人尿源干細(xì)胞的分離與鑒定

王福平 張鋒 趙同標(biāo)

（1. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 071002；2. 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京100101）

人尿源干細(xì)胞（Human urine-derived stem cells，hUSCs）是人尿液中具有良好增殖活性和多向分化能力的成體干細(xì)胞，約占尿液中存活細(xì)胞的0.2%，具有間充質(zhì)干細(xì)胞的各種生物學(xué)特性［1］。hUSCs具有來源廣泛、取材安全、操作簡(jiǎn)單、成本低、自我更新和多向分化能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是再生醫(yī)學(xué)理想的種子細(xì)胞來源［2］。目前細(xì)胞治療和組織工程處于快速發(fā)展期，人們已經(jīng)開始探索利用hUSCs來實(shí)現(xiàn)疾病治療、組織再生或器官重建，例如利用hUSCs進(jìn)行個(gè)體化的腎遺傳疾病的治療［3］、hUSCs與β-TCP結(jié)合可以應(yīng)用于骨再生［4］、通過激活信號(hào)通路的Wnt/β-catenin誘導(dǎo)hUSCs為成骨細(xì)胞［5］、移植過表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的自體hUSCs重建泌尿生殖器［6］等。除了人尿源干細(xì)胞本身有多種用途，hUSCs還可以重編程為高質(zhì)量的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs），給 iPSCs的臨床應(yīng)用帶來光明前景［7］。2012年，研究人員利用逆轉(zhuǎn)錄病毒成功將hUSCs重編程為iPSCs，并經(jīng)克隆形態(tài)、AP染色、SSEA-4表達(dá)和三胚層分化等驗(yàn)證其為高質(zhì)量的iPSCs［8］。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒實(shí)現(xiàn)重編程得到的iPSCs安全性低，應(yīng)用臨床風(fēng)險(xiǎn)大，因此研究人員努力探索如何通過非整合的方法實(shí)現(xiàn)hUSCs重編程為iPSCs。2017年，美國(guó)科學(xué)家成功利用仙臺(tái)病毒的非整合方法實(shí)現(xiàn)了尿源干細(xì)胞的重編程，得到了克隆形態(tài)良好、細(xì)胞核型正常和多能性標(biāo)志物高表達(dá)的iPSCs，使hUSCs的應(yīng)用價(jià)值得到提升。

人尿液中存活的細(xì)胞可分為終末分化的細(xì)胞、未完全分化的祖細(xì)胞和未分化的干細(xì)胞，其中未分化的干細(xì)胞就是人尿源干細(xì)胞［9］。早在1972年，Sutherland和Bain［10］在Nature上首次報(bào)道新生兒尿液中脫落細(xì)胞的成功培養(yǎng)，這些在尿液中分離和培養(yǎng)的細(xì)胞主要來自于腎單元、輸尿管、膀胱和尿道等脫落的上皮細(xì)胞［11］。1991年，研究人員發(fā)現(xiàn)不僅僅是在新生兒的尿液中，在泌尿系統(tǒng)疾病的患者尿液中也可以培養(yǎng)出有增殖活性的祖細(xì)胞［12］。2008年，Zhang等［13］首次采用富含EGF的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基和胚胎纖維母細(xì)胞培養(yǎng)基的等比例混合液從人尿液中分離培養(yǎng)出干細(xì)胞，命名為人尿源干細(xì)胞，此類細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，具有克隆性，可表達(dá)多數(shù)間充質(zhì)干細(xì)胞和外周細(xì)胞標(biāo)志物，具備多向分化潛能，經(jīng)數(shù)代培養(yǎng)仍可保持核型穩(wěn)定和無成瘤性等。有研究將人尿源干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞的第三代、第五代和第七代分別進(jìn)行比較，得出hUSCs具有更高的增殖能力、更強(qiáng)的集落形成能力、更高的干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)和更高的抑制免疫細(xì)胞活化效率［14］。

