LC—MS/MS法同時(shí)測(cè)定回春育子顆粒中9種成分的含量

薛剛強(qiáng) 曹寶帥 高淑麗 張健 潘新艷

中圖分類號(hào) R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）09-1213-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.15

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定回春育子顆粒中9種成分含量的方法。方法：采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法。色譜柱為Shim-pack XR-ODS C18，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為5 ?L，離子源為電噴霧離子源，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；其中阿魏酸、蘆丁、丹皮酚、淫羊藿苷、五味子醇甲以乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫，正離子模式監(jiān)測(cè)；柚皮苷、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷和原兒茶酸采用甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)。結(jié)果：阿魏酸、蘆丁、丹皮酚、淫羊藿苷、五味子醇甲、柚皮苷、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷和原兒茶酸檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.499 5～500、25～1 000、0.245 9～250、5.185 1～1 000、0.981 9～1 000、0.248 1～125、2.510 4～250、10～2 500、4.999 7～1 000 ng/mL（r≥0.997 8），檢測(cè)限分別為0.075、0.30、0.072、0.015、0.015、0.075、0.15、0.30、0.15 ng/mL，定量限分別為0.25、1.00、0.24、0.51、0.49、0.25、0.50、0.99、0.49 ng/mL；回收率在91.39%～103.56%之間（RSD為1.03%～3.67%，n=6），室溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD為1.4%～3.4%（n=6）。結(jié)論：該方法快速、靈敏，重復(fù)性好，可用于回春育子顆粒中9種成分的含量測(cè)定，可用于回春育子顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 回春育子顆粒；成分；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；質(zhì)量控制；含量測(cè)定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of 9 components in Huichun yuzi granules. METHODS： LC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on Shim-pack XR-ODS C18 column with column temperature of 30 ℃. The sample size was 5 ?L， and ion source as electrospray ion source； MRM mode was adopted. The acetonitrile-water was used as mobile phase for ferulic acid， rutin， paeonol， icariin and schisandrin （gradient elution）； positive ion mode monitoring was conducted. The methanol-0.1% fomic acid water was used as mobile phase for naringin， verbascoside， amygdalin and protocatechuic acid （gradient elution）； negative ion mode monitoring was conducted. RESULTS： The linear ranges of ferulic acid， rutin， paeonol， icariin， schisandrin， naringin， verbascoside， amygdalin and protocatechuic acid were 0.499 5-500， 25-1 000， 0.245 9-250， 5.185 1-1 000， 0.981 9-1 000， 0.248 1-125， 2.510 4-250， 10-2 500， 4.999 7-1 000 ng/mL （r≥0.997 8）， respectively. The limits of detection were 0.075， 0.30， 0.072， 0.015， 0.015， 0.075， 0.15， 0.30， 0.15 ng/mL，respectively； the limits of quantitation were 0.25， 1.00， 0.24， 0.51， 0.49， 0.25， 0.50， 0.99， 0.49 ng/mL， respectively. The recoveries rate were 91.39%-103.56% （RSD=1.03%-3.67%， n=6）. RSDs of stability test ranged 1.4%-3.4% （n=6） within 48 h at room temperature.CONCLUSIONS： The method is rapid， sensitive and reproducible， and can be used for content determination of 9 components in Huichun yuzi granules. It can be used for quality control of Huichun yuzi granules.

