在線二維柱切換—高效液相色譜法測(cè)定人血清中多索茶堿濃度

鄭玲利 袁明勇 蔣婷 王峰 張維 陳靜

中圖分類號(hào) R974+.3；R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）09-1264-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.27

摘 要 目的：建立測(cè)定人血清中多索茶堿濃度的方法。方法：采用在線二維柱切換-高效液相色譜法測(cè)定人血清中多索茶堿濃度，一維色譜柱為Waters C18，中間柱為SC2，一維、二維柱流動(dòng)相均為甲醇-水（70 ∶ 30，V/V），檢測(cè)波長為273 nm，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為10 ?L。結(jié)果：多索茶堿在0.5～50.00 ?g/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 9），檢測(cè)限為0.01 ?g/mL，定量限為0.5 ?g/mL，日內(nèi)、日間精密度的RSD分別為1.51%～1.89%和1.52%～1.92%（n=5），準(zhǔn)確度為97.91%～104.19%（n=5），提取回收率為91.63%～93.44%（RSD<2.00%，n=3），基質(zhì)效應(yīng)RSD≤3.01%（n=6），穩(wěn)定性的RSD<5.00%（n=6）。3例患者靜脈輸注多索茶堿葡萄糖注射液（0.3 g/d）達(dá)穩(wěn)態(tài)后，次日給藥前靜脈血清中多索茶堿的濃度為3.23、3.35、3.68 ?g/mL，RSD為2.28%、2.34%、2.14%（n=5）。結(jié)論：該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，適用于臨床多索茶堿的血藥濃度檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 多索茶堿；血藥濃度；在線二維柱切換-高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for the determination of doxofylline in human serum. METHODS： Online two-dimensional column switching-HPLC was adopted to determine the concentration of doxofylline in human serum. First- dimensional chromatographic column was Waters C18 column， and middle column was SC2. First-dimensional and second- dimensional column mobile phrase were methanol-water （70 ∶ 30， V/V）. The detection wavelength was 273 nm， and column temperature was 40 ℃. Sample volume was 10 ?L. RESULTS： The linear range of doxofylline were 0.5-50.00 ?g/mL （r=0.999 9）， and the detection limit was 0.01 ?g/mL. The quantitative limit was 0.5 ?g/mL. RSDs of intra-day and inter-day were 1.51%-1.89% and 1.52%-1.92% （n=5）. The accuracy were 97.91%-104.19% （n=5）. Extraction recoveries rate were 91.63%-93.44%（RSD<2.00%，n=3）. RSD of matrix effect were lower than or equal to 3.01% （n=6）， and RSD of stability test was lower than 5.00% （n=6）. After 3 patients were given intravenous injection of Doxofylline and glucose injection（0.3 g/d） up to steady state， the serum concentrations of doxofylline were 3.23， 3.35， 3.68 ?g/mL before medication on the next day （RSD=2.28%， 2.34%， 2.14%， n=5）. CONCLUSIONS： The method is simple， rapid， accurate and suitable for the determination of plasma concentration of doxofylline.

KEYWORDS Doxofylline； Plasma concentration； Online two-dimensional column switching-HPLC

多索茶堿（Doxofylline）為甲基黃嘌呤的衍生物[1]，主要用于支氣管痙攣引起的呼吸困難[2]。作為新一代茶堿藥物，該藥具有療效高、副作用小等特點(diǎn)，故越來越被臨床所重視。但該藥與茶堿一樣，同樣存在個(gè)體差異較大，大劑量給藥時(shí)可能引起血壓下降、心律不齊、陣發(fā)性痙攣等[3]，故臨床需密切監(jiān)測(cè)多索茶堿血藥濃度，防止過量導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。目前，檢測(cè)血藥濃度主要采用高效液相色譜（HPLC）法[4-5]，但傳統(tǒng)的HPLC法存在前處理較復(fù)雜、常使用大量有機(jī)溶劑、殘留蛋白易堵塞色譜柱等問題。本研究通過對(duì)傳統(tǒng)血藥濃度檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化和改良，建立了一種簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，適用于臨床多索茶堿的血藥濃度檢測(cè)。

1 材料

1.1 儀器

二維HPLC（2D-HPLC）由FLC-2801全自動(dòng)二維液相色譜耦合儀（湖南德米特儀器有限公司）和LC-20A色譜模塊（日本島津公司）構(gòu)成；HR-200電子分析天平（日本AND公司）；TD24-WS低速離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；Mini-15K微型高速離心機(jī)（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