對(duì)于hUSCs的來源，科研人員進(jìn)行了深入探究。Bharadwaj等［15］研究發(fā)現(xiàn)hUSCs無法在骨髓間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系生長(zhǎng)，且不表達(dá)尿道上皮細(xì)胞標(biāo)志物，說明hUSCs不是腎小管或尿道上皮漏出的細(xì)胞。該課題組還發(fā)現(xiàn)在接受男性供者腎移植的女性受者h(yuǎn)USCs中存在Y染色體，并高表達(dá)腎系標(biāo)志物（包括 CD224、CD13、NR3C2、Pax2 和 Pax8）以及腎臟層上皮細(xì)胞和壁層上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物（包括CD146和podocin），但不表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞、輸尿管上皮細(xì)胞和尿道上皮細(xì)胞標(biāo)志物［1］。這項(xiàng)結(jié)果表明hUSCs來自于腎臟，但具體來源于腎臟的哪個(gè)部位還有待研究。有文章總結(jié)了腎脫落在尿液中的細(xì)胞，主要包括足細(xì)胞、近端小管上皮細(xì)胞、腎臟干細(xì)胞和細(xì)胞外囊泡［2］。不少研究表明hUSCs具有很強(qiáng)的增殖能力和多向分化能力，可作為組織工程中種子細(xì)胞的新來源［13，16-17］。當(dāng)前hUSCs的培養(yǎng)方法還不完善，得到的尿源干細(xì)胞純度和質(zhì)量相差很大，因此對(duì)尿源干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定需要進(jìn)行更多探索。本研究通過簡(jiǎn)便高效的方法分離培養(yǎng)人尿源干細(xì)胞，通過生長(zhǎng)曲線測(cè)定和表面標(biāo)志物檢測(cè)來鑒定hUSCs的質(zhì)量和純度。由于hUSCs在組織工程和再生醫(yī)學(xué)上具有重大潛能，所以加深對(duì)hUSCs的認(rèn)識(shí)，建立簡(jiǎn)便高效的hUSCs分離和鑒定體系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

經(jīng)中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，收集人的尿液用于分離培養(yǎng)人尿源干細(xì)胞。三名青年志愿者自愿簽訂《知情同意書》，主動(dòng)捐獻(xiàn)尿液用于尿液干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)。

主要試劑：DPBS、FBS、DMEM/F12、Trypsin-EDTA、Defined trypsin inhibitor 和 Pen/Strep購(gòu) 自Gibco公司；腎上皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（REGM）和REGM Bullet kit購(gòu) 自 Lonza公 司；Human CD34、CD45、CD44、CD73、CD90、CD34/CD90-isotype、CD45-isotype、CD44-isotype和 CD73-isotype抗體購(gòu)自BD Pharmingen公司；Amphotericin B購(gòu)自上海翊圣生物有限公司；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基購(gòu)自無錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

主要設(shè)備：ESCO classII BSC超凈工作臺(tái)（Airstream公司）、SERIES II WATER JACKET CO2 Incubator（Thermo Fisher公司）、cence湘儀離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、Olympus倒置顯微鏡（Olympus公司）、FACSAriaII流式細(xì)胞儀（BD公司）。主要耗材：收集瓶，細(xì)胞培養(yǎng)皿，離心管和移液管等。

1.2 方法

1.2.1 尿液收集 首先，建議志愿者在收集尿液前2 h喝水。接著，紫外照射收集室30 min。向志愿者說明尿液收集的方法和注意事項(xiàng)，排好順序，自行依次用對(duì)應(yīng)的收集瓶進(jìn)行收集。前段尿液約20 mL舍棄，收集中間段尿液，最后的少量尿液也舍棄。將收集瓶移入超凈臺(tái)中，用移液管將收集瓶中的尿液分裝到50 mL離心管，每管50 mL。先400×g離心6 min，接著用20 mL PBS洗一遍，最后向每個(gè)離心管中加入3 mL Primary medium，輕輕重懸細(xì)胞。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制 Primary medium是在DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10% FPS、100 units/mL penicillin、100 μg/mL streptomycin、the REGM SingleQuot kit supplements 和 2.5 μg/mL amphotericin B。RE medium是在RE基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入REGM Bullet kit。

1.2.3 尿源干細(xì)胞的原代培養(yǎng) 用3 mL Primary medium重懸細(xì)胞后，取鋪有0.1%明膠的12孔板培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)4 d時(shí)，用RE medium進(jìn)行全量換液。用RE medium培養(yǎng)，每2 d換一次液。培養(yǎng)12 d時(shí)，細(xì)胞約長(zhǎng)滿整個(gè)孔面積。

