魚類肽聚糖識別蛋白的研究進展

夏洪麗 程俊 喻大鵬 陳文捷，4 魯義善

（1. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院，深圳 518116；2. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524003；3. 廣東省水生動物健康評估工程技術(shù)研究中心，深圳 518116；4.中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢 430072）

近年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，養(yǎng)殖業(yè)面臨的諸多問題也日益突出，尤其是病原感染引起的水產(chǎn)病害，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。疾病的發(fā)生是由病原、宿主和環(huán)境三者相互作用的結(jié)果，其中宿主的免疫應(yīng)答對抵御病原微生物的感染具有重要作用，因此研究魚類免疫應(yīng)答機制一直是學(xué)術(shù)界的熱點，特別是在胚胎發(fā)育早期發(fā)揮關(guān)鍵作用的先天性免疫。肽聚糖識別蛋白（Peptidoglycan recognition proteins，PGRPs）作為一種重要的模式識別受體，在魚類抵御病原侵染過程中扮演著十分重要的角色。目前有關(guān)魚類PGRPs的研究已經(jīng)取得了一定的進展，本文綜述了魚類PGRPs的結(jié)構(gòu)、表達及其功能，旨在為魚類先天性免疫的研究提供理論參考。

1 PGRPs的發(fā)現(xiàn)

肽聚糖識別蛋白（Eptidoglycan recognition proteins，PGRPs）是一類可識別肽聚糖（Peptidoglycan，PGN）的模式識別受體家族，最早發(fā)現(xiàn)于家蠶血淋巴中［1］。隨后，在昆蟲［2］、棘皮動物［3］和脊椎動物［4-5］中相繼被發(fā)現(xiàn)。目前已報道的魚類PGRP共23種（表1）。根據(jù)氨基酸序列的不同，PGRPs主要分為3類：短型PGRPs（Short-PGRPs，PGRP-S）、中型 PGRPs（Intermediate-PGRPs，PGRP-I）和長型PGRPs（Long-PGRPs，PGRP-L）［6］。果蠅 PGRPs主要分為兩類：一類是較短的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，包括PGRPSA、-SB1、-SB2、-SC1A、-SC1B、-SC2和-SD；另一類是較長的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，包括PGRP-LAa、-LAb、-LAc、-LB、-LCa、-LCx、-LCy、-LD、-LE 和 -LF［5，7］。哺乳動物PGRPs有不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：PGRP-S、PGRP-Iα、PGRP-Iβ 和 PGRP-L，也稱為 PGLYRP-1、PGLYRP-2、PGLYRP-3 和 PGLYRP-4［3，8］。 迄 今，在包括斑馬魚（Danio rerio）［9-11］、巖魚（Sebastes schlegeli）［12］、 美 國 紅 魚（Sciaenops ocellatus）［13］、草 魚（Ctenopharyngodon idella）［14-16］、 斑 點 叉 尾鮰（Ictalurus punctatus）［17］、大黃魚（Pseudosciaena crocea）［18］、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）［19］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［20-21］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［22］、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）［23］和尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）［24］等魚類中發(fā)現(xiàn)3類PGRPs，其中PGLYRP-2與哺乳類PGLYRP-2為同源物，而PGLYRP-5（也稱為PGRPSC）和PGLYRP-6則是魚類所特有的［17］。

表1 11種硬骨魚的肽聚糖識別蛋白

2 PGRPs的結(jié)構(gòu)與表達

在結(jié)構(gòu)上，所有PGRPs的C端通常包含至少一個高度保守的PGRP結(jié)構(gòu)域，與噬菌體T7溶菌酶和細菌的II型酰胺酶有一定的相似性，而PGRPs在N端的序列長度差異較大，在不同生物間并不保守［3］。人類PGRPs都含有信號肽結(jié)構(gòu)，而信號肽是蛋白質(zhì)經(jīng)典分泌途徑的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)；然而，斑馬魚PGRP2，PGRP5并不含信號肽結(jié)構(gòu)，但斑馬魚PGRPs也均是分泌蛋白［5，25-26］，其機制尚不明確。盡管魚類PGRPs在大小、結(jié)構(gòu)域布局及亞細胞定位方面有一定差異，但其C端的PGRP結(jié)構(gòu)域是高度保守的。哺乳動物PGRP結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)象是由位于中心的幾個 β 片層和外圍的 3 個 α 螺旋（α1-α3）組成［27］。研究表明，魚類PGRPs也有類似的結(jié)構(gòu)，而個別剪切體因某個氨基酸位點的缺失，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)上稍有不同［9，16，24］。