多索茶堿對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100345-200803，供含量測(cè)定用）；甲醇為色譜純；高氯酸、磷酸銨為分析純，水為純凈水。

1.3 血清與全血

空白馬血清（北京政博偉業(yè)生物科技有限公司，批號(hào)：160128）；空白人血清和用藥患者全血樣品（靜脈注射多索茶堿葡萄糖注射液每日0.3 g，達(dá)穩(wěn)態(tài)后，次日給藥前0.5～1 h采血）由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院臨床科室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

FLC-2801全自動(dòng)二維液相色譜耦合儀，第一維色譜系統(tǒng)為島津LC-20ATvp四元低壓色譜泵，第二維色譜系統(tǒng)為島津LC-20ATvp一元低壓色譜泵。第一維柱系統(tǒng)：色譜柱為Waters C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（70 ∶ 30，V/V），流速為1.0 mL/min。第二維柱系統(tǒng)：流動(dòng)相為甲醇-水（70 ∶ 30，V/V），不需要色譜柱，主要用于清洗中間柱；中間柱SC2（25 mm×3.5 mm，5 μm）；檢測(cè)波長為273 nm；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。工作原理：（1）進(jìn)樣。目標(biāo)經(jīng)過中間柱分離雜質(zhì)后進(jìn)入分析柱進(jìn)行分析。（2）除雜。中間柱在目標(biāo)物完全離開后轉(zhuǎn)至第二維柱系統(tǒng)進(jìn)行反向沖洗，洗去殘留雜質(zhì)。（3）返回。中間柱洗凈后返回第一維柱系統(tǒng)，為下一次進(jìn)樣做準(zhǔn)備，流程圖見圖1。在線二維柱切換-HPLC條件設(shè)置-時(shí)間程序表見表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品貯備液 精密稱取多索茶堿對(duì)照品5 mg，用25%乙醇溶解并定容至10 mL，制備成質(zhì)量濃度為500 ?g/mL的對(duì)照品貯備液，置于冰箱中（4 ℃），備用。

2.2.2 對(duì)照品溶液 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，用25%乙醇定容至10 mL，制備成高、中、低質(zhì)量濃度（37.5、12.5、1.5 ?g/mL）的對(duì)照品溶液，轉(zhuǎn)移至密封螺口瓶中，置于冰箱中（-80 ℃）保存。

2.2.3 質(zhì)控樣品溶液 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，用空白馬血清定容至10 mL，制備成高、中、低質(zhì)量濃度（37.5、12.5、1.5 ?g/mL）的質(zhì)控樣品溶液，轉(zhuǎn)移至密封螺口瓶中，置于冰箱中（-80 ℃）保存。

2.3 血清樣品處理方法

取全血樣品以離心半徑6 cm、轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心5 min，精密量取待測(cè)血清樣品200 ?L，再置于離心管中，加入10%高氯酸600 ?L，渦旋振蕩1 min后，以離心半徑3 cm、轉(zhuǎn)速14 500 r/min離心8 min。取上清液700 μL至進(jìn)樣瓶，加入5.0 mol/L磷酸銨溶液70 μL調(diào)節(jié)pH至7.0，渦旋振蕩15 s，進(jìn)樣10 μL，以外標(biāo)法定量分析。

2.4 專屬性考察

取空白馬血清、空白人血清、空白馬血清+多索茶堿對(duì)照品、用藥患者全血樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜。結(jié)果顯示，空白馬血清、空白人血清在目標(biāo)峰處無干擾，多索茶堿與雜質(zhì)分離較好，保留時(shí)間為8.794 min，色譜圖見圖2。

2.5 線性關(guān)系考察

取多索茶堿對(duì)照品貯備液適量，用空白馬血清定容，稀釋制成多索茶堿質(zhì)量濃度分別為50.0、25.0、12.5、6.25、3.0、1.5、0.5 ?g/mL的系列溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、多索茶堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=32 015x+1 669.85（r=0.999 9）。結(jié)果表明，多索茶堿在0.5～50.0 ?g/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 檢測(cè)限與定量限考察

取“2.5”項(xiàng)下多索茶堿標(biāo)準(zhǔn)曲線線性最低點(diǎn)的溶液逐倍稀釋，進(jìn)行分析，以信噪比為3計(jì)算檢測(cè)限，以信噪比為10計(jì)算定量限。結(jié)果顯示，檢測(cè)限為0.01 ?g/mL，定量限為0.5 ?g/mL。

