陶瓷膜分離技術(shù)精制古漢養(yǎng)生精提取液的工藝研究

張可人 張依人 彭買姣 陳葉童 毛文點(diǎn) 鐘源 陽佑華 鄒龍

〔摘要〕 目的 采用陶瓷膜分離技術(shù)優(yōu)化古漢養(yǎng)生精提取液的分離精制工藝，降低生產(chǎn)成本，提高提取液的澄清度。方法 對(duì)陶瓷膜孔徑、藥液濃度、溫度進(jìn)行考察， 以淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率、多糖及蛋白質(zhì)去除率、浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化古漢養(yǎng)生精提取液的純化工藝。結(jié)果 古漢養(yǎng)生精提取液陶瓷膜分離的最佳工藝參數(shù)為膜孔徑500 nm、料液比1∶15、溫度25 ℃。在此優(yōu)化條件下古漢養(yǎng)生精的淫羊藿苷平均轉(zhuǎn)移率為（92.4±0.6）%，RSD 1.15%；多糖平均去除率（70.4±0.7）%，RSD 1.26%；蛋白平均去除率（23.5±0.2）%，RSD 1.30%；浸膏平均得率（17.6±0.2）%，RSD 1.50%；綜合評(píng)分0.1837。結(jié)論 采用陶瓷膜技術(shù)精制古漢養(yǎng)生精提取液工藝穩(wěn)定可行，可為古漢養(yǎng)生生精工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 古漢養(yǎng)生精口服液；陶瓷膜；淫羊藿苷

〔中圖分類號(hào)〕R284.2 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.08.008

〔Abstract〕 Objective To investigatethe separation and purification processof ancient Han health-keeping extract by ceramic membrane separation technique， in order to reduce production costs and improve the clarity of this extract. Methods The pore size of ceramic membrane， solid-liquid ratio， and temperature were analyzed， and with the transferring rate of icariin， removal efficiency of polysaccharides and protein， and extract yield as assessment indices， an orthogonal experiment was performed to optimize the purification process for ancient Han health-keeping extract. Results The optimal process parameters for ceramic membrane separation for ancient Han health-keeping extractwere a membrane pore size of 500 nm， a solid-liquid ratio of 1：15， and a temperature of 25 °C. Under these optimized conditions， the mean transferring rate of icariin was （92.4±0.6）% （RSD=1.15%）， the mean removal efficiencies of polysaccharides and protein were （70.4±0.7）% （RSD=1.26%） and （23.5±0.2）% （RSD=1.30%）， respectively， and the mean extract yield was （17.6±0.2）% （RSD=1.50%）； the comprehensive score was 0.1837. Conclusion Ceramic membrane separation technique is stable and feasible in the preparation of ancient Han health-keeping extract and provides a scientific basis for the optimization of industrial production technique for ancient Han health-keeping extract.

〔Keywords〕 ancient Han health-keeping extract oral liquid； ceramic membrane； icariin

古漢養(yǎng)生精口服液由淫羊藿、人參、黃芪、枸杞、女貞子、黃精等藥材組成，具有補(bǔ)氣、滋腎益精，補(bǔ)腦安神之效，可用于氣陰虧虛、腎精不足所致的失眠、耳鳴、心悸、健忘等[1-2]。

目前，醇沉法是古漢養(yǎng)精口服使用的純化工藝，主要是利用中藥的部分有效成分既溶于醇又溶于水的性質(zhì)，除去部分不溶于乙醇的成分如蛋白質(zhì)、多糖等，以達(dá)到去除雜質(zhì)，提高藥液澄明度的目的[3]。但是醇沉工藝成本高、效率低，甚至?xí)斐赡承┧苄孕〉挠行С煞值膿p失，影響藥物療效[4]，因此，利用新型分離純化技術(shù)提高古漢養(yǎng)生精口服液產(chǎn)品質(zhì)量顯得尤為重要。