1.2.4 尿源干細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 待細(xì)胞長(zhǎng)滿整個(gè)孔面積，進(jìn)行細(xì)胞傳代。首先用PBS洗一遍，接著用胰酶消化3 min，其次用1x Defined Trypsin inhibit終止消化，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，鋪過0.1%明膠的六孔板每孔接種1×105個(gè)hUSCs，標(biāo)記為P1，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。如上所述傳于六孔板中，標(biāo)記為P2。待P2細(xì)胞長(zhǎng)滿后，消化和收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按每皿6×105個(gè)hUSCs傳入100 mm皿中，標(biāo)記為P3，之后用100 mm皿繼續(xù)培養(yǎng)至第八代。

1.2.5 尿源干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線 在鋪過明膠的24孔板孔中分別加入1 mL RE medium，接著分別接種1 000個(gè)P2代hUSCs，每2 d換一次液。培養(yǎng)2 d后，收集兩個(gè)孔的細(xì)胞，一起用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，測(cè)得細(xì)胞數(shù)的一半為2 d的細(xì)胞數(shù)目。在培養(yǎng)4 d、6 d、8 d、10 d后，同理測(cè)出相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)目。然后對(duì)P6代hUSCs進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定，分別測(cè)出在培養(yǎng)2 d、4 d、6 d、8 d、10 d后對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)目。最后，重復(fù)兩次hUSCs的生長(zhǎng)曲線測(cè)定實(shí)驗(yàn)。整理3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用GraphPad Prism軟件做折線圖。

1.2.6 尿源干細(xì)胞的核型鑒定 將P6代hUSCs培養(yǎng)48 h后，用含有秋水仙素終濃度為0.05 μg/mL的培養(yǎng)液處理10 h。首先消化收集hUSCs，用現(xiàn)配的0.075 mol/L KCl重懸細(xì)胞，置于37oC處理30 min。接著用現(xiàn)配且4oC預(yù)冷的固定液（冰醋酸∶甲醇=1∶3）室溫固定30 min。然后用4oC預(yù)冷的固定液再重復(fù)固定兩次。接著取出在-20oC預(yù)冷的干凈載玻片，用200 μL移液槍懸于1.5 m高度進(jìn)行滴片，并室溫晾干。再用吉姆薩染液進(jìn)行染色，染色30 min后漂洗并晾干。最后，用顯微鏡觀察和拍照。

1.2.7 尿源干細(xì)胞的流式分析 收集P2代hUSCs，用PBS洗3遍后，再用PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107cells/mL。取18個(gè)無菌無酶的1.5 mL EP管，各加入100 μL細(xì)胞懸液，分別加入相應(yīng)的單克隆抗體 CD34-isotype，CD34，CD45-isotype，CD45，CD34-isotype+CD45-isotype，CD34+CD45，CD90-isotype，CD90，CD44-isotype，CD44，CD73-isotype，CD73，CD90-isotype +CD44-isotype，CD90+CD44，CD90-isotype + CD73-isotype，CD90 +CD73，CD90-isotype +CD44-isotype +CD73-isotype 和CD90+CD44+CD73。充分混勻后，避光孵育30 min。用PBS洗3遍，加入250 μL PBS重懸細(xì)胞，過濾網(wǎng)后用流式儀進(jìn)行檢測(cè)。同理，對(duì)P6代hUSCs進(jìn)行流式檢測(cè)。用flowjo進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.8 尿源干細(xì)胞的成骨分化 取P6代hUSCs，按照1×105cells/cm2接種于鋪過明膠的六孔板中，每孔加入2 mL RE medium，37℃，5% CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到約80%，棄去培養(yǎng)基，并小心沿壁加入37℃預(yù)熱的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每隔3 d更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)15 d后，棄去誘導(dǎo)液，PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min。棄去多聚甲醛，PBS洗滌3遍，用0.1%的茜素紅溶液染色5 min，PBS洗滌3遍，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍攝照片。