2.7 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，每個(gè)質(zhì)量濃度同日內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次考察日內(nèi)精密度，5日內(nèi)每日測(cè)定1次考察日間精密度；以回歸方程計(jì)算多索茶堿濃度，按公式實(shí)測(cè)濃度/理論濃度×100%計(jì)算準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.8 提取回收率試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品溶液和“2.2.2”項(xiàng)下多索茶堿對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，將測(cè)得的同質(zhì)量濃度質(zhì)控品與對(duì)照品溶液的峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算提取回收率。結(jié)果顯示，高、中、低質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品溶液的提取回收率分別為93.44%、92.25%、91.63%，RSD分別為1.9%、1.1%、1.8%（n=3），表明本方法的提取回收率較高且穩(wěn)定。

2.9 基質(zhì)效應(yīng)考察

取6份不同的空白人血清和空白馬血清，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，加入多索茶堿對(duì)照品溶液制備成高、低質(zhì)量濃度（37.5、1.5 ?g/mL）質(zhì)控樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以質(zhì)控樣品溶液的峰面積與相同質(zhì)量濃度多索茶堿對(duì)照品溶液的峰面積的比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，人血清、馬血清的RSD均小于15%，且兩者比較無顯著差異，故本試驗(yàn)可用馬血清替換人血清作為質(zhì)控基質(zhì)。基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果見表3。

2.10 穩(wěn)定性考察

取“2.2.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品溶液，在室溫放置0、2、4、8、16、24 h及冷凍保存10 d（反復(fù)凍融3次）后，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，質(zhì)控樣品溶液峰面積的RSD均<5.00%（n=6），表明質(zhì)控樣品溶液在室溫放置24 h及冷凍10 d的穩(wěn)定性良好。

2.11 臨床樣本測(cè)定

取3例用藥患者的全血樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，代入回歸方程計(jì)算濃度。結(jié)果顯示，3例用藥患者的多索茶堿血藥濃度分別為3.23、3.35、3.68 ?g/mL，RSD分別為2.28%、2.34%、2.14%（n=5），血藥濃度均在本方法檢測(cè)范圍內(nèi)，且重現(xiàn)性較好。

3 討論

多索茶堿是一種新型支氣管擴(kuò)張藥，可直接作用與支氣管，促進(jìn)支氣管平滑肌舒張，從而達(dá)到抑制哮喘發(fā)作[6]。但其治療范圍較窄，實(shí)際使用過程中易出現(xiàn)肝損害、心律失常等不良反應(yīng)，需對(duì)其進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)。已有研究報(bào)道采用HPLC法測(cè)定多索茶堿，但均存在前處理復(fù)雜、靈敏度低、色譜柱使用壽命較短等問題[5，7]。本方法采用高氯酸沉淀蛋白后直接進(jìn)樣，不但避免有機(jī)溶劑萃取造成樣品的損失，而且不需要用微孔濾膜過濾，簡化了樣品處理過程，縮短了樣本處理時(shí)間。此外，本方法提取回收率高，回收率穩(wěn)定，不需要加入內(nèi)標(biāo)，通過外標(biāo)法就能達(dá)到較好的線性關(guān)系。

本試驗(yàn)采用的在線二維柱切換-HPLC法，在普通HPLC分析柱前引入中間柱，中間柱除了對(duì)樣品具有分離功效外，還具有強(qiáng)大的除雜功能。當(dāng)目標(biāo)物全部通過中間柱后，中間柱帶著殘留的雜質(zhì)從第一維柱系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至第二維柱系統(tǒng)，通過流動(dòng)相反向沖洗，大量的雜質(zhì)從第二維柱系統(tǒng)中排入廢液，這不僅去除了大部分雜質(zhì)的干擾，提高了分析的準(zhǔn)確性，而且大大延長了分析柱和中間柱的壽命，節(jié)約了檢測(cè)成本。

本研究選擇馬血清作為血清基質(zhì)，因?yàn)轳R血清與人血清作為質(zhì)控基質(zhì)無明顯差異，而馬血清更容易獲得且已被衛(wèi)生部質(zhì)控中心采用，故試驗(yàn)中采用馬血清配制的質(zhì)控樣品。與文獻(xiàn)方法[5，7]比較，該方法試驗(yàn)步驟更為簡單、檢測(cè)時(shí)間短、方法線性好、干擾少、準(zhǔn)確，適用于臨床多索茶堿的血藥濃度檢測(cè)。

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（收稿日期：2018-01-22 修回日期：2018-03-14）

（編輯：鄒麗娟）