紅樹(shù)莓果酒澄清工藝的優(yōu)化及理化指標(biāo)的測(cè)定

夏天奇，高新亞，劉小琳，王 晴，王金玲*

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué) 工商管理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

紅樹(shù)莓（Rubus idaeusL.）為薔薇科懸鉤子屬的木本植物，是一種藥食同源的聚合漿果，因其富含花青素、黃酮、鞣花酸、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等天然活性成分，對(duì)癌癥、肥胖[1]、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)變性、黃斑變性、炎癥損傷[2]等疾病有顯著抑制作用，能有效預(yù)防衰老[3]，因此被列為世界第三代水果，已成為食品、保健品的研究焦點(diǎn)[4]，在化妝品、醫(yī)藥等方面有廣泛應(yīng)用價(jià)值。

紅樹(shù)莓果實(shí)出汁率較高，以其為原料釀制的果酒具有典型的樹(shù)莓果香與發(fā)酵酒香，酒體豐滿，是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的低度保健酒[5]。而紅樹(shù)莓果酒中含有的果膠質(zhì)、蛋白質(zhì)[6]、色素、單寧等大分子物質(zhì)，在加工、儲(chǔ)存過(guò)程中易產(chǎn)生渾濁[7]，嚴(yán)重影響果酒的澄清度及品質(zhì)。

澄清劑皂土吸水膨脹后，每克皂土約有750 m2的表面積，此外，皂土中硅氧四面體或鋁氧八面體可形成負(fù)電性吸附中心[8]，因此，當(dāng)皂土以溶膠的形式懸浮于果酒中時(shí)，可通過(guò)范德華力和負(fù)電荷作用吸附大量正電性蛋白質(zhì)，鐵、銅離子，色素和其他膠體粒子，通過(guò)沉降作用澄清果酒，同時(shí)提高果酒品質(zhì)，增強(qiáng)果酒對(duì)銅破敗病以及褐變的抵抗能力。MIHUCZ V G[9]等研究發(fā)現(xiàn)，在乙醇濃度12%和pH 3.56時(shí)皂土有最大澄清效果，適于偏酸性果酒的澄清。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于紅樹(shù)莓果酒的澄清研究主要有果膠酶[10]、復(fù)合澄清劑[11]兩方面，而對(duì)皂土的系統(tǒng)深入研究鮮少。本研究采用皂土對(duì)紅樹(shù)莓果酒進(jìn)行澄清處理，采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化澄清工藝，并探討澄清前后果酒的酒精度、總糖、滴定酸、總酚、總黃酮、花色苷的含量變化，以期為紅樹(shù)莓果酒產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹(shù)莓果實(shí)：黑龍江省哈爾濱市售；葡萄酒果酒專用酵母、偏重亞硫酸鉀、皂土（均為食用級(jí)）：帝伯仕法國(guó)進(jìn)口；福林-酚試劑（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722S可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；WNY-01酒精計(jì)：河北省滄州地區(qū)醫(yī)藥公司；PHS-26數(shù)顯pH計(jì)：上海精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅樹(shù)莓果酒的制備工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

預(yù)處理：挑選新鮮、成熟度高的紅樹(shù)莓，去果蒂后漂洗，瀝干。

調(diào)整成分：添加白砂糖調(diào)節(jié)發(fā)酵醪濃度至22°Bx，添加碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵醪pH值為3.5～4.0。

接種：稱取干酵母溶入10倍質(zhì)量的白砂糖溶液（2%）中，30℃活化20～30 min，加入1%活化酵母。

主發(fā)酵：在23～25℃進(jìn)行7 d的主發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中及時(shí)進(jìn)行攪拌，破壞發(fā)酵形成的泡蓋，以便完全發(fā)酵。

倒罐：當(dāng)糖度＜50 g/L，酒精度為10%vol～13%vol時(shí)，主發(fā)酵結(jié)束，將經(jīng)過(guò)主發(fā)酵后的發(fā)酵醪用4層紗布過(guò)濾，倒罐裝料率要大，酒液應(yīng)接近罐頂，以減少罐內(nèi)氧氣，防止醋酸菌污染。