1.2.9 尿源干細(xì)胞的成脂分化 取P6代hUSCs，按照1×105cells/cm2接種在鋪過明膠的六孔板中，每孔加入2 mL RE medium，37℃，5% CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到約80%，棄去培養(yǎng)基，并小心沿壁加入37℃預(yù)熱的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基A液。誘導(dǎo)2 d后，換37℃預(yù)熱的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液。誘導(dǎo)1 d后，換A液誘導(dǎo)。A液和B液交替4次后，換B液維持培養(yǎng)至第15 d。誘導(dǎo)15 d后，去掉誘導(dǎo)液，PBS洗滌3遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min。棄去多聚甲醛，PBS洗滌3遍，經(jīng)3∶2稀釋的油紅O溶液染色30 min，PBS洗滌3遍，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍攝照片。

2 結(jié)果

2.1 人尿源干細(xì)胞的分離

在尿液收集時(shí)，需尿道口進(jìn)行酒精消毒。如圖1所示，由于每個(gè)人的飲食或體質(zhì)不同，收集到的尿液顏色有所不同，在50 mL離心管中離心得到的沉淀量不太相同。同一個(gè)人的尿液在不同時(shí)間收集，離心得到的沉淀也有所不同，有時(shí)有較多白色沉淀，有時(shí)只有少量絮狀沉淀。

圖1 人尿源干細(xì)胞的分離

收集了3名志愿者不同時(shí)間點(diǎn)的尿液進(jìn)行尿源干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)。由表1可知，Ⅰ號(hào)和II號(hào)青年志愿者的200 mL尿液中含有大約11個(gè)尿源干細(xì)胞克隆，而III號(hào)志愿的200 mL尿液中含有大約8個(gè)尿源干細(xì)胞克??；3名志愿者都是22點(diǎn)收集的尿液中尿源干細(xì)胞克隆數(shù)多于8點(diǎn)和14點(diǎn)。因此為了一次性獲得更多尿源干細(xì)胞，最佳收集尿液的時(shí)間是22點(diǎn)左右。

2.2 人尿源干細(xì)胞的原代培養(yǎng)

圖2-A表示單個(gè)尿源干細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)情況，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察培養(yǎng)d2、d5、d8和d11時(shí)的尿源干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。尿源干細(xì)胞接種約36 h貼壁，呈圓形或梭形，有很好的折光性。4-5 d后可明顯看到放射狀細(xì)胞集落，細(xì)胞胞漿豐富，胞核大，核仁清晰。培養(yǎng)約12 d，細(xì)胞長(zhǎng)滿12孔板整個(gè)孔面積。在培養(yǎng)尿源干細(xì)胞時(shí)，觀察到尿源干細(xì)胞克隆有3種形態(tài)，分別是纖維樣、鵝卵石樣和絲連樣。其中纖維樣和鵝卵石樣尿源干細(xì)胞克隆在3名志愿者中都存在，而絲連樣尿源干細(xì)胞克隆只在一名志愿中存在。如圖2-D所示，絲連樣尿源干細(xì)胞克隆的細(xì)胞之間以絲狀相連，并有大量細(xì)胞突起生長(zhǎng)和分裂。觀察這3種形態(tài)的尿源干細(xì)胞克隆，得知纖維樣細(xì)胞克隆形態(tài)更均一和分裂時(shí)間更短。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)的尿樣中尿源干細(xì)胞克隆數(shù)比較

2.3 人尿源干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)與核型分析

如圖3-A和3-B所示，觀察到P2和P6代hUSCs的細(xì)胞形態(tài)均一、胞膜折光性強(qiáng)、胞漿豐富。比較P2和P6代hUSCs，在傳代培養(yǎng)過程中細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變。取P6代hUSCs進(jìn)行核型分析，經(jīng)過吉姆薩染色后，觀察到P6代尿源干細(xì)胞中依然含有46條染色體，說明傳代過程中細(xì)胞核型能保持穩(wěn)定（圖3-C）。

2.4 人尿源干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線分析

由圖4可知，在接種0-2 d細(xì)胞增殖緩慢，說明這段時(shí)間hUSCs處于調(diào)整期；在2-8 d生長(zhǎng)曲線基本為線性，說明這段時(shí)間hUSCs處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在8-10 d細(xì)胞增殖逐漸變平緩，說明hUSCs處于平臺(tái)期。比較P2和P6代hUSCs生長(zhǎng)曲線，可知P2代hUSCs擴(kuò)增能力明顯大于P6代hUSCs，說明培養(yǎng)過程中hUSCs的質(zhì)量有所下降。因此，為了更好地進(jìn)行hUSCs相關(guān)研究，建議采用P6代之前的hUSCs進(jìn)行其它研究。