KEYWORDS Huichun yuzi granules； Component； LC-MS/MS； Quality control； Determination of content

回春育子顆粒是石家莊市第四醫(yī)院制劑科生產(chǎn)的院內(nèi)制劑，由炙淫羊藿、制何首烏、枸杞子、熟地黃、骨碎補(bǔ)等二十味中藥經(jīng)提取制成的中藥復(fù)方顆粒。該復(fù)方顆粒用于腎精虧虛之精子數(shù)少、死精過(guò)多、精子活動(dòng)力差、成活率低等原因造成的不育癥。方中枸杞子、炙淫羊藿具有補(bǔ)腎陽(yáng)功效；熟地黃、五味子具有補(bǔ)腎陰功效；徐長(zhǎng)卿、燙狗脊、骨碎補(bǔ)等具有抗炎調(diào)節(jié)免疫功效；當(dāng)歸、桃仁具有活血化瘀，調(diào)節(jié)機(jī)體微循環(huán)等功效[1-4]；上述功效能夠多靶點(diǎn)、多途徑作用于不育癥的病因[5]。目前，該制劑的質(zhì)量控制采用薄層色譜法對(duì)淫羊藿苷和枸杞子對(duì)照藥材進(jìn)行定性檢測(cè)，由于中藥復(fù)方制劑由多種成分共同作用發(fā)揮藥效，采用單味中藥或單一化學(xué)成分對(duì)復(fù)方中藥的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)過(guò)于片面，因此該方法具有一定局限性。本研究基于中國(guó)工程院劉昌孝院士提出的中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）的基本概念，以存在于中藥材和中藥產(chǎn)品（如中藥飲片、中藥煎劑、中藥提取物、中成藥制劑）中固有的或加工制備過(guò)程中形成的、與中藥的功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)，作為反映中藥安全性和有效性的標(biāo)示性物質(zhì)[6]。依據(jù)方解，分別以組方中枸杞子、炙淫羊藿、熟地黃、五味子、徐長(zhǎng)卿、燙狗脊、骨碎補(bǔ)、當(dāng)歸、桃仁等為基礎(chǔ)，確定了蘆丁、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、五味子醇甲、丹皮酚、原兒茶酸、柚皮苷、阿魏酸、苦杏仁苷等9種成分作為復(fù)方顆粒的Q-marker進(jìn)行評(píng)價(jià)[7-14]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS法）具有高選擇性、高靈敏度的特點(diǎn)，且樣品不需要進(jìn)行復(fù)雜的前處理，可以對(duì)中藥復(fù)方中含量低、不易分離的化學(xué)成分進(jìn)行較準(zhǔn)確的定性和定量分析[15]。本研究分別以蘆丁、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、五味子醇甲、丹皮酚、原兒茶酸、柚皮苷、阿魏酸、苦杏仁苷等9種成分作為復(fù)方顆粒的Q-marker，采用LC-MS/MS法進(jìn)行定性和定量分析，為該復(fù)方顆粒的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

API4000+型質(zhì)譜儀，包括電噴霧離子源（美國(guó)AB公司）；LC-20AD型高效液相色譜儀，包括二元梯度洗脫泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱（日本島津公司）；XS205型十萬(wàn)分之一天平（瑞士Mettler -Toledo公司）

1.2 藥品與試劑

阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：0773-9910，純度：97.3%）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201408，純度：96.2%）、丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)：110708-200506，純度：98.1%）、淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)：110737-200415，純度：95.5%）、五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)：110857-201412，純度：93.7%）、柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110722-201312，純度：94.8%）、毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111530-201007，純度：96.4%）、苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)：110820-201305，純度：97.4%）和原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)：110809-201205，純度：97.2%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；回春育子顆粒（石家莊市第四醫(yī)院制劑科，批號(hào)：20151031、20160119、20160308、20160315、20160412、20160419，規(guī)格：15 g/袋）；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取阿魏酸、蘆丁、丹皮酚、淫羊藿苷、五味子醇甲、柚皮苷、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷和原兒茶酸對(duì)照品各10 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）45 min，室溫下冷卻，用甲醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。分別精密量取上述單一對(duì)照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，即得混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 隨機(jī)取各批次回春育子顆粒，研細(xì)，精密稱量1.0 g，置于100 mL量瓶中，分別加入甲醇溶液至刻度，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）45 min，室溫下冷卻，用甲醇定容至刻度，取上清液過(guò)0.45 ?m微孔濾膜，即得。

