OSAHS患者體內(nèi)循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)機制研究-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路

楊媛媛，李凱，夏坤剛 ＊

（壽光市人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)二科，山東 壽光 262700）

0 引言

OSAHS是并發(fā)冠心病、動脈粥樣硬化和卒中等心血管疾病的高危因素[1-2]，間歇缺氧是OSAHS核心的病理生理機制[3]。循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞（CECs）是直接反應(yīng)血管內(nèi)皮損傷的指標(biāo)，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷是心腦血管疾病的重要始動因素[4-5]。該課題通過研究OSAHS體內(nèi)CECs凋亡情況，并試圖探討其中可能的凋亡通路。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）主要試劑。AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒（TaKaRa公司，日本）、抗體BIP、CHOP、caspase12（Abcam，美國），其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

（2）主要儀器。ALICE4多導(dǎo)睡眠監(jiān)測儀、實時熒光定量PCR儀（ABI 7500 Real time PCR system，美國）。

（3）研究對象。①病例組：所有病例組病例均來自2017-04至2018-04因“夜間打鼾”就診于壽光人民醫(yī)院門診的病人，經(jīng)PSG確診的有158例，其中符合條件入選的有39例，自愿參加該研究的有30例，所有入選病人行PSG檢測前均詳細(xì)記錄患者年齡、性別、身高、體重、BMI等。②對照組：來自同期壽光人民醫(yī)院查體中心的健康志愿者，主訴無打鼾病史，年齡、性別、身高、體重、BMI等與病例組匹配，并行PSG檢測排除OSAHS并自愿加入本研究者30例。

（4）入選標(biāo)準(zhǔn)：按2003年中華醫(yī)學(xué)會呼吸分會睡眠呼吸疾病學(xué)組制定的標(biāo)準(zhǔn)，OSAHS是指每晚7小時睡眠中，阻塞性呼吸暫停反復(fù)發(fā)作30次以上或者AHI大于等于5次/h。

（5）排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并高血壓、冠心病、急性心腦血管事件患者；②合并糖尿病、血脂代謝異常患者；③合并COPD、支氣管擴張、間質(zhì)性肺病等其他引起呼吸功能障礙患者；④合并其他睡眠障礙疾病患者等。

1.2 研究方法

（1）實驗步驟。①囑受試者當(dāng)天清淡飲食，忌咖啡、濃茶、飲酒，連續(xù)7 hPSG檢測。②受試者完成PSG檢測后，次晨空腹抽取靜脈血，化驗肝功、腎功、血糖、血脂、BNP等指標(biāo)，另抽取4 mL抗凝血分離PBM層細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，realtime PCR檢測BIP、CHOP、caspase12表達(dá)情況。③受試者均接受CPAP治療3月，重復(fù)檢測上述步驟。

（2）實驗方法。①PSG檢測：受試者的PSG檢測時間為10PM至次日凌晨6AM，連續(xù)監(jiān)測時間不小于7 h，監(jiān)測內(nèi)容包括鼾聲、腦電、肌電、眼電、手指末端血氧飽和度、心電、鼻氣流，PSG檢測結(jié)果為同步實時顯像同時電腦儲存回放采集。②流式細(xì)胞學(xué)檢測循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率：受試者次晨起（06∶30-07∶00）抽取靜脈血，前2 mL棄置不用，已避免抽血不當(dāng)造成誤差，4 mL抗凝后使用Ficoll液分離各層細(xì)胞，分離PBMC層，均分為兩管（A管、B管）。A管洗滌離心后PBS稀釋，在計數(shù)板上計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107cells/mL，CECs細(xì)胞在其中，按照流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞步驟操作。③real-time PCR法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化標(biāo)志因子BIP，及凋亡通路活化因子CHOP、caspase12：②步驟中B管細(xì)胞按照Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，超微量分光光度計測定RNA純度和含量。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟合成cDNA，實時熒光定量PCR反應(yīng)按照說明書步驟進(jìn)行，PCR反應(yīng)所用引物如下：H-actin5’-3’CGTTGACACCGTAAAGACCTC，3’-5’T A G G A G C C C A G G G C A G T A A T C T；B I P 5’-3’A A G G G G A G C G T C T G A T T G G，3’-5’CCTCGGCAGTTTCCTTCATTT；CHOP5’-3’TCTGCCTTTCGCCTTTGAG，3’-5’GCTTTGGGAGGTGCTTGTG；caspase12 5’-3’GCCAATTCCGACAAACAGC,3’-5’GCCACTCCAACATTTACCTCC。SYBR GreenⅡ 法進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，每個樣本重復(fù)3次，2-△△CT法進(jìn)行mRNA水平定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析處理，組間差異用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組受試者一般情況，詳情見表1