圖2 人尿源干細(xì)胞的原代培養(yǎng)

圖3 人尿源干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)與核型分析

2.5 人尿源干細(xì)胞的流式分析

尿源干細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特征非常接近，已有研究表明人尿源干細(xì)胞高表達(dá)CD44、CD73和CD90這3種標(biāo)志物，為此我們采用這3種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)hUSCs，來判斷hUSCs的純度和質(zhì)量。若表達(dá)這3種標(biāo)志物的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比很高，說明hUSCs的質(zhì)量非常好。檢測(cè)CD44、CD73和CD90這3種標(biāo)志物的同時(shí)，我們也對(duì)這群細(xì)胞的血系細(xì)胞標(biāo)志物CD34和CD45的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，依此來區(qū)別于血系細(xì)胞。

收集P2代hUSCs，用流式檢測(cè)人尿源干細(xì)胞抗原CD34、CD45、CD44、CD73和CD90的表達(dá)量。如圖5所示，CD34和CD45的陽性率分別為0.226%和0.088%，其中共表達(dá)CD34和CD45的hUSCs占0.038%，說明培養(yǎng)的hUSCs是非血系細(xì)胞。CD44和CD73的陽性率分別為99.60%和99.98%，其中共表達(dá)CD73和CD44的hUSCs占99.6%，說明這些hUSCs的純度和質(zhì)量都比較好。然后分析CD73和CD44雙陽性hUSCs的CD90表達(dá)情況，得知所有細(xì)胞都表達(dá)抗原CD90，由此可知P2代hUSCs的純度和質(zhì)量都很好。

圖4 P2和P6代人尿源干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

收集P6代hUSCs，用流式檢測(cè)人尿源干細(xì)胞抗原CD34、CD45、CD44、CD73和CD90的表達(dá)量。如圖6所示，CD34和CD45的陽性率分別為0.411%和0.150%，其中共表達(dá)CD34和CD45的hUSCs占0.025%，說明我們分離到的細(xì)胞為非血系細(xì)胞。CD44和CD73的陽性率分別為99.67%和99.71%，其中共表達(dá)CD73和CD44的hUSCs占99.5%，說明這些hUSCs的純度和質(zhì)量都比較好。然后分析CD73和CD44雙陽性hUSCs的CD90表達(dá)情況，得知在CD73和CD44雙陽性hUSCs中有95.3%表達(dá)CD90，說明我們的培養(yǎng)系統(tǒng)比較穩(wěn)定未引起CD90表達(dá)的大量丟失。由此可知P6代hUSCs與P2代相比，從CD34、CD45、CD44、CD73和CD90的表達(dá)情況綜合來看hUSCs的純度和質(zhì)量未有顯著變化。

2.6 成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)hUSCs分化

如圖7-A和7-B所示，P6代hUSCs在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)15 d后，開始出現(xiàn)鈣質(zhì)結(jié)節(jié)，用0.1%茜素紅染色，礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)紅色，表明有鈣鹽形成，說明細(xì)胞具有成骨分化的潛能。如圖7-C和7-D所示，P6代hUSCs在成脂細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)15 d后，少量細(xì)胞漿內(nèi)可見圓形透亮脂滴，油紅O染色可見部分細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴。通過成骨和成脂分化，得知hUSCs具有向骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的分化潛能。

圖5 第二代人尿源干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)

3 討論

尿源干細(xì)胞是從尿液中分離培養(yǎng)出來的具有良好增殖活性和多向分化能力的成體干細(xì)胞，研究表明其特性和間充質(zhì)干細(xì)胞類似［18-20］。由于hUSCs收樣方便、操作無創(chuàng)、培養(yǎng)穩(wěn)定、無致瘤性、自我更新和分化能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，hUSCs成為了組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。人們對(duì)于hUSCs的研究尚處于起步階段，近期有研究表明供體年齡對(duì)hUSCs的增殖、衰老和軟骨分化能力等有影響，指出兒童尿液分離出的hUSCs克隆數(shù)比中年人和老年人多，而且有更強(qiáng)的擴(kuò)增能力［16］。本研究以青年志愿者的尿液為材料，分離培養(yǎng)人尿源干細(xì)胞，并進(jìn)行分析和鑒定，成功建立了人尿源干細(xì)胞的分離和鑒定體系。