調(diào)整成分：補(bǔ)加白砂糖調(diào)節(jié)發(fā)酵醪濃度至20°Bx。

陳釀：20～22℃左右發(fā)酵15 d。

澄清：采用澄清劑法對(duì)果酒進(jìn)行澄清。

殺菌：當(dāng)產(chǎn)品在輸送鏈上通過(guò)殺菌室時(shí)，130～160℃的過(guò)熱蒸汽從上下噴射45 s。

1.3.2 分析檢測(cè)

透光率（T）測(cè)定：取澄清后紅樹(shù)莓果酒的上清液，以蒸餾水為參比，在波長(zhǎng)800 nm處測(cè)定透光率；吸光度值（A）測(cè)定：因透光率T/%=10-A，所以果酒透光率的變化趨勢(shì)與吸光度值的變化趨勢(shì)相反，同時(shí)測(cè)定果酒透光率和吸光度值可規(guī)避操作中的人為誤差、環(huán)境因素及果酒成分變化對(duì)澄清度的影響，更準(zhǔn)確的判斷澄清劑濃度、溫度、時(shí)間對(duì)果酒澄清度的影響。取澄清后紅樹(shù)莓果酒的上清液，以蒸餾水為參比，在波長(zhǎng)610 nm處測(cè)定吸光度值；酒泥高度測(cè)定：于25 mL刻度比色管中根據(jù)刻度讀取酒泥高度（澄清之后同時(shí)測(cè)定果酒的透光率、吸光度值、酒泥高度。測(cè)定之前不需要澄清處理，經(jīng)過(guò)皂土澄清后的果酒，酒泥結(jié)構(gòu)致密，沉積在瓶底，與酒體上清有明顯分離界限。），酒精度的測(cè)定采用酒精計(jì)法[13]；殘?zhí)菧y(cè)定斐林試劑滴定法[13]；滴定酸度測(cè)定酸堿中和滴定法[13]；花色苷含量測(cè)定采用pH示差法[14]；總酚含量測(cè)定采用Folin酚法[15]，以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.016 0x+0.029 0，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3；總黃酮含量測(cè)定采用比色法[16]，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.0118x-0.0013，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。

1.3.3 紅樹(shù)莓果酒感官評(píng)價(jià)

紅樹(shù)莓果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。感官評(píng)價(jià)請(qǐng)10位品酒專家（男性5名，女性5名），按澄清度（20分）、色澤（20分）、香味（30分）和滋味（30分）的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分，取10位專家打分的平均值作為最終得分，滿分100分。

1.3.4 單因素澄清試驗(yàn)優(yōu)化澄清工藝

表1 紅樹(shù)莓果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table1 Sensory evaluation standards of red raspberry fruit wine

1%皂土溶液的配制：精確稱取1 g皂土，用10 g 50℃的熱蒸餾水充分?jǐn)嚢杈鶆颍偌诱麴s水89 g，浸泡12～24 h，制成膠體懸浮液，在添加酒液之前再充分?jǐn)嚢瑁员阌谀軌蚓鶆虻姆植加诰埔褐衃17]。

皂土添加量的確定：向紅樹(shù)莓原酒中添加1%皂土溶液使皂土終含量分別為0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L、0.04 g/L、0.05 g/L，在25℃條件下避光隔氧靜置4 d，取上清液測(cè)定透光率、吸光度值，并讀取酒泥高度[18]。

皂土澄清時(shí)間的確定：固定皂土添加量0.03g/L，在25℃條件下，避光隔氧靜置2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、15 d，取上清液測(cè)定透光率、吸光度值，并讀取酒泥高度。

皂土澄清溫度的確定：固定皂土添加量0.03g/L，分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃條件下，避光隔氧靜置4d，取上清液測(cè)定透光率、吸光度值，并讀取酒泥高度。

1.3.5 響應(yīng)曲面優(yōu)化澄清工藝

為分析各個(gè)因素之間的交互作用對(duì)紅樹(shù)莓果酒透光率的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法，以透光率（Y）為響應(yīng)值，澄清溫度（X1）、皂土添加量（X2）、澄清時(shí)間（X3）為考察因素，通過(guò)Design Expert 8.06設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，并驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。響應(yīng)面優(yōu)化因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)試驗(yàn)均為3次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Excel 2010、Origin 8.0、Design-Expert 8.06、SPSS24進(jìn)行分析處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 皂土澄清工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