陶瓷膜分離技術(shù)憑借其節(jié)能環(huán)保、操作簡(jiǎn)單、分離效果好等特點(diǎn)，在制藥行業(yè)中具有一定的優(yōu)勢(shì)。陶瓷膜分離技術(shù)是以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，當(dāng)膜兩側(cè)存在壓力差時(shí)，原料組分選擇性的透過膜，從而達(dá)到分離、提純的目的。整個(gè)過濾過程，不涉及任何化學(xué)反應(yīng)，無需添加任何化學(xué)試劑，陶瓷膜憑借膜孔徑的大小，截留分子量不同的物質(zhì)，比如多糖、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等雜質(zhì)，對(duì)有效成分影響小，生產(chǎn)成本低。本課題運(yùn)用陶瓷膜分離技術(shù)精制古漢養(yǎng)生精提取液，研究報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

戴安U3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；

Lambda35型紫外分光光度儀（珀金埃爾儀器有限公司）；BP221S型電子分析天平（賽多利斯儀器公司）；WMK-O2型恒溫干燥箱（湖北省黃石市醫(yī)療器械廠）；DL-360D型超聲機(jī)（上海之信儀器有限公司）；陶瓷膜分離裝置（湖州東潤環(huán)保設(shè)備有限公司）。

1.2 材料

淫羊藿苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110737-200415）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；水為純化水。

古漢養(yǎng)生精提取液所用的人參（Panax ginseng C. A. Mey.）、炙黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge.）、金櫻子（Rosa laevigata Michx.）、枸杞子（Lycium barbarum L.）、女貞子（Ligustrum lucidum Ait.）、菟絲子（Cuscuta australis R. Br.）、淫羊藿（Epimedium brevicornu Maxim.）、白芍（paeonia lactiflora Pall.）、炙甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、炒麥芽（Hordeurm vulgare L.）、黃精（Polygonatum sibiricum Red.），經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)鄒龍教授鑒定均符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部相關(guān)藥材項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定[5]，藥材均購于安國圣山藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 陶瓷膜分離操作

在物料桶中加入30 L經(jīng)高速離心后的古漢養(yǎng)生精提取液（因?qū)儆谥兴幈Ｗo(hù)品種，所制制備工藝暫未公開），用不同孔徑的膜在不同操作參數(shù)下進(jìn)行分離，收集透過液。當(dāng)透過液收集到80%時(shí)，在物料桶中加入20%的純化水，繼續(xù)分離，透過液接到100%后停止。

2.2 淫羊藿含量的測(cè)定

2.2.1 色譜條件[5] 色譜柱（Agilent C18，4.6 mm×150 mm，5 μm），以乙腈-水（30∶70）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長為270 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流速1 mL/min。此色譜條件下，淫羊藿苷可與其他成分達(dá)到較好分離，陰性無干擾。供試品與對(duì)照品的色譜圖見圖1。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取藥液5 mL，置于 50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性溶液的制備 按處方取除去淫羊藿藥材外的10味藥材，按其制備工藝制備，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，即得。

2.2.4 線性關(guān)系 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成1 mL含100 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3、4、5、10 mL于25 mL容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定淫羊藿苷峰面積。以淫羊藿苷峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)，淫羊藿苷濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，回歸方程為Y=0.376 X-0.217 4，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1。表明，淫羊藿苷在4～40 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 樣品測(cè)定 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下供試品液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定淫羊藿苷峰面積，按下式計(jì)算淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率。

2.3 多糖含量的測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取D-無水葡萄糖0.011 4 g置于100 mL容量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻得114 μg/mL的多糖對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液配制 取原藥液、陶瓷膜透過液各1 mL，加無水乙醇4 mL，混勻，離心（3 000 r/min） 5 min，棄去上清液，沉淀用8 mL的80%乙醇洗滌，離心10 min，洗滌2次，棄去洗液，殘?jiān)梅兴啻翁崛?，合并提取液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中并定容，即得供試品溶液。