圖6 第六代人尿源干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)

對(duì)于尿源干細(xì)胞的鑒定，主要有3種方法：細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、流式檢測(cè)表面標(biāo)志物、成骨成脂等誘導(dǎo)分化。從細(xì)胞的生長(zhǎng)情況來看，我們分離的尿源干細(xì)胞從單細(xì)胞培養(yǎng)12 d后，長(zhǎng)滿12孔板整個(gè)孔面積。從細(xì)胞形態(tài)來看，尿源干細(xì)胞克隆具有纖維樣、鵝卵石樣和絲連樣等3種形態(tài)，這與許多文章的觀察結(jié)果相似［8］。從傳代培養(yǎng)來看，第六代尿源干細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)依然很好，可作為科學(xué)研究良好的種子細(xì)胞。從擴(kuò)增曲線來看，P2和P6代hUSCs的擴(kuò)增能力有一定差異，說明傳代次數(shù)的增加，hUSCs的增殖能力有一定下降，因此建議在研究尿道上皮細(xì)胞［22］、尿道平滑肌細(xì)胞［23］、骨骼肌細(xì)胞［1］、神經(jīng)細(xì)胞［24］和內(nèi)皮細(xì)胞［25］等分化時(shí)盡量使用前六代hUSCs。目前，在hUSCs的流式分析和鑒定上還沒有較好的標(biāo)準(zhǔn)，本文采用陰性標(biāo)記和陽性標(biāo)記相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定，并通過hUSCs三種表面標(biāo)志物CD44、CD73和CD90的表達(dá)情況來綜合判斷分離培養(yǎng) hUSCs的質(zhì)量和純度［2，9，16］。由流式檢測(cè)結(jié)果得知，在前6代中共表達(dá)CD44和CD73的hUSCs陽性率都保持99%以上，但是在傳代培養(yǎng)中hUSCs抗原CD90的表達(dá)量有所降低，因此我們提出可以以CD90的表達(dá)情況作為hUSCs培養(yǎng)過程的監(jiān)測(cè)。

由于hUSCs具有獲取簡(jiǎn)單、可多次獲取、來源豐富、無創(chuàng)傷、無倫理問題、生長(zhǎng)增殖能力強(qiáng)、自我更新能力高、多向分化能力強(qiáng)、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，因此被認(rèn)為是組織工程良好的種子細(xì)胞［26-27］。在不同的誘導(dǎo)方法作用下，hUSCs可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、尿路上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等多種組織類型的細(xì)胞，不但在組織器官修復(fù)重建及疾病治療等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景，在藥物活性及毒性替代篩選方面也有很大的潛力。雖然hUSCs具有眾多優(yōu)點(diǎn)和重大前景，但要真正走向臨床還有很多問題需要解決，例如hUSCs來源的進(jìn)一步明確、hUSCs質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn)的確立、hUSCs培養(yǎng)及鑒定方法的優(yōu)化、hUSC重編程為iPSC效率的提高、選擇合適的支架材料、體內(nèi)長(zhǎng)期安全性、分化獲得的細(xì)胞能否在機(jī)體發(fā)揮功能、體外重建的器官能否在體內(nèi)行使功能等，這些都有待于更多的體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)驗(yàn)證。

圖7 第六代人尿源干細(xì)胞成骨和成脂分化

4 結(jié)論

通過收集青年志愿者的尿液來分離培養(yǎng)人尿源干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)人尿源干細(xì)胞克隆有纖維樣、鵝卵石樣和絲連樣等3種形態(tài)。前6代hUSCs培養(yǎng)中細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變，但從生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果可知hUSCs的擴(kuò)增能力有很大下降。在前6代hUSCs中抗原CD44和CD73的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，而抗原CD90的表達(dá)量有所下降，可根據(jù)CD90的表達(dá)情況來判斷hUSCs的質(zhì)量。經(jīng)核型分析，P6代hUSCs的核型保持穩(wěn)定。經(jīng)成骨和成脂誘導(dǎo)，P6代hUSCs可分化為骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。本研究初步建立了簡(jiǎn)便高效的hUSCs培養(yǎng)和鑒定體系，為疾病治療、組織再生和器官重建等提供了可靠的細(xì)胞來源。