PGRP結(jié)構(gòu)域都含有高度保守的半胱氨酸位點，其形成的二硫鍵是賦予PGRPs功能活性和維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定所必須的重要結(jié)構(gòu)［28］。研究表明，該結(jié)構(gòu)域中的某半胱氨酸位點突變將使其喪失酰胺酶活性［29-31］。晶體結(jié)構(gòu)顯示，PGRP結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的正面凹槽含有保守的Zn2+結(jié)合位點，由兩個組氨酸、一個酪氨酸和一個半胱氨酸組成，是結(jié)合肽聚糖的活性中心；其另一面為PGRP特異，且不保守的疏水區(qū)域，不同于催化酰胺鍵水解反應(yīng)的II型酰胺酶結(jié)構(gòu)［31-34］。研究表明，結(jié)合PGN的凹槽結(jié)構(gòu)被破壞后，將使其無法識別PGN，從而失去酰胺酶活性［29-30］。通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)，魚類PGRPs基本也都含有4個Zn2+結(jié)合位點，如圖1所示。說明魚類PGRPs與哺乳動物可能有類似的功能，但其作用機制是否也依賴于半胱氨酸殘基還有待進一步研究。

魚類PGRPs在不同器官/組織中廣泛表達，但其表達組織和表達量都存在明顯差異。與斑馬魚PGRP2類似，美國紅魚、大黃魚和大菱鲆PGRP2在各組織中普遍存在，尤其在肝臟中表達量最高［9，13，18，22］。巖魚 PGRP-L1 在腸和脾臟中表達量較高；其次是鰓和皮膚等，而PGRP-L2僅在肝臟中表達［12］。實驗表明，在不同細菌的刺激下，魚類PGRPs在各免疫組織的表達量均明顯改變。因此推測魚類PGRPs參與了機體的免疫應(yīng)答過程，且發(fā)揮效應(yīng)的部位各不相同，如草魚PGRP6a、PGRP6d通過鰓和皮膚發(fā)揮作用，而PGRP6b的效應(yīng)部位是腸，脾臟和肝臟等［16］。魚類PGRPs的廣泛表達將有利于機體及時將體內(nèi)感染的病原體清除。同時，在非免疫組織中的表達說明PGRPs在生理過程過可能也扮演著重要角色。此外，實驗表明，魚類PGRPs在胚胎發(fā)育早期階段的先天性免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［18，26］。

圖1 魚類肽聚糖識別蛋白的多序列比對結(jié)果

3 PGRPs的進化

利用生物信息學(xué)軟件 Clustalx 和 MEGA5.0構(gòu)建了N -J（Neighbor-joining）進化樹，對來自人類、小鼠、原雞、非洲爪蟾和斑馬魚等14個物種（表2）的PGRPs 的進化關(guān)系進行分析，結(jié)果表明，不同物種的PGRP-S和 PGRP-L分別獨立進化，即同種類型PGRPs聚為一支，而與本物種的其他類型PGRPs同源性相對較低，這與以往的報道高度一致［3，35］（圖 2）。