2.3.3 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL具塞試管中，加入蒸餾水補(bǔ)至 2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，再置40 ℃水浴中15 min，取出，置于冰水中5 min至室溫，于490 nm波長處測(cè)定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，D-無水葡萄糖濃度（X）為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[6-8]。

回歸方程：Y=0.014 8 X+0.019 2，r=0.995 9

表明多糖在5.7～57 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與吸光度Y線性關(guān)系良好。

2.3.4 樣品測(cè)定 取原藥液、陶瓷膜透過液的供試品溶液1 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下操作同法制備，測(cè)吸光度，將測(cè)得的吸光度代入回歸方程計(jì)算待測(cè)溶液中多糖的濃度。按下式計(jì)算多糖的去除率。

2.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)的含量測(cè)定使用蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒，具體操作步驟如下。

2.4.1 考馬斯亮藍(lán)染液的配制 取蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒中的考馬斯亮藍(lán)儲(chǔ)備液10 mL于50 mL容量瓶中，加40 mL的純化水稀釋，搖勻得考馬斯亮藍(lán)染液。

2.4.2 樣品測(cè)定 在空白管中加入50 μL的純化水、在標(biāo)準(zhǔn)管中加入蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒中的563 μg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液、在樣品管中加入50 μL的原藥液或陶瓷膜透過液，最后在空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、樣品管中均加入3 mL的考馬斯亮藍(lán)染液，混勻，靜置10 min，于595 nm波長處測(cè)定各管吸光度值。按下式分別計(jì)算樣品管中蛋白質(zhì)濃度和蛋白質(zhì)去除率。

2.5 浸膏得率

取50 mL陶瓷膜透過液，置于已恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃中干燥3 h，再移至于干燥器中，冷卻30 min。迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算干浸膏得率。

2.6 古漢養(yǎng)生精陶瓷膜分離工藝的研究

2.6.1 指標(biāo)數(shù)據(jù)的處理 以淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率、多糖去除率、蛋白質(zhì)去除率、浸膏得率為指標(biāo)，對(duì)4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理[9-10]。淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率、多糖去除率、蛋白質(zhì)去除率的值越大越好，其歸一化方程是：

按歸一化方程得出各指標(biāo)的歸一值后，再以權(quán)重系數(shù)綜合評(píng)分法評(píng)價(jià)，淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率、多糖去除率、蛋白質(zhì)去除率、浸膏得率的權(quán)重系數(shù)分別是0.7、0.1、0.1、0.1。

2.6.2 陶瓷膜分離工藝的優(yōu)化 參照文獻(xiàn)[12-14]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇陶瓷膜孔徑、藥液濃度、溫度進(jìn)行優(yōu)化，采用三因素三水平的正交設(shè)計(jì)，用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，以淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率、多糖去除率、蛋白質(zhì)去除率、浸膏得率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，所選因素及其水平見表1。由表2極差分析可知，各因素對(duì)古漢養(yǎng)生精提取影響的大小順序是：A>B>C，即膜孔徑>濃度>溫度。表3方差分析結(jié)果表明A（膜孔徑）和B（濃度）對(duì)結(jié)果的影響具有顯著性意義（P<0.05），C（溫度）對(duì)結(jié)果的影響沒有顯著性意義（P>0.05），因此，從經(jīng)濟(jì)學(xué)角度考慮，最佳分離純化工藝為A3B2C1，即陶瓷膜孔徑為500 nm，料液比1∶15，溫度25 ℃。

2.6.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了考察工藝的穩(wěn)定性與可靠性，按正交設(shè)計(jì)優(yōu)選出來的最優(yōu)工藝陶瓷膜孔徑為500 nm，料液比1∶15，溫度25 ℃平行進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果無顯著差異，測(cè)定淫羊藿苷平均轉(zhuǎn)移率為（92.4±0.6）%，多糖平均去除率（70.4±0.7）%，蛋白平均去除率（23.5±0.2）%，浸膏平均得率（17.6±0.2）%，4個(gè)指標(biāo)的RSD分別為1.15%、1.26%、1.30%、1.50%，綜合評(píng)分0.183 7，表明優(yōu)選的工藝基本可靠。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì)對(duì)精制古漢養(yǎng)生精提取液的膜孔徑、料液比、溫度3個(gè)因素進(jìn)行考察，確定了最佳工藝為：膜孔徑500 nm、料液比1∶15、溫度25 ℃。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定、可行。