2.2 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODS C18（100 mm×2.0 mm，5 ?m）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 ?L；離子源為電噴霧離子源（ESI源），采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。 阿魏酸、蘆丁、丹皮酚、淫羊藿苷、五味子醇甲以乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min時(shí)30%～50%A，5～10 min時(shí)50%～90% A）；流速為0.25 mL/min；采用正離子監(jiān)測(cè)，簾氣（CUR）：25 psi；碰撞氣（CAD）：5 psi；源噴射電壓（IS）：5 500.0 V；離子源溫度（TEM）：550.0℃；霧化氣（GS1）：55 psi；加熱氣（GS2）：55 psi。柚皮苷、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷、原兒茶酸采用以甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min時(shí)10%～50% A，5～8 min時(shí)50%～65% A）；流速為0.20 mL/min；采用負(fù)離子監(jiān)測(cè)，CUR：10 psi；CAD：5 psi；IS：-4 500.0 V；TEM：550.0 ℃；GS1：55 psi；GS2：55 psi；離子對(duì)及質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，混標(biāo)對(duì)照品及樣品各成分MRM模式下色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 專屬性試驗(yàn)

在“2.2”項(xiàng)條件下，取混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣5 ?L；另按制劑室提供的處方，稱取不含9種成分的等量輔料，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成空白輔料溶液，進(jìn)樣5 ?L，記錄色譜。結(jié)果表明，輔料不干擾主成分的測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖2。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精確量取“2.1.1”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶適量，用甲醇制備成含阿魏酸、蘆丁、丹皮酚、淫羊藿苷、五味子醇甲分別為5、2.5、5、5、25 ?g/mL的混合對(duì)照品溶液；以及含柚皮苷、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷、原兒茶酸分別為1、2.5、2.5、5 ?g/mL混合對(duì)照品溶液。分別將上述混合對(duì)照品溶液用甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（y）、對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性加權(quán)回歸分析，權(quán)重系數(shù)為1/x。線性關(guān)系考察結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 檢測(cè)限與定量限考察

將“2.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液逐步稀釋，分別以信噪比為10和信噪比為3時(shí)各對(duì)照品的質(zhì)量濃度作為定量限和檢測(cè)限。結(jié)果，阿魏酸、蘆丁、丹皮酚、淫羊藿苷、五味子醇甲、柚皮苷、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷和原兒茶酸的定量限分別為0.25、1.00、0.24、0.51、0.49、0.25、0.50、0.99、0.49 ng/mL，檢測(cè)限分別為0.075、0.30、0.072、0.015、0.015、0.075、0.15、0.30、0.15 ng/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同批次回春育子顆粒（批號(hào)為20160308），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，阿魏酸、蘆丁、丹皮酚、淫羊藿苷、五味子醇甲、柚皮苷、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷和原兒茶酸峰面積的RSD分別為1.1%、2.1%、0.6%、0.3%、1.7%、1.2%、1.0%、1.3%、0.7%（n=6），表明該方法精密度符合要求。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批次回春育子顆粒（批號(hào)為20160308）6份，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果，阿魏酸、蘆丁、丹皮酚、淫羊藿苷、五味子醇甲、柚皮苷、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷和原兒茶酸含量分別為22.9、14.7、16.7、80.2、46.7、4.0、8.4、90.7、54.8 ?g/g，RSD分別為1.4%、1.7%、0.9%、2.0%、2.7%、1.2%、0.2%、1.0%、0.4%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確量取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，用甲醇制備成含阿魏酸、蘆丁、丹皮酚、淫羊藿苷、五味子醇甲分別為 50、25、50、50、250 ng/mL的混合對(duì)照品溶液；以及含柚皮苷、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷、原兒茶酸分別為10、25、25、50 ng/mL的混合對(duì)照品溶液。室溫下，分別于0、2、6、12、24、48 h按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)6次，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果，阿魏酸、蘆丁、丹皮酚、淫羊藿苷、五味子醇甲、柚皮苷、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷和原兒茶酸含量的RSD分別為2.7%、2.2%、1.8%、1.4%、2.1%、1.9%、2.4%、1.5%、3.4%（n=6），表明上述溶液穩(wěn)定性良好。