表2 14個物種的肽聚糖識別蛋白

4 PGRPs的功能

4.1 病原識別能力

PGN是幾乎所有細菌細胞壁的主要成分，包括L-賴氨酸（Lys型）和二氨基庚二酸（Dap型）兩種類型，Lys 型 PGN主要存在于革蘭氏陽性菌中，而Dap 型 PGN 是革蘭氏陰性菌的主要組成成分［36］。當細菌或其他含PGN的外源物體侵染機體時，能被宿主PGRPs識別并與之結(jié)合，從而激發(fā)機體的免疫效應(yīng)。人PGLYRP3結(jié)合PGN后，其PGRP結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象隨即發(fā)生改變，將目標物固定在凹槽內(nèi)，提高結(jié)合過程的親和力［34，36-38］。研究表明，魚類PGRPs能夠結(jié)合 Lys型和 Dap 型兩種 PGN［14-15，26］。除了PGN以外，人和鼠PGRPs還能夠結(jié)合脂膦壁酸（LTA），脂多糖（LPS）等聚合物，但對后兩者的親和力明顯較低，但豬PGLYRP1對LTA和LPS有很強的親和力［39-41］。根據(jù)文獻報道，PGN、脂膦壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）和Ploy I：C均能夠誘導(dǎo)草魚PGRP5和PGRP6的高表達［14-16］。說明草魚PGRP5、PGRP6與哺乳動物PGRPs類似，能夠識別不同的病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMPs），至于其相互作用的親和力是否有差異，還有待進一步的研究。

4.2 酰胺酶活性

PGRPs能夠水解細菌肽聚糖中N -乙酰胞壁酸與 L-丙氨酸之間的酰胺鍵，將有活性肽聚糖的分子片段化，從而使其失去活性，達到清除細菌的目的［31，42］。人 PGLYRPs中，僅 PGLYRP2具有酰胺酶活性［36］。研究表明，保守的Zn2+結(jié)合位點對于PGRPs發(fā)揮酰胺酶活性是必須的［33-34］。如圖2所示，魚類PGRPs的C端含有保守的半胱氨酸殘基，暗示其和人PGLYRP2一樣，都具有酰胺酶活性。文獻報道多種魚類的PGRPs都具有酰胺酶活性，且呈Zn2+依賴性［11-15，23-24］，2012 年，孫黎等克隆美國紅魚PGLYRP2和PGLYRP2-AD（酰胺酶結(jié)構(gòu)域），分別進行原核表達，分離純化重組蛋白，并進行枯草芽孢桿菌肽聚糖的水解實驗，結(jié)果顯示，PGLYRP2和PGLYRP2-AD都具有酰胺酶活性，水解肽聚糖［13］。

4.3 殺菌、抑菌活性

當PGRP與微生物細胞壁成分結(jié)合后形成復(fù)合物，能夠激活酚氧化酶，經(jīng)過一系列反應(yīng)，將含酚的化合物氧化成醌，轉(zhuǎn)換成黑色素將微生物包裹來限制其感染［2］。哺乳動物PGRPs只有酰胺酶活性或者殺菌活性，與PGLYRP2不同，人PGLYRP-1，PGLYRP-3，PGLYRP-4在對應(yīng)Cys530位點上是絲氨酸而非半胱氨酸，無法結(jié)合Zn2+，因此PGLYRP-1，PGLYRP-3，PGLYRP-4 只有殺菌活性［30，43-44］。后兩者形成的異二聚體PGLYRP3：4也同樣有高效的殺菌作用［44］。研究表明，魚類PGRPs同一分子往往兼具酰胺酶和殺菌兩種特性［12，26］。除了酰胺酶活性以外，巖魚PGRP-L1和PGRP-L2還具有廣譜殺菌功能［12］。因此猜測PGRPs的殺菌機制與其自身的酰胺酶活性可能存在某種關(guān)聯(lián)，但目前還沒有相關(guān)的實驗證實這一猜想。斑馬魚PGRPs不僅能有效殺滅革蘭氏陽性菌，對革蘭氏陰性菌也表現(xiàn)出不同程度的殺菌作用。然而，美國紅魚PGLYRP2只對革蘭氏陽性菌有很強的殺滅作用［13］。魚類PGRPs在抗菌免疫中表現(xiàn)各異，即使同一物種的不同PGRPs分子的作用也不盡相同，至于其作用機制還有待進一步研究。

圖2 PGRPs的系統(tǒng)進化樹

4.4 免疫調(diào)節(jié)