2.1.1 皂土添加量對(duì)澄清效果的影響

圖1 皂土添加量對(duì)紅樹(shù)莓果酒澄清效果的影響Fig.1 Effect of bentonite addition on clarification effect of red raspberry fruit wine

由圖1可知，皂土添加量在0.01～0.04 g/L范圍內(nèi)，吸光度值沒(méi)有明顯變化（P＞0.05），果酒的透光率及酒泥高度隨皂土添加量增大而增加；皂土添加量為0.04 g/L時(shí)，果酒的透光率及酒泥高度均為最大，分別為95.5%、0.2 cm；皂土添加量＞0.04 g/L之后，透光率及酒泥高度減小?？赡苁怯捎谠硗廖侥芰_(dá)到平衡后，增加皂土添加量，因下膠過(guò)量而引起酒體渾濁。因此，選擇最佳皂土添加量為0.04g/L。

2.1.2 澄清溫度對(duì)澄清效果的影響

圖2 澄清溫度對(duì)紅樹(shù)莓果酒澄清效果的影響Fig.2 Effect of clarification temperature on clarification effect of red raspberry fruit wine

由圖2可知，澄清溫度在15～45℃范圍內(nèi)，紅樹(shù)莓果酒透光率和酒泥高度隨澄清溫度的增加先增大后減??；澄清溫度在溫度20℃時(shí)透光率和酒泥高度均為最大，分別為94.8%、0.36 cm；澄清溫度＞20℃之后，皂土的架橋作用弱于膠體作用，澄清效果下降[19]，透光率和酒泥高度隨澄清溫度的增加逐漸減小。吸光度值隨澄清溫度的增加先減小后增大，并在澄清溫度為20℃達(dá)到最小值。在溫度20℃時(shí)酒體豐滿，清澈透明，果香濃郁。因此，最佳澄清溫度為20℃。

2.1.3 澄清時(shí)間對(duì)澄清效果的影響

圖3 澄清時(shí)間對(duì)紅樹(shù)莓果酒澄清效果的影響Fig.3 Effect of clarification time on clarification effect of red raspberry fruit wine

由圖3可知，紅樹(shù)莓果酒的透光率隨澄清時(shí)間在2～15d范圍內(nèi)的增加先增大后減小，并在澄清時(shí)間6 d時(shí)透光率達(dá)最大，為94.8%，澄清時(shí)間＞6 d之后，透光率逐漸下降。酒泥高度隨時(shí)間在2～15 d范圍內(nèi)的增加而逐漸增大，吸光度值隨時(shí)間的延長(zhǎng)先減小后增大。澄清6d后的紅樹(shù)莓果酒澄清透明，色澤光亮，酒泥致密。因此，最佳澄清時(shí)間為6 d。

2.2 皂土澄清工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以透光率（Y）為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)二次回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of quadratic regression equation of response surface experiments

由表4可知，方差分析模型中P＜0.01，說(shuō)明模型極顯著，擬合精度好，可利用該響應(yīng)面近似模型進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化；失擬項(xiàng)P＞0.05，視為不顯著，說(shuō)明該模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域內(nèi)擬合較好；模型決定系數(shù)R2=0.899 5，說(shuō)明相關(guān)性較好，模型預(yù)測(cè)值能較好的反映實(shí)際值[20]。因此，回歸方程符合檢驗(yàn)原則，該模型合適，可以用此分析皂土添加量、澄清溫度、澄清時(shí)間對(duì)紅樹(shù)莓果酒透光率的影響。模擬項(xiàng)的X1、X2、X12達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），X3、X22、X32對(duì)響應(yīng)值無(wú)顯著影響（P＞0.05），結(jié)合F值，可以看出各因素對(duì)于果酒透光率的影響順序分別為：X1＞X2＞X3。擬合回歸方程為：

