基于高通量測序的橡膠林土壤真菌多樣性及群落組成分析

周玉杰　李建華　張廣宇　王寧　 譚文麗　王永鵬　王春燕　王華鋒

摘要：【目的】分析不同林齡橡膠林中土壤真菌的多樣性及群落組成，為橡膠林土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展和可持續(xù)利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎酶咄繙y序技術(shù)測定海南大豐農(nóng)場不同林齡（5、10、13、18、25和30年生）橡膠林中土壤真菌的ITS序列，觀測真菌多樣性和群落組成隨種植年限的變化情況，并分析其與土壤環(huán)境因子的關(guān)系?！窘Y(jié)果】從6個林齡橡膠林的18份土壤樣本中獲得563658條ITS序列，在97%序列相似性基礎(chǔ)上可劃分為10943個可操作分類單元（OTU）。真菌群落的豐富度指數(shù)（Ace和Chao1）以25年生橡膠林最低，而多樣性指數(shù)（Shannon-wienner和Simpson）在不同林齡橡膠林間差異不明顯。Ascomycota（子囊菌門）、Zygomycota（接合菌門）和Basidiomycota（擔(dān)子菌門）是海南大豐農(nóng)場橡膠林土壤真菌的主要優(yōu)勢類群；不同林齡橡膠林間的真菌群落組成差異主要體現(xiàn)在Zygomycota、Basidiomycota、Glomeromycota（球囊菌門）和Rozellomycota類群相對豐度的不同。冗余分析（RDA）結(jié)果表明，橡膠林的土壤真菌多樣性與土壤養(yǎng)分含量（尤其是鉀元素含量）密切相關(guān)?！窘Y(jié)論】高通量測序技術(shù)測定的不同林齡橡膠林間土壤真菌群落多樣性無明顯差異，而真菌群落豐度以25年生橡膠林最低，5、10、13、18和30年生橡膠林間差異不明顯；真菌群落組成的優(yōu)勢類群為子囊菌門、接合菌門和擔(dān)子菌門；土壤養(yǎng)分含量（尤其是鉀元素含量）是影響橡膠林土壤真菌多樣性的重要因素。

關(guān)鍵詞： 橡膠林；高通量測序；土壤真菌；多樣性

中圖分類號： S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）09-1729-07

0 引言

【研究意義】我國從19世紀(jì)50年代開始大規(guī)模引種橡膠樹（Hevea brasiliensis），目前已形成以海南、云南和廣東為主的三大天然橡膠優(yōu)勢種植區(qū)域，其中海南省橡膠樹種植面積占全省植被總面積的25%（王紀(jì)坤等，2012）。橡膠林是典型的人工林生態(tài)系統(tǒng)，長期大規(guī)模的替代自然植被，且伴隨著干擾、施肥和土地清理等人類活動，對土壤真菌產(chǎn)生了負(fù)面影響（Zhang and Zhang，2003；楊帆，2016；Kerfahi et al.，2016）。近年來，迅速發(fā)展的高通量測序技術(shù)具有更高的分辨率，為更準(zhǔn)確地揭示橡膠林土壤真菌多樣性及群落組成的變化提供了條件。因此，采用高通量測序技術(shù)測定橡膠林土壤真菌的多樣性及群落組成，對橡膠林土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】高秀兵和李增平（2010）的研究結(jié)果表明，海南橡膠種植園土壤的叢枝菌根真菌分屬于5個屬31個種，其中球囊霉屬（Glomus）是最高屬類群。Osemwegie（2010）、Zhang等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，橡膠林的土壤真菌多樣性低于周圍天然林。李君等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，橡膠林土壤真菌類群的數(shù)量低于細(xì)菌和放線菌。Lin等（2012）研究認(rèn)為，真菌群落可作為土壤質(zhì)量的一個指標(biāo)衡量橡膠林管理措施對土壤的影響程度，而以往對橡膠林土壤微生物的研究主要集中于土壤細(xì)菌群落（楊帆，2016；Kerfahi et al.，2016；Lan et al.，2017），采用的技術(shù)分辨率較低，如宋風(fēng)雅等（2014）采用PCR/T-RFLP技術(shù)可分析橡膠林不同土壤深度的真菌區(qū)系，但無法獲得真菌的具體分類信息?！颈狙芯壳腥朦c】目前，采用高通量測序技術(shù)測定不同林齡橡膠林中土壤真菌多樣性及群落組成的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用高通量測序技術(shù)測定海南省瓊中縣大豐農(nóng)場不同林齡橡膠林土壤中的真菌群落及組成的多樣性，并分析不同土壤環(huán)境因子對其的影響，以期為橡膠林土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展和可持續(xù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于海南省瓊中縣大豐農(nóng)場（東經(jīng)19°14′～19°16′、北緯109°44′～109°45′、海拔175～207 m）。該區(qū)域為熱帶海洋季風(fēng)氣候，年均溫度22.8 ℃，最冷月平均氣溫16～18 ℃，年均相對濕度85%，年均降水量2278 mm。選取6個不同林齡（5、10、13、18、25和30年生）常規(guī)栽培的橡膠林林地為試驗樣地，每個樣地面積1.0 ha。橡膠樹栽培品系為PR107，株行距3.0 m×7.0 m。各樣地的立地條件、栽培管理措施和割膠制度基本一致。土壤類型為磚紅壤。