采用多指標(biāo)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)選，以權(quán)重系數(shù)綜合評(píng)分法評(píng)價(jià)，對(duì)各指標(biāo)歸一化后再分別賦予不同的權(quán)重系數(shù)。在追求除雜效果的同時(shí)，要保證有效成分的轉(zhuǎn)移率，故將淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率、多糖去除率、蛋白質(zhì)去除率、浸膏得率的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.7、0.1、0.1、0.1，其優(yōu)選工藝更符合實(shí)際生產(chǎn)。

本實(shí)驗(yàn)使用陶瓷膜分離技術(shù)精制古漢養(yǎng)生精提取液，代替?zhèn)鹘y(tǒng)醇沉工藝，操作簡(jiǎn)單，可避免大量使用乙醇，降低生產(chǎn)成本。通過該技術(shù)所得到的提取液其澄明度和穩(wěn)定性都有明顯的改善，我們計(jì)劃將這一生產(chǎn)技術(shù)應(yīng)用于古漢養(yǎng)生精的工業(yè)化生產(chǎn)中去，此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行中。

參考文獻(xiàn)：

[1] 鐘永紅，劉 文.HPLC法測(cè)定古漢養(yǎng)生精中淫羊藿苷的含量[J]. 醫(yī)學(xué)臨床研究，2012，29（4）：779-780.

[2] 于 巖，喬志誠，雷 萍，等.古漢養(yǎng)生精合谷維素治療失眠癥51例臨床觀察[J].湖南中醫(yī)雜志，2014，30（9）：41-42.

[3] 沈 亮，徐方成，藍(lán)云才，等.應(yīng)用膜技術(shù)分離當(dāng)歸浸取液中的阿魏酸[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然版），2006，45（2）：234-237.

[4] 伍利華，黃 英，劉 婷，等.陶瓷膜分離技術(shù)應(yīng)用于中藥口服液的研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2014，37（2）：184-187.

[5] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：761.

[6] 賈東升，溫春秀，趙江麗，等.固體制劑中多糖含量測(cè)定的樣品預(yù)處理方法研究[J].藥物分析雜志，2015，35（3）：409-413.

[7] 孫 鋒，谷文英，丁霄霖.山藥粗多糖的提取工藝[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，25（3）：79-83.

[8] 張彥麗，阿布都熱合曼·合力力，阿依吐倫·斯馬義.苯酚-硫酸法測(cè)定維吾爾藥昆侖雪菊多糖含量的研究[J].藥物分析雜志，2010，30（11）：2205-2207.

[9] 吳 偉，崔光華，陸 彬.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中多指標(biāo)的優(yōu)化：星點(diǎn)設(shè)計(jì)和總評(píng)“歸一值”的應(yīng)用[J].中國藥學(xué)雜志，2000，35（8）：530-533.

[10] 張 林，李元波，張愛軍.總評(píng)“歸一值”優(yōu)選銀馬口服液的澄清工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（2）：24-27.

[11] 趙 丹，朱澄云，王中彥.參芝安神口服液澄清工藝研究[J].吉林中醫(yī)藥，2017，37（10）：1046-1048.

[12] 宋曉春，王繼龍，魏舒暢，等.超濾-納濾集成技術(shù)純化、濃縮當(dāng)歸水提取液的工藝考察[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（3）：13-15.

[13] 魏舒暢，袁文珺，余 琰，等.紅芪提取液的超濾純化工藝研究[J]. 中成藥，2011，33（4）：599-603.

[14] 胡 琴，王汝上，程慧荃，等.超濾陶瓷膜精制黃芪葛根湯組成藥物提取液的工藝參數(shù)研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，34（5）：753-757.