DLL4蛋白真核表達(dá)及多克隆抗體制備

金巧 甘志凱 周鵬 劉霞

（南昌理工學(xué)院，南昌 330000）

Notch信號(hào)通路最初由Morgan和Bridges于1919年通過(guò)遺傳研究發(fā)現(xiàn)，其主要調(diào)控細(xì)胞的凋亡、增殖和分化等重要生命過(guò)程［1］。在哺乳動(dòng)物中，Notch 信號(hào)通路有4個(gè)受體（Notch1、Notch2、Notch3和 Notch4） 和 5個(gè) 配 體（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1和Jagged2），其中2個(gè)配體Jagged1和DLL4在血管生成過(guò)程中起到重要作用，特別是DLL4，其主要在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，從根本上調(diào)控腫瘤血管發(fā)生和生長(zhǎng)［2-3］。

人源DLL4蛋白是I型單次跨膜蛋白，由658個(gè)氨基酸組成，其胞外區(qū)有與Notch 受體結(jié)合及活化的表皮生成因子（Epidermal growth factor，EGF）樣的8個(gè)重復(fù)序列，1個(gè)高度保守的Delta/Serrate/LAG-2（DSL）區(qū)域和4個(gè)糖基化位點(diǎn)，分子量為57 kD，而胞內(nèi)區(qū)在DLL4與Notch結(jié)合之后，會(huì)被剪切加工成活性位點(diǎn)，激活下游分子，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄［4］。正常情況下，DLL4表達(dá)于脈管系統(tǒng)，如發(fā)育中的胚胎、成年組織血管新生過(guò)程中的動(dòng)脈、小動(dòng)脈及毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞上，而靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和處于靜止的血管不表達(dá)DLL4，病理情況下，可見(jiàn)實(shí)體瘤組織中DLL4表達(dá)量上調(diào)［5-7］。目前，在臨床上，DLL4是一種新型腫瘤分子標(biāo)記物，具有高敏性，可用于腫瘤預(yù)后診斷。此外，由于舊靶點(diǎn)抗體療法耐藥性的出現(xiàn)，通過(guò)阻斷DLL4和Notch受體的結(jié)合抑制腫瘤血管的生成，從而達(dá)到抗腫瘤治療效果，已成為一種新的癌癥治療策略。

本研究旨在通過(guò)HEK 293F細(xì)胞對(duì)人源DLL4胞外區(qū)蛋白進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，利用Dot blotting、Western blotting和Fortebio大分子互作儀檢測(cè)DLL4的活性，同時(shí)制備兔子多克隆抗體，為下一步研究DLL4蛋白功能、開(kāi)發(fā)臨床腫瘤篩查試劑盒以及免疫治療奠定基礎(chǔ)。

圖1 Notch信號(hào)通路配體和受體［2］

1 材料與方法

1.1 材料

人源DLL4 cDNA購(gòu)自于北京義翹神州有限公司，tPA cDNA為本實(shí)驗(yàn)室保存，感受態(tài)DH5α購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。DL15 000 DNA Marker、T4 DNA ligase、生物素化試劑購(gòu)自于Thermo公司；切膠回收試劑盒購(gòu)自于Axygen公司；無(wú)霉毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自于Omega公司；opti-MEM、LipofectamineTM2000購(gòu)自于Invitrogen 公司；兔抗人DLL4 抗體購(gòu)自于Abcam 公司；PVDF 膜購(gòu)自于Pall公司；ECL發(fā)光試劑購(gòu)自于Millpore公司；SDS-PAGE上樣緩沖液、鼠抗His標(biāo)簽一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自于康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；Bradford蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司；新生牛血清購(gòu)自于四季青公司；Histrap層析填料、Equilibration Buffer、Elution Buffer購(gòu)自于GE公司；鏈霉親和素傳感器購(gòu)自于Fortebio公司；基因合成和測(cè)序由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HEK293F細(xì)胞培養(yǎng)于10 %新生牛血清的opti-MEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37℃、5%CO2，每3 d傳1次代。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 以人源DLL4 cDNA為模板，PCR擴(kuò)增DLL4-6His基因，上游引物P1：GTG GAG CAG TCT TCG TTT CGA ACA GCT CCG GCG TCT TCC AGC TGC AGC TG，下游引物P2：GAT CGG ATC CCC TAT CAA TGA TGG TGG TGA TGG TGC GGC AAG CCC ACG GGG AAC TC。以tPA cDNA為模板，擴(kuò)增tPA信號(hào)肽序列，上游引物P3：CCG AGG AAT TCG CCA CCA TGG ATG CAA TGA AGA GAG GGC TC，下游引物P4：CTG CAG CTG CAG CTG GAA GAC GCC GGA GCT GTT CGA AAC GAA GAC TGC TC。以前兩步得到的DLL4-6His和tPA為模板，進(jìn)行搭橋PCR，構(gòu)建tPA-DLL4-6His基因片段，引物為P2和P3。PCR 反應(yīng)條件 ：95℃ 5 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s、68℃ 21 s，30 個(gè)循環(huán) ；68℃ 5 min。