以回歸方程為依據(jù)，給制各參數(shù)間交互作用的三維空間響應(yīng)曲面圖，考察在皂土添加量、澄清溫度、澄清時(shí)間中某一個(gè)因素固定為中心值時(shí)，其他兩個(gè)因素的交互作用對(duì)紅樹(shù)莓果酒透光率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，響應(yīng)面曲面圖可反映各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的顯著程度，曲面越陡表示交互作用越強(qiáng)，曲面越平表示交互作用越弱。3個(gè)因素之間交互作用的強(qiáng)弱可以通過(guò)等高線形狀直觀反映出來(lái)，交互作用越明顯，則等高線的橢圓越明顯，反之就越圓。3個(gè)因素交互作用X1X2＞X1X3＞X2X3，與表4方差分析結(jié)果相符。

圖4 皂土添加量、澄清時(shí)間及澄清溫度對(duì)紅樹(shù)莓果酒澄清效果影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between bentonite addition,clarification time and temperature on clarification effect of red raspberry fruit wine

采用軟件優(yōu)化功能得出在所選試驗(yàn)因素范圍，最佳試驗(yàn)條件為澄清溫度21.27℃、皂土添加量0.04 g/L、澄清時(shí)間8 d，模型預(yù)測(cè)透光率95.60%。考慮到實(shí)際操作，選取最佳澄清條件為皂土添加量0.04 g/L、澄清溫度21℃、澄清時(shí)間8 d。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，澄清后紅樹(shù)莓果酒透光率可達(dá)96.40%，與預(yù)測(cè)值非常接近，這表明該模型能較好地預(yù)測(cè)紅樹(shù)莓果酒澄清效果。

2.3 澄清劑處理對(duì)紅樹(shù)莓果酒理化指標(biāo)的影響

紅樹(shù)莓果酒澄清前后理化指標(biāo)的對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表5所示。

表5 紅樹(shù)莓果酒澄清前后理化指標(biāo)對(duì)比Table 5 Comparison of physical and chemical indexes before and after clarification of red raspberry fruit wine

由表5可知，澄清度比未處理前提高了39.7%，總糖、滴定酸、酒精度、總酚、總黃酮、花色苷均有所下降。透光率、酒精度、總酚、總黃酮、花色苷澄清前后變化極顯著（P＜0.01），感官評(píng)分變化顯著（P＜0.05），總糖、滴定酸變化不顯著（P＞0.05）。

澄清后果酒透光率相比原酒得到提高，花色苷、酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)的含量相比原酒降低。皂土在澄清過(guò)程中吸附酒體中的單寧，單寧的去除可減少果酒的酸澀感，口感醇厚，酸甜適中，果香與酒香協(xié)調(diào)，酒體呈玫瑰紅色且澄清透亮，因此，相比原酒，澄清后果酒的感官評(píng)分明顯提高。澄清后果酒的酒精度雖有下降，但維持在15.8%vol；紅樹(shù)莓果酒中的酸有原料帶來(lái)的檸檬酸，也有發(fā)酵產(chǎn)生的醋酸、乳酸、丁酸、琥珀酸等，若含酸量適當(dāng)，則果酒滋味醇厚、協(xié)調(diào)、適口，反之則差；澄清前后果酒中糖分變化不明顯，對(duì)果酒口感無(wú)太大影響；澄清后果酒中總酚、黃酮、花色苷含量相比原酒雖有減少，但酒體中仍然保留有這些活性成分，并且通過(guò)澄清除去了一部分大分子膠體物質(zhì)，使得果酒清亮透明，有光澤，無(wú)懸浮、沉淀和渾濁現(xiàn)象。

3 結(jié)論

本研究采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了皂土對(duì)紅樹(shù)莓果酒的澄清工藝為皂土添加量0.04 g/L，澄清溫度21℃，澄清時(shí)間8d。在此優(yōu)化條件下，紅樹(shù)莓果酒透光率為96.40%，總糖含量7.13 g/L，酒精度15.8%vol，滴定酸度20.5 g/L，總酚含量0.83 g/L，總黃酮含量2.29 g/L，花色苷含量0.89 g/L，感官評(píng)分88分。澄清后果酒清亮透明，顏色酒紅，酒體豐滿，醇厚協(xié)調(diào)。