1. 2 土壤樣品采集

2016年5月在單個樣地內(nèi)選取15個采樣點，采集0～20 cm土層土壤，將每5個點采集的土樣混合，每個林齡橡膠林取3份混合土樣，共18個土壤樣本。剔除植物根系和石塊后每份混合土樣分為兩份，一份帶回實驗室經(jīng)風(fēng)干后研磨，過2 mm尼龍篩，混勻，用于土壤理化性質(zhì)分析；另一份置于-80 ℃冰箱保存，用于DNA提取。

1. 3 土壤性質(zhì)測定

根據(jù)中國林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LY/T 1210 1275—1999《森林土壤分析方法》（國家林業(yè)局，1999），土壤pH采用pH酸度計測定，有機質(zhì)（SOM）含量采用重鉻酸鉀氧化容量法測定，全氮（TN）含量采用半微量凱氏法測定，全磷（TP）含量采用鉬銻抗分光光度法測定，全鉀（TK）含量采用原子吸收分光光度法測定，堿解氮（AN）含量采用堿解擴散法測定，有效磷（AP）含量以NH4F-HCl溶液提取后采用紫外可見分光光度計測定，速效鉀（AK）含量采用1.0 mol/L乙酸銨浸提后以火焰光度計測定。

1. 4 高通量測序

土壤樣品送至美吉生物醫(yī)藥科技（上海）有限公司進(jìn)行DNA提取和高通量測序。參照Schloss等（2009）的方法對獲得的原始序列進(jìn)行質(zhì)量控制和過濾，得到優(yōu)化序列。在97%序列相似性基礎(chǔ)上將優(yōu)化序列劃分為可操作分類單元（OTU）。在OTU水平上計算覆蓋度指數(shù)（Coverage）、豐富度指數(shù)（Chao1和Ace）和多樣性指數(shù)（Shannon-wienner和Simpson）。對比UNITE （Release 7.0 http：//unite.ut.ee/index.php）數(shù)據(jù)庫，使用BLAST對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行注釋，并在門和綱分類水平上統(tǒng)計群落組成。

1. 5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用DPS 7.05進(jìn)行方差分析；采用Canoco 4.5進(jìn)行真菌群落多樣性指數(shù)與土壤性質(zhì)各因子的冗余分析（RDA）；在門分類水平上計算各真菌類群的OTU與土壤性質(zhì)各因子的Pearson相關(guān)系數(shù)，并基于Bray-Curtis距離進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同林齡橡膠林的土壤性質(zhì)

