特異性，目前對于該病尚未有明確的治療方針。短期內(nèi)治愈該病的幾率極低，大多數(shù)的治療方案是從調(diào)節(jié)患者激素紊亂，改善PCOS癥狀著手。PCOS的重要表現(xiàn)為卵巢病變，而在卵泡發(fā)育過程中，AMH的抑制作用可導(dǎo)致卵泡發(fā)育停滯和無排卵現(xiàn)象的發(fā)生[8]。近年來，AMH檢測在婦科臨床上具有重要意義，特別是在輔助診斷PCOS與藥物療效方面[9-11]。目前研究顯示，PCOS患者除內(nèi)分泌紊亂外，還存在糖、脂及蛋白質(zhì)代謝紊亂問題[12]。而25（OH）VD3參與糖脂代謝過程，另有一些研究表明，維生素D的缺乏可能是PCOS的病因之一[13-15]。

本次實驗結(jié)果表明：與模型組相比，中藥組與西藥組的大鼠血清AMH及INS水平顯著性下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。而25（OH）VD3與E2水平與之相反，中藥組和西藥組血清激素較模型組顯著上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。雖然模型組與其他三組的血清T水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但模型組的血清T水平均高于其他三組，值得關(guān)注的是，中藥組血清T水平與空白組相近。通過該實驗結(jié)果可以看出，中藥組的激素水平與空白組更為接近，說明補腎化瘀方在調(diào)節(jié)激素水平方面較西藥治療有較大的優(yōu)勢。

綜上所述，補腎化瘀方改善PCOS的作用機制可能與調(diào)節(jié)PCOS模型大鼠體內(nèi)T、INS、E2水平，促進排卵，誘導(dǎo)卵細胞生長發(fā)育；降低AMH水平，促進卵泡發(fā)育，增加優(yōu)勢卵泡；升高25（OH）VD3水平，改善PCOS導(dǎo)致的糖脂代謝紊亂相關(guān)問題有關(guān)。當然，要探討更深層次的作用機制尚需進行代謝組學(xué)、基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)等后續(xù)的實驗研究。

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