病例組30例，男女比例為24/6，年齡36-78歲，平均（52.39±10.78）歲，體重指數(shù)在22.15-32.72 kg/m2，平均（28.65±2.61）kg/m2之間；對照組30例，男女比例23/7，年齡33-71歲，平均（49.45±6.90）歲，體重指數(shù)在23.11-33.65 kg/m2之間，平均（27.31±2.94）kg/m2；經(jīng)SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析結(jié)果如“表1”所示，兩組間年齡、體重指數(shù)P值＞0.05無明顯差異，具有可比性。所有研究對象均經(jīng)PSG檢查確診或者排除OSAHS，均通過詢問病史常規(guī)化驗檢查等方式排除糖尿病、高血壓、心力衰竭、支氣管擴張或者COPD等影響因素。

表1 病例組和對照組一般情況比較

2.2 流式細(xì)胞學(xué)檢測循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況

如下圖1、圖2所示，相對于對照組（NC組，AI=2.36±0.24）， 病 例 組（IH組，AI=11.71±1.68）循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.01）；使用CPAP治療3月后，病例組（IH+CPAP組，AI=9.65±1.38）循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。

圖1

2.3 real-time PCR法檢測BIP、CHOP、caspase12

圖2

如下表2、圖3所示，相對于正常對照組（NC組），病例組（IH組）BIP、CHOP表達(dá)明顯增高，caspase12表達(dá)增高不明顯，使用CPAP治療3月后，IH+CPAP組較IH組，BIP、CHOP表達(dá)均明顯下降。

表2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)情況（±s）

表2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)情況（±s）

注：＊相對于NC組P＜0.01，＃相對于NC組，P＞0.05，&相對于IH組P＜0.05。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子BIP、CHOP、caspase12表達(dá)情況（2-△△CT）NC 組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 IH組 5.26±1.39＊ 11.55±2.01＊ 1.32±0.36＃IH+CPAP 組 3.18±0.97& 4.23±0.43& 1.19±0.27分組圖3

3 討論

研究證實，OSAHS是動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的獨立危險因素，然而其中的機制尚未明了。本室通過研究OSAHS患者體內(nèi)循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況，探索OSAHS并發(fā)動脈粥樣硬化等心腦血管疾病可能的相關(guān)機制。

相對于NC組，IH組循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞（CECs）凋亡率增加，經(jīng)3月CPAP治療后，凋亡率較前下降；國外的實驗也證明了這點[6]。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡會影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而對動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[7]。

目前針對細(xì)胞凋亡的研究主要集中在線粒體通路、死亡受體通路，是通過細(xì)胞內(nèi)一系列復(fù)雜而精細(xì)的機制調(diào)控的，近年來，研究證實，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路（又名內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)死亡通路ERAD）可能是細(xì)胞凋亡又一重要途徑[8]。以往的研究證實，7-酮膽醇[9]通過觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、CHOP表達(dá)誘發(fā)主動脈平滑肌細(xì)胞凋亡。本研究主要探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路在OSAHS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中的作用及主要的凋亡通路。

BIP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）啟動的標(biāo)志性蛋白，CHOP、caspase12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中最常見的凋亡通路[10]，據(jù)real-time PCR結(jié)果表明， IH組相對于NC組BIP、CHOP表達(dá)增高，經(jīng)3月CPAP治療后，IH組BIP、CHOP表達(dá)下降。而相對于NC組，IH組caspase12表達(dá)增高不明顯，經(jīng)CPAP治療后，caspase12表達(dá)下降趨勢不明顯。實驗證實，CHOP變化趨勢與循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞凋亡趨勢一致，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激CHOP凋亡途徑可能是引起循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的一條重要通路。

綜上所述，OSAHS患者體內(nèi)循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激CHOP通路可能是其中可能的凋亡通路。眾所周知，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整是內(nèi)皮細(xì)胞功能穩(wěn)定的基礎(chǔ)，內(nèi)皮細(xì)胞功能不穩(wěn)定可能是心腦血管急性事件發(fā)生的重要因素。我們希望，通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路減輕缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡會給OSAHS并發(fā)心血管并發(fā)癥的治療提供新的思路。