由表1可知，5和10年生橡膠林的土壤pH較高，二者間差異不顯著（P>0.05，下同），但極顯著高于其他林齡橡膠林（P<0.01，下同），18年生橡膠林的土壤pH極顯著高于13、25和30年生橡膠林，13、18和30年生橡膠林的土壤pH極顯著高于25年生橡膠林。不同林齡橡膠林樣地土壤pH均小于5.00，呈酸性，且以5和10年生橡膠林樣地土壤的酸性相對較弱。

土壤有機質(zhì)和全氮含量以5、25和30年生橡膠林較高，10、13和18年生橡膠林較低；全鉀含量以30年生橡膠林最高，10和13年生橡膠林較低，5、18和25年生橡膠林間差異不顯著；各林齡橡膠林間的土壤全磷含量差異不顯著；堿解氮含量以10年生橡膠林最低，且極顯著低于其他林齡橡膠林；有效磷含量以25年生橡膠林最高，10年生橡膠林最低，5、13、18和30年生橡膠林間差異不顯著；速效鉀含量以25和30年生橡膠林較高，其次為5年生橡膠林，13和18年生橡膠林間差異不顯著。說明不同林齡橡膠林的土壤養(yǎng)分存在明顯差異，其中以10和13年生橡膠林的土壤養(yǎng)分含量相對較低。

2. 2 不同林齡橡膠林土壤真菌群落豐度及多樣性

由表2可知，從6個林齡橡膠林18份土壤樣品中共獲得563658條高質(zhì)量的ITS序列，在97%序列相似性基礎(chǔ)上可劃分為10943個OTUs。各林齡橡膠林土壤真菌的Coverage指數(shù)介于0.9914～0.9940，說明測序數(shù)據(jù)量合理，測序數(shù)據(jù)基本涵蓋了橡膠林土壤中所有的真菌類群，能體現(xiàn)橡膠林真實土壤環(huán)境中真菌的特征。Coverage 指數(shù)以13年生橡膠林最高，顯著高于18和30年生橡膠林，5、10、18和25年生橡膠林間的Coverage 指數(shù)差異不顯著，但均明顯高于30年生橡膠林。Ace指數(shù)介于601～824，Chao1指數(shù)介于598～815，Shannon-wienner指數(shù)介于3.77～4.40，Simpson指數(shù)介于0.035～0.098。其中，Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)均以25年生橡膠林最低，且極顯著低于30年生橡膠林；5、10、13、18和30年生橡膠林間的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)差異不顯著；不同林齡橡膠林土壤真菌群落的Shannon-wienner和Simpson指數(shù)差異不顯著。綜上所述，以25年生橡膠林的土壤真菌豐度最低，而5、10、13、18和30年生橡膠林間的土壤真菌豐度差異不明顯；橡膠林土壤真菌的多樣性在不同林齡間無明顯差異。

2. 3 不同林齡橡膠林的土壤真菌群落組成

2. 3. 1 橡膠林土壤真菌群落的基本組成 由圖1可看出，海南大豐農(nóng)場橡膠林的土壤真菌群落66.15%隸屬于6個門，分別為Ascomycota（子囊菌門）、Zygomycota（接合菌門）、Basidiomycota（擔(dān)子菌門）、Rozellomycota、Glomeromycota（球囊菌門）和Chytridiomycota（壺門菌門）。其中Ascomycota的相對豐度為44.01%，Zygomycota和Basidiomycota作為土壤真菌群落組成的主要類群，相對豐度分別為12.51%和9.23%，占整個真菌群落的65.75%。