用高保真EcoR I和BamH I分別對(duì)tPA-DLL4-6His基因和表達(dá)載體pGZX進(jìn)行雙酶切，切膠回收后，T4 DNA ligase，16℃過(guò)夜連接。然后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，涂布到含有氨芐青霉素的平板上，培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取陽(yáng)性克隆子并擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 蛋白表達(dá)與純化 轉(zhuǎn)染前1 d，將HEK293F以2×105個(gè)/mL的密度鋪于6孔板內(nèi)，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合率約為80 %，按照l(shuí)ipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，以無(wú)轉(zhuǎn)染的和轉(zhuǎn)染空載體的作為空白對(duì)照，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

在層析柱中添加Ni-NTA填料，確保填料無(wú)分層無(wú)氣泡產(chǎn)生，然后用5倍體積的Equilibration Buffer平衡柱子，取1倍體積的蛋白粗樣（經(jīng)10 000×g高速離心預(yù)處理）低速上柱，30 min后，加入3倍體積Equilibration Buffer清洗柱子，除去未結(jié)合或結(jié)合不牢的蛋白，然后用Elution Buffer進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，SDS-PAGE分析。采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。

1.2.4 Dot blotting和Western blotting 取適量蛋白粗樣，直接滴加在PVDF膜上，待自然干后，用含5%脫脂奶粉的TBST進(jìn)行2 h封閉，加入鼠抗His標(biāo)簽一抗，4℃封閉過(guò)夜，用TBST洗滌3次，每次10 min，再加入羊抗鼠帶HRP的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后，進(jìn)行ECL發(fā)光檢測(cè)。

取適量蛋白粗樣，加入SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴煮沸5 min后，經(jīng)SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉的TBST進(jìn)行2 h封閉，加入兔抗人DLL4一抗，4℃封閉過(guò)夜，用TBST洗滌3次，每次10 min，再加入羊抗兔帶HRP的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后，進(jìn)行ECL發(fā)光檢測(cè)。1.2.5 親和力檢測(cè) 將純化后的DLL4-6His進(jìn)行生物素化標(biāo)記，生物素和DLL4-6His的摩爾比為3∶1，室溫孵育30 min后，進(jìn)行過(guò)夜透析。

親和力測(cè)定采用鏈霉親和素傳感器（SA Sensor），生物素化的DLL4-6His起始濃度為25 nmol/L，2倍稀釋，5個(gè)濃度梯度。結(jié)合時(shí)間600 s，解離時(shí)間900 s，通過(guò)對(duì)照傳感器扣除本底信號(hào)后，采用1∶1結(jié)合模型去擬合結(jié)合和解離曲線，得到親和力常數(shù)。

1.2.6 多克隆抗體制備 選擇月齡3個(gè)月體重1.5 kg的大耳白兔，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)，連續(xù)觀察3 d，確定情況正常后進(jìn)行免疫。0.5 mg/只免疫DLL4蛋白，免疫采用弗氏完全佐劑，免疫第1次后，每隔一周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，一共免疫4次，取血，將血清于4℃冰箱過(guò)夜析出，離心后取上清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 抗體效價(jià)及特異性檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)，步驟如下 ：將 50 μL 0.05 μg/μL DLL4蛋白，加入到96孔板中，37℃孵育1 h，TBST洗滌后，加入200 μL 5%的脫脂奶粉的TBST，封閉2 h，然后每孔加入100 μL一抗，37℃孵育1 h，TBST洗滌后，加入二抗，37℃孵育45 min，洗滌后，加入顯影液100 μL，37℃避光孵育10 min，加入終止液，最后讀取OD450。