2.9 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

按處方比例配制分別不含阿魏酸、蘆丁、丹皮酚、淫羊藿苷、五味子醇甲、柚皮苷、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷、原兒茶酸的制劑，各取1 g，精密稱定，分別置于100 mL量瓶中，按供試品溶液中待測(cè)組份含量的100%加入阿魏酸、蘆丁、丹皮酚、淫羊藿苷、五味子醇甲、柚皮苷、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷、原兒茶酸對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.10 樣品含量測(cè)定

取6個(gè)批次的回春育子顆粒，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，每批3次，計(jì)算各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇

目前，回春育子顆粒質(zhì)量控制以淫羊藿苷和枸杞子對(duì)照藥材作對(duì)照，采用薄層色譜法進(jìn)行定性檢測(cè)，該方法具有局限性，不能進(jìn)行多目標(biāo)化合物的定性和定量分析。筆者曾嘗試采用HPLC-紫外檢測(cè)器法對(duì)回春育子顆粒中目標(biāo)成分的含量進(jìn)行測(cè)定，但由于回春育子顆粒中化學(xué)成分復(fù)雜，部分化合物的含量較低，以及UV檢測(cè)器的選擇性和靈敏度問(wèn)題，HPLC-紫外檢測(cè)器法無(wú)法滿足同時(shí)對(duì)本文中涉及的9種成分進(jìn)行定量分析，故本研究建立了LC-MS/MS對(duì)回春育子顆粒中目標(biāo)成分進(jìn)行定量分析。

3.2 色譜-質(zhì)譜條件的確定

對(duì)流動(dòng)相的選擇，在前期試驗(yàn)中先后考察了各種濃度的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水溶液、甲醇-甲酸銨水溶液、乙腈-甲酸水溶液和乙腈-甲酸銨水溶液，最終確定了本研究的流動(dòng)相。在本研究的流動(dòng)相條件下，目標(biāo)化合物在10 min內(nèi)即可有效分離，峰形較好。質(zhì)譜條件中分別考察了CUR、CAD、IS、TEM、GS1、GS2等參數(shù)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，試驗(yàn)中還考察了離子監(jiān)測(cè)模式，分別對(duì)9個(gè)成分進(jìn)行正、負(fù)離子掃描。結(jié)果顯示，丹皮酚、五味子醇甲、淫羊藿苷、阿魏酸、蘆丁在正離子模式下響應(yīng)較好，而柚皮苷、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷和原兒茶酸在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好。

3.3 提取方法的選擇

在前期試驗(yàn)中，分別以甲醇、30% 甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液和80% 甲醇水溶液做為提取溶劑，并且考察了超聲時(shí)間（20、30、45、60 min）對(duì)目標(biāo)化合物提取的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以純甲醇溶液作為提取溶劑，在超聲45 min 的提取條件下，目標(biāo)化合物響應(yīng)較好，提取效率較高。

本試驗(yàn)以中藥Q-marker 的基本概念為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)回春育子顆粒中藥組方進(jìn)行方解，根據(jù)中藥組方中作用于不同靶點(diǎn)以及發(fā)揮不同功效的中藥成分，確定了9種目標(biāo)成分，作為回春育子顆粒的Q-marker進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。本文建立了同時(shí)對(duì)回春育子顆粒中9種成分進(jìn)行定性和定量測(cè)定的LC-MS/MS法，結(jié)果顯示，該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，重復(fù)性好，能夠?yàn)榛卮河宇w粒的質(zhì)量控制提供精確的檢測(cè)手段。

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（收稿日期：2017-11-13 修回日期：2018-02-25）

（編輯：鄒麗娟）