從圖2可看出，在綱分類水平上，海南大豐農(nóng)場橡膠林土壤真菌群落隸屬于25個綱，分別為Ascomycota unclassified（子囊菌門未分類綱）、Sordariomycetes（糞殼菌綱）、Zygomycota incertae sedis（接合菌門未命名綱）、Agaricomycetes（傘菌綱）、Tremellomycetes（銀耳綱）、Dothideomycetes（座囊菌綱）、Eurotiomycetes（散囊菌綱）、Ascomycota incertae sedis（子囊菌門未命名綱）、Leotiomycetes（錘舌菌綱）、Archaeorhizomycetes（古菌根菌綱）、Basidiomycota unclassified（擔(dān)子菌門未分類綱）、Rozellomycota unidentified、Glomeromycetes（球囊菌綱）、Pezizomycetes（盤菌綱）、Chytridiomycetes（壺菌綱）、Orbiliomycetes（圓盤菌綱）、Saccharomycetes（酵母菌綱）、Wallemiomycetes（節(jié)擔(dān)菌綱）、Microbotryomycetes（微球黑粉菌綱）、Basidiomycota incertae sedis（擔(dān)子菌門未命名綱）、Atractiellomycetes、Chytridiomycota unclassified（壺菌門未分類綱）、Exobasidiomycetes（外擔(dān)菌綱）、Ustilaginomycetes（黑粉菌綱）和Geoglossomycetes。其中前8個綱的相對豐度均大于2.00%，分別隸屬于Ascomycota、Zygomycota和Basidiomycota 3個真菌門。

2. 3. 2 不同林齡橡膠林土壤真菌群落組成的變化

由表3可知，在門分類水平上，5～30年生橡膠林間Ascomycota和Chytridiomycota的相對豐度無顯著差異；13年生橡膠林Zygomycota的相對豐度顯著高于5和25年生橡膠林，其他橡膠林間的相對豐度差異不顯著；10年生橡膠林Basidiomycota的相對豐度最高，顯著高于5和18年生橡膠林，而5、13、18、25和30年生橡膠林間的相對豐度差異不顯著；Glomeromycota的相對豐度以5年生橡膠林最高，極顯著高于10～30年生橡膠林，18年生橡膠林未發(fā)現(xiàn)Glomeromycota，10、13、25和30年生橡膠林間的相對豐度差異不顯著；25年生橡膠林Rozellomycota的相對豐度極顯著高于其他林齡橡膠樹，13和18年生橡膠林未發(fā)現(xiàn)Rozellomycota?？梢?，在門分類水平上，不同林齡橡膠林的土壤真菌群落組成差異主要體現(xiàn)在Zygomycota、Basidiomycota、Glomeromycota和Rozellomycota 4個門類群相對豐度的不同。

2. 4 不同林齡橡膠林土壤真菌群落與土壤性質(zhì)的相關(guān)性

RDA分析結(jié)果（圖3）表明，橡膠林土壤真菌群落的Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon-wienner指數(shù)與全鉀、有機質(zhì)、全氮、速效鉀及有效磷含量呈正相關(guān)（其中與全鉀含量呈極顯著正相關(guān)，與速效鉀含量呈顯著正相關(guān)），而與pH和全磷含量呈負(fù)相關(guān)；Simpson指數(shù)與全鉀、有機質(zhì)、全氮、速效鉀和有效磷含量呈負(fù)相關(guān)，與pH和全磷含量呈正相關(guān)。說明橡膠林土壤真菌偏好酸性土壤，且其豐度和多樣性與土壤養(yǎng)分含量密切相關(guān)，尤其與鉀元素含量相關(guān)更密切。

在門分類水平上，Zygomycota與速效鉀、全磷和有機質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)；Basidiomycota與堿解氮、全鉀、全氮和有機質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)；Ascomycota與速效鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與pH呈顯著正相關(guān)；Rozellomycota與速效鉀和全磷含量呈顯著正相關(guān)。說明橡膠林土壤中不同真菌類群與營養(yǎng)元素含量的相互關(guān)系存在差異。