為了進(jìn)行抗體特異性檢測(cè)，將DLL4瞬時(shí)表達(dá)的發(fā)酵上清進(jìn)行純化，收集樣品后，進(jìn)行SDSPAGE電泳，并轉(zhuǎn)到PVDF膜上，加入不同稀釋度的抗血清，以陰性抗血清作為對(duì)照，洗滌后，加入二抗進(jìn)行孵育，最后ECL發(fā)光檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 DLL4基因的PCR擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在1.6 kb附近處有1條特異性DNA條帶，其長(zhǎng)度與tpADLL4-6His基因片段長(zhǎng)度吻合（圖2）。

圖2 DLL4基因的核酸電泳圖

2.2 表達(dá)質(zhì)粒pGZX-DLL4-6His鑒定

pGZX-DLL4-6His經(jīng)高保真（減少星號(hào)活性）EcoR I和BamH I雙酶切后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖顯示出兩條DNA條帶，大小分別為4.6 kb和1.6 kb（圖3），符合pGZX載體和DLL4基因片段的長(zhǎng)度。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，與NCBI中的DLL4序列（NM_019074.3）相同，無(wú)堿基突變。

圖3 pGZX-DLL4-6His雙酶切驗(yàn)證

2.3 DLL4蛋白表達(dá)與純化

LipofectamineTM2000介導(dǎo)pGZX-DLL4-6His轉(zhuǎn)染48 h后，離心后收集上清，SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明，被檢測(cè)的樣品在50-70 kD之間有一條較深的條帶。隨后進(jìn)行鎳柱親和純化，收集流穿、清洗和洗脫組分，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，在57 kD處得到一條粗條帶，大小符合DLL4-6His的分子量，且純度達(dá)到95%。

2.4 Dot blotting和Western blotting檢測(cè)

Dot blotting檢測(cè)結(jié)果（圖5-A）顯示，發(fā)酵上清液中含有帶6His標(biāo)簽的蛋白，隨后進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，進(jìn)一步確定是否為DLL4-6His蛋白。結(jié)果如圖5-B所示，在57 kD處出現(xiàn)一條特異性的條帶，以上結(jié)果說(shuō)明通過(guò)瞬轉(zhuǎn)，可以在293F細(xì)胞發(fā)酵上清液中獲得具有免疫原性的DLL4蛋白。

圖4 DLL4-6His蛋白的純化

圖5 DLL4-6His蛋白Dot blotting和Western blotting檢測(cè)

2.5 親和力檢測(cè)

采用Fortebio公司出產(chǎn)的Octet Red96分子互作儀來(lái)檢測(cè)DLL4是否可以用于抗體的親和力檢測(cè)。結(jié)果如圖6所示，擬合曲線和實(shí)際曲線吻合較好，曲線之間分布均勻，KD值為1.848E-10，R2= 0.999，符合商業(yè)化抗體親和力大小，結(jié)果可信。

圖6 DLL4蛋白親和力檢測(cè)

2.6 DLL4抗血清效價(jià)及特異性檢測(cè)

兔子經(jīng)過(guò)3次免疫后，獲得DLL4蛋白抗血清，經(jīng)ELISA法檢測(cè)（圖7-A），其效價(jià)可達(dá)到1∶12 800。Western blotting結(jié)果（圖7-B）顯示不同稀釋度的DLL4抗血清出現(xiàn)明顯條帶，而陰性對(duì)照無(wú)對(duì)應(yīng)的條帶。

圖7 DLL4多克隆抗體效價(jià)及特異性檢測(cè)

3 討論

臨床數(shù)據(jù)表明，DLL4蛋白與多種實(shí)體瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。在乳腺癌上，DLL4在青年型乳腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為73.33%，顯著高于中老年型乳腺癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率（P＜ 0.05），且DLL4高表達(dá)使青年型乳腺癌相對(duì)于中老年型乳腺癌更具有侵襲性［9-11］。在肺鱗癌上，DLL4與腫瘤大小呈正相關(guān)（r=0.475，P＜ 0.05），且在肺鱗癌間質(zhì)中高表達(dá)，提示DLL4可能促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［12］，在非小細(xì)胞肺癌上，DLL4表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌組織的分化程度和TNM分期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.05）［13］。在大腸癌上，DLL4在大腸癌組織中陽(yáng)性檢測(cè)率為75%，與癌旁組織的檢測(cè)率（23.81%）存在顯著差異（P＜ 0.001），且與大腸癌的浸潤(rùn)程度、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)［14-15］。此外，DLL4還與膀胱尿路上皮癌、胰腺癌、骨肉瘤等惡性腫瘤相關(guān)。因此，DLL4作為分子標(biāo)記物，可用于多種實(shí)體瘤的診斷及預(yù)后診斷。

