再障兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外造血支持作用的研究

朱巖，鐘佳偉

（蘭州市安寧區(qū)萬里醫(yī)院 兒科，甘肅 蘭州 730070）

0 引言

再生障礙性貧血是因機(jī)體造血增生不良以及外周血全血細(xì)胞減少而引起的出血、反復(fù)感染、貧血為主要臨床特征的一組綜合征，該病由某種或多種復(fù)合因素引起，屬骨髓造血功能衰竭性疾病。為了進(jìn)一步了解再障兒骨髓間充干細(xì)胞造血支持作用，本研究以近年收治的該類患兒為研究對(duì)象，通過實(shí)驗(yàn)觀察患兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的造血作用，為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取我院2010年至2015年收治的再生障礙性貧血患兒17例進(jìn)行研究，符合再生障礙性貧血診斷標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查確診[3]，男8例，女9例；年齡3-12歲，平均（4.9±1.3）歲。所有患兒確診并經(jīng)監(jiān)護(hù)人同意后，從患兒髂前或髂后上棘抽取其骨髓標(biāo)本，并進(jìn)行網(wǎng)織紅細(xì)胞、血常規(guī)、流式細(xì)胞學(xué)、骨髓涂片、骨髓活檢等。另選取5例健康成人作為對(duì)照組，男3例，女2例，均抽取其骨髓標(biāo)本。

1.2 方法

（1）骨髓標(biāo)本的采集。研究組患者髂前或髂后上棘穿刺抽取5 mL骨髓液；對(duì)照組骨髓標(biāo)本來源于健康成人肋骨處骨髓液。

（2）分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。①將骨髓標(biāo)本進(jìn)行稀釋，采用1.077 g/mL Ficoll-Paque分離液離心分離單個(gè)核細(xì)胞；②將單個(gè)核細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)體系為低糖DMEM培養(yǎng)液（由加拿大wisent公司生產(chǎn)，貨號(hào)：sc-224478）（內(nèi)含10%胎牛血清），細(xì)胞濃度維持在1×106mL；③培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，更換培養(yǎng)液，并觀察細(xì)胞貼壁情況，去除未貼壁細(xì)胞；④每3-5 d更換一半培養(yǎng)液,細(xì)胞生長融合＞80%成片存在時(shí)以0.25%胰酶消化，傳代至第3-6代的細(xì)胞待用[1]。

（3）觀察間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性。將（2）的間充質(zhì)干細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板至細(xì)胞長滿80%消化傳代，記錄每次傳代的細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)；收集第3代間充質(zhì)干細(xì)胞并測(cè)定其細(xì)胞表型。

（4）間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)臍血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。①臍血取自健康新生兒，12 h用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，置含20%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液（由美國Invitrogen公司生產(chǎn)，貨號(hào)：12633-012）中培養(yǎng)24 h，取懸浮細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞。②待骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長到80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行絲裂霉素C處理，并依據(jù)不同濃度將其接種于孔板中（96孔）；淋巴細(xì)胞懸浮于RPMI1640中，然后分別與研究組、對(duì)照組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種，刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化濃度控制為5 ug/mL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，然后在培養(yǎng)結(jié)束前12 h記錄cpm值[2]。

（5）觀察間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)臍血造血細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響：①臍血單個(gè)核細(xì)胞的制備同上，然后取3-6代研究組患兒與對(duì)照組1mL骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液接種于24孔板，并用絲裂霉素C處理，然后將不同培養(yǎng)體系的臍血單個(gè)核細(xì)胞接種于培養(yǎng)板（24孔）。實(shí)驗(yàn)分為三組：臍血單個(gè)核細(xì)胞+細(xì)胞因子組合組，為第1組；臍血單個(gè)核細(xì)胞+對(duì)照組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+細(xì)胞因子組合組，為第2組；臍血單個(gè)核細(xì)胞+研究組患兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+細(xì)胞因子組合組，為第3組，其中間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量均為2×105，均置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。②細(xì)胞收集。先吸出非貼壁細(xì)胞，以0.25%的胰酶消化貼壁細(xì)胞，吹打成單個(gè)核細(xì)胞懸液加入低糖DMEM培養(yǎng)基中置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 h后取上層非貼壁細(xì)胞與之前吸出的非貼壁細(xì)胞進(jìn)行混合即為擴(kuò)增后細(xì)胞。③造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)。取1×106個(gè)經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增7d的細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，每孔1 mL，復(fù)種3孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，鏡下對(duì)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落生成單位（CFU-GM）、紅系爆式集落生成單位（BFU-E）進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

2 結(jié)果

2.1 再生障礙性貧血患兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)

研究組患兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)2-3 d后，鏡下可見貼壁細(xì)胞呈短梭形，單個(gè)或成群存在、增殖迅速，培養(yǎng)至10 d細(xì)胞擴(kuò)大融合成單層，至20 d時(shí)瓶底基本被鋪滿，融合達(dá)80%-90%。傳代培養(yǎng)后細(xì)胞呈長梭形，呈放射性或漩渦狀迅速生長[3]。

2.2 再生障礙性貧血間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)臍血造血細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響

在相同細(xì)胞因子組合作用下，對(duì)照組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與臍血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后的CFU-GM和BFU-E產(chǎn)率高于研究組和單純細(xì)胞因子組（P＜0.05），見表1。

表1 研究組患兒間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)臍血造血細(xì)胞擴(kuò)增的影響

3 討論

再生障礙性貧血的發(fā)病機(jī)制，臨床上有種子學(xué)說（造血干細(xì)胞內(nèi)的增殖能力受損）、蟲子學(xué)說（免疫機(jī)制紊亂）以及土壤學(xué)說（造血微環(huán)境缺陷）等觀點(diǎn)。目前，臨床較為普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為免疫異常在再生障礙性貧血的發(fā)病中起關(guān)鍵作用，尤其是免疫系統(tǒng)中的T淋巴細(xì)胞，其可對(duì)造血系統(tǒng)產(chǎn)生攻擊性損害，并產(chǎn)生大量造血負(fù)調(diào)控因子，從而參與再障礙的發(fā)病過程[5]。

有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為造血微循環(huán)中的重要一環(huán)，參與調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的生長與分化。臨床上對(duì)于再障兒的研究多集中于免疫抑制異常，其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究較少[6]。

綜上所述，再障兒與健康者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性無顯著區(qū)別，而前者對(duì)臍血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制效應(yīng)和體外造血支持作用低于后者。