從圖4可看出，根據(jù)各真菌門OTU與土壤性質(zhì)各因子的關(guān)系，可將橡膠林土壤真菌群落分為四大類，其中，Zygomycota和Basidiomycota歸為一類，Ascomycota和Chytridiomycota歸為一類，Glomeromycota單獨為一類，F(xiàn)ungi unclassified和Rozellomycota歸為一類。說明橡膠林土壤中不同真菌類群與土壤環(huán)境因子的相互關(guān)系既有相似性又存在差異。

3 討論

本研究采用高通量測序技術(shù)詳細(xì)分析了橡膠林土壤真菌多樣性及其群落組成，結(jié)果表明，橡膠林土壤真菌群落在門分類水平上的優(yōu)勢類群為子囊菌門，其次為接合菌門和擔(dān)子菌門，與Frey等（2004）、Curlevski等（2010）、Wu等（2013）的研究結(jié)果相似。Frey等（2004）研究認(rèn)為，子囊菌門和接合菌門真菌多數(shù)為腐生菌，對分解植物殘體和降解土壤有機質(zhì)具有重要作用，而擔(dān)子菌分解木質(zhì)纖維素的能力較強。Curlevski等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，澳大利亞亞熱帶森林土壤中的子囊菌門真菌群落多于擔(dān)子菌門和接合菌門。Wu等（2013）研究認(rèn)為，中國亞熱帶森林土壤的真菌群落主要是擔(dān)子菌門、子囊菌門和接合菌門。子囊菌門、接合菌門和擔(dān)子菌門是橡膠林土壤真菌群落中的主要菌群，可能與橡膠林林下存在大量凋落物需要分解有關(guān)。董愛榮等（2004）、李海濤等（2010）研究認(rèn)為，凋落物是土壤微生物攝取營養(yǎng)和能量的來源，凋落物的豐富程度和品質(zhì)高低直接決定微生物的數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)；真菌是生態(tài)系統(tǒng)中重要的分解者，對難以分解的纖維素和木質(zhì)素，主要依賴于真菌的作用。

已有研究認(rèn)為，在森林生態(tài)系統(tǒng)中，土壤真菌多樣性和群落組成受多種因素影響，如土壤環(huán)境（Dickie et al.，2002）、植物多樣性（Sun et al.，2016）和林齡（Zhu et al.，2010），而多數(shù)橡膠林土壤質(zhì)量較差，其土壤真菌多樣性低于周圍的天然林（Osemwegie，2010；Zhang et al.，2013），不同林齡橡膠林土壤性質(zhì)和養(yǎng)分含量的變化可能會影響土壤微生物群落的多樣性及其組成（Herrmann et al.，2016）。本研究的RDA分析結(jié)果表明，橡膠林土壤真菌群落的豐度和多樣性與有機質(zhì)、全氮、全鉀、速效鉀和堿解氮含量呈正相關(guān)，說明土壤養(yǎng)分是影響橡膠林土壤真菌的重要因素，與Guo等（2013）、Lan等（2017）的研究結(jié)果相似。此外，橡膠林土壤真菌群落的豐度和多樣性與鉀元素含量密切正相關(guān)，可能與真菌對鉀具有活化作用有關(guān)，外生菌根真菌可不同程度地活化土壤鉀（張亮等，2014）。常強強等（2017）的研究結(jié)果也表明，青檀根際土壤真菌多數(shù)OTU與速效鉀含量呈正相關(guān)。

4 結(jié)論

高通量測序技術(shù)能全面反映海南大豐農(nóng)場橡膠林土壤中的真菌群落狀況。不同林齡橡膠林間土壤真菌群落的多樣性無明顯差異；而真菌群落豐度以25年生橡膠林最低，5、10、13、18和30年生橡膠林間差異不明顯。真菌群落組成的優(yōu)勢類群為子囊菌門、接合菌門和擔(dān)子菌門。土壤養(yǎng)分含量（尤其是鉀元素含量）是影響橡膠林土壤真菌多樣性的重要因素。

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（責(zé)任編輯 思利華）