PGRPs在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，包括免疫調(diào)節(jié)過程［31，42，45］。除了識別病原體，PGRPs還通過調(diào)節(jié)機體免疫以便能夠及時有效地清除入侵的病原體。研究表明，并非所有的PGRPs都有很強的殺菌作用。例如，半滑舌鰨PGRP-SC2并非是直接殺死細菌的效應(yīng)物，而是通過提高細胞的吞噬能力來抑制機體內(nèi)細菌的定植與傳播［23］。與此類似，羅非魚PGRP-SC2并未表現(xiàn)出明顯的殺菌作用，卻能顯著降低靶器官內(nèi)無乳鏈球菌的載量，說明其在抵抗無乳鏈球菌感染過程中扮演著重要角色［24］。

起初認為PGRPs是一個簡單的效應(yīng)分子，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)昆蟲PGRPs能夠激活Toll或IMD信號傳導(dǎo)通路或誘導(dǎo)蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)，從而提高抗菌免疫反應(yīng)［45］。研究表明，魚類PGRPs不僅是典型的模式識別受體，還可介導(dǎo)細胞內(nèi)的Toll、MAPK、JAK/STAT和NF-KB多條信號通路，從而調(diào)節(jié)下游免疫相關(guān)基因的表達。由于昆蟲PGRPs的水解肽聚糖的酰胺酶活性，可以防止機體出現(xiàn)過度炎癥反應(yīng)，因此推測哺乳動物PGRPs也有抗炎效應(yīng)［42，46-47］。然而，與預(yù)期結(jié)果相反，實驗表明哺乳動物PGLYRP2在PGN感染機體過程中發(fā)揮了促炎效應(yīng)［48］。為探究魚類 PGRPs的功能，Jang 等［20］通過構(gòu)建酰胺酶失活突變體，發(fā)現(xiàn)虹鱒PGRP-L1能夠抑制IL-1β和TNF-a等下游炎性因子的表達，說明虹鱒PGRP-L1發(fā)揮了抗炎功能，且該調(diào)節(jié)機制與其酰胺酶活性無關(guān)。此外，魚類PGRPs能促進穿孔素、抗菌肽的分泌，從而在機體的抗菌免疫反應(yīng)中發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)［16］。

選擇性剪切是單個基因剪切合成多功能信使RNA的過程，是真核生物中普遍存在的一種現(xiàn)象，會影響免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)和功能［49］。草魚PGRP6的不同剪切體雖然都能抑制體內(nèi)細菌的增長，但其作用機制也各不相同。PGRP6a，PGRP6b和PGRP6c能誘導(dǎo)鐵調(diào)素和G-溶菌酶的表達，而草魚PGRP6和PGRP6d卻無此功能。另外，4個剪切體中只有PGRP6c能夠影響穿孔素的分泌，說明在抑菌活性的基礎(chǔ)上，草魚PGRP6的不同剪切體還有功能特異性［16］。

5 展望

PGRPs在機體先天性免疫過程中發(fā)揮著重要作用，目前有關(guān)魚類PGRPs的研究已經(jīng)取得了一定的進展，然而對其作用機制的研究還不夠深入。PGRP-L的N端幾乎占據(jù)整個分子的2/3，該段蛋白的結(jié)構(gòu)差異較大的原因是什么，以及發(fā)揮的作用是怎樣的；PGRPs的殺菌作用與酰胺酶活性是否存在一定的聯(lián)系。以往的報道發(fā)現(xiàn)，PGRPs能夠抵御真菌的感染，且軟體動物PGRPs對寄生蟲刺激也有一定的防御作用，那么魚類PGRPs是否也有類似的功能。

免疫信號通路是一個十分復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。PGRPs作為分泌蛋白，卻能顯著抑制NF-kB活性，因此，推測細胞內(nèi)可能存在某種表面受體來協(xié)助PGRP完成信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，至于受體是什么又是如何發(fā)揮作用的，就不得而知了。研究表明，虹鱒PGRP-L1和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（Nucleotide-binding oligomerization domains，NODs）在抗菌免疫應(yīng)答中存在相互依賴，并能夠調(diào)節(jié)部分炎癥因子的表達，但對IL-10的表達卻沒有任何影響［50］。那么PGRPs與其他免疫信號是否也有一定的關(guān)聯(lián)；又是如何影響下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以上問題都需要進一步的研究探索。