近年來(lái)，DLL4在臨床腫瘤篩查及靶向治療方面的應(yīng)用價(jià)值逐漸被重視，尤其是在抗血管生成療法如抗VEGF-A和抗VEGF-2R受體治療耐藥出現(xiàn)后，DLL4逐漸成為了腫瘤靶向治療的新靶點(diǎn)［16］。目前，國(guó)外要比國(guó)內(nèi)較早注意到DLL4的價(jià)值，市場(chǎng)上，DLL4相關(guān)進(jìn)口試劑盒占據(jù)主要市場(chǎng)，且有研究表明，DLL4雙特異性單克隆抗體和納米抗體都已制備出［17-18］。另外，DLL4在研藥物有OncoMed公司的Demcizumab，一種雙特異性單克隆抗體，現(xiàn)已通過(guò)安全評(píng)估階段；Regeneron公司的Enoticumab，一種人源化的單克隆抗體，作為免疫調(diào)節(jié)劑，現(xiàn)已進(jìn)入臨床I期。而國(guó)內(nèi)，無(wú)論是在科研界還是在工業(yè)界都進(jìn)展相對(duì)緩慢，抗DLL4靶向治療仍處于臨床前研究，浙江海正藥業(yè)、百濟(jì)神州正在加緊研究，旨在加速將這一早期研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，為我國(guó)癌癥患者提供一種新的治療希望和途徑。

本研究將目的基因DLL4胞外區(qū)克隆到真核表達(dá)載體pGZX中，并轉(zhuǎn)染到HEK 293F細(xì)胞中進(jìn)行真核表達(dá)。tpA信號(hào)肽具備分泌信號(hào)肽的典型特征，同時(shí)含有一個(gè)KOZARK增強(qiáng)子，可有效促進(jìn)異種蛋白分泌，是目前應(yīng)用最廣泛的外源性信號(hào)肽之一［19］。前期實(shí)驗(yàn)中，對(duì)比過(guò)lgK信號(hào)肽和tpA信號(hào)肽，結(jié)果表明，tpA信號(hào)肽更加有助于DLL4蛋白的分泌表達(dá)。HEK 293F細(xì)胞是人源化細(xì)胞，可以對(duì)目的蛋白進(jìn)行糖基化、磷酸化等翻譯后修飾，有助于獲得天然構(gòu)象的蛋白，保持蛋白的生物活性。而帶有6His標(biāo)簽，有利于快速的親和純化，簡(jiǎn)化了純化流程。Dot blotting、Western blotting和大分子互作儀檢測(cè)結(jié)果表明，真核表達(dá)出的DLL4-6His蛋白具有免疫原性，且6His標(biāo)簽并不影響DLL4的蛋白活性。葉建斌等［20］通過(guò)pCMV-Tag4構(gòu)建了DLL4真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中成功地表達(dá)出DLL4。與其不同的是，本研究采用HEK 293F細(xì)胞為懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，便于后期進(jìn)行中大規(guī)模的生產(chǎn)，同時(shí)帶有6His標(biāo)簽，經(jīng)一步純化，可以得到純度為95%的DLL4蛋白，另外，首次利用大分子互作儀進(jìn)行DLL4生物活性檢測(cè)，得出具體的數(shù)值，使得結(jié)論更加可信。通過(guò)免疫兔子，成功制備出DLL4多克隆抗體，通過(guò)ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其效價(jià)可達(dá)到1∶12 800倍，Western blotting表明，其具有良好的特異性。

4 結(jié)論

克隆得到人源DLL4胞外區(qū)，構(gòu)建真核表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒pGZX-DLL4-6His，并成功在HEK 293F細(xì)胞中分泌表達(dá)，基于親和純化得到的DLL4蛋白免疫兔子，制備了多克隆抗體，Western blotting顯示該抗體具有較好的特異性。