志丹苑元代水閘遺址霉菌及防霉劑抑菌效果的再調(diào)查與評估

丁佳榮，張 嵐，郭紅櫻，張遐耘，陳 宸

(1． 上海市歷史博物館，上海 200003； 2． 浙江省微生物研究所，浙江杭州 310012)

0 引 言

霉菌的生長是木質(zhì)文物腐爛的主要原因，因此防霉是博物館文物保護工作中的重要內(nèi)容之一[1，2]。志丹苑元代水閘遺址發(fā)現(xiàn)于2001年5月，遺址內(nèi)有大量木構(gòu)件，由于長時間處于潮濕狀況，防霉工作極為重要。自2002年5月正式發(fā)掘來，共開展了三次微生物菌群調(diào)查，分別在2002、2006、2012。2007年起選擇了防霉劑IPBC(碘代丙炔基氨基甲酸酯Iodopropy-nyl Butyl Carbamate)處理木材。至今遺址木構(gòu)件一直采用該防霉劑，以1份原液兌20份水的濃度配比(約5%)，解決侵蝕木構(gòu)件的霉腐問題。該方法是經(jīng)過抑菌驗證，證明對當時的微生物生長具有明顯的抑制作用。但是，隨著時間的推移，木構(gòu)件中的菌群對防霉劑會產(chǎn)生耐藥性。遺址木質(zhì)文物從初期每兩個月用防霉劑噴涂一次，到目前不到一個月就要再次噴藥。為此2015年9月再次對遺址內(nèi)的空氣及木構(gòu)件的霉菌進行了種類調(diào)查。從木構(gòu)件上分離到8株高豐度霉菌，用IPBC對分離到的菌種進行了實驗室抑菌效果評價，為下一步篩選更有效的防霉劑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 培養(yǎng)基及試劑

1．1．1分離培養(yǎng)基(PDA) 馬鈴薯200g；葡萄糖20g；瓊脂15g；氨芐青霉素100mg；蒸餾水1L；pH=6．0。

1．1．2鑒定培養(yǎng)基(查氏) 硝酸鈉3g；磷酸氫二鉀1g；硫酸鎂0．5g；氯化鉀0．5g；硫酸亞鐵0．01g；蔗糖30g；瓊脂20g；蒸餾水1000mL。

1．1．3提取試劑盒 Qiagen 69504；PCR試劑：PCR Amplification Reagents。

1．1．4防霉劑 碘代丙炔基氨基甲酸酯，三博生化科技(上海)有限公司生產(chǎn)。

1．2 設(shè)備

醫(yī)用凈化工作臺YJ-1300A凈化等級100級；生化培養(yǎng)箱LRH-250A(15～40)±1．0℃；ABI 3730XL測序儀。

1．3 采樣

1．3．1木構(gòu)件文物霉菌采樣點 采樣點共計13處，分別為M1-1、M1-2、M2-1、M2-2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11。

1．3．2采樣方法 選擇木構(gòu)件長霉部位，用無菌手術(shù)刀將表層腐木除去，取內(nèi)層部分3～5g裝入滅菌袋中。

1．4 試驗方法

1．4．1木構(gòu)件文物霉菌分離 在無菌條件下，13處木構(gòu)件樣品用稀釋法分別進行微生物培養(yǎng)，分離。

1．4．2木構(gòu)件文物霉菌鑒定[3-5]

1) 形態(tài)觀察。菌落形態(tài)觀察包括菌落大小、菌落正反面顏色、菌落質(zhì)地等；

2) 顯微觀察：顯微觀察菌絲和孢子形態(tài)特征；

3) DNA-ITS序列分析[6]。

收集菌體用液氮，研磨破壁。使用Qiagen 69504試劑盒提取DNA，引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反應(yīng)體系見表1，PCR反應(yīng)條件見表2。

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)條件

注： ①ITS引物的退火溫度為55℃，V4區(qū)退火溫度為51℃。

將合格PCR產(chǎn)物擴增產(chǎn)物與T載體連接后送測序公司測序，獲得的ITS序列上機進行測序，所得結(jié)果在NCBI(http：//www.ncbi.nlm．nih．gov/)網(wǎng)站上進行比對。同源性比較，并結(jié)合形態(tài)特征，對樣品系進行分類鑒定。

1．4．3IPBC抑霉試驗 試驗以濾紙片法進行。把供試菌制成105濃度的孢子懸浮液，取1mL菌懸液至9cm直徑的培養(yǎng)皿中，倒入約15mL已滅菌的培養(yǎng)基，與菌液混勻，制成平板。然后，將吸附了20μL的5%IPBC的，直徑8mm的濾紙片貼于帶菌瓊脂平板正中。27℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d。用游標卡尺測量抑菌圈直徑。每種防霉滅菌劑做3個平行。

2 結(jié)果與分析

2．1 分離、鑒定結(jié)果

2007至今遺址木構(gòu)件一直使用IPBC防霉劑。經(jīng)過這么多年的馴化，木構(gòu)件中大多是耐藥性的菌群，同時隨著木構(gòu)件成分的變化，木構(gòu)件中的菌群結(jié)構(gòu)也會跟著發(fā)生改變(不同的微生物專注于不同的營養(yǎng)成分)。本次從木構(gòu)件樣品中分離到8類霉菌。按照《真菌鑒定手冊》的方法進行了菌種的鑒定，分別是：1)盤菌科菌下未分類菌(Pezizaceaeunclassified)；2)高大毛霉(MucorMucedo)；3)綠色木霉(Trichodermaviride)4)鐮刀霉(Fusariumkeratoplasticum)5)枝頂孢霉(Monacrosporiumsp．)；6)裴氏著色真菌(Fonsecaeapedrosoi)；7)黃綠青霉(Penicilliumcitreo-virde)；8)黃柄曲霉(Aspergillusniger)。

2．2 遺址木構(gòu)件各霉菌在木構(gòu)件樣品中的分布

不同部位的木構(gòu)件上所長的霉菌是不一樣的，對13個樣品逐一進行的霉菌的篩查分析結(jié)果見表3。

表3 不同霉菌在不同木構(gòu)件樣品中的分布

從表3可看出綠色木霉在13個樣品中出現(xiàn)9次，是分布最廣的一種霉菌。其次是盤菌科菌和鐮刀霉。

2．3 IPBC對試驗霉菌的抑制作用

遺址實際使用IPBC濃度對遺址木構(gòu)件樣品中分到的8類霉菌進行抑制試驗，結(jié)果見表4。

5%IPBC濃度對遺址木構(gòu)件樣品中分到的8類霉菌進行抑制試驗所得抑菌圈見圖1。

表4 IPBC對試驗霉菌的抑制作用

圖1 5%的IPBC對8株試驗菌第14d的抑菌圈Fig.1 Inhibition zone of 5% IPBC on 8 test molds on the 14th day

5%的IPBC濃度對分離到的木構(gòu)件霉菌綠色木霉、盤菌科菌、鐮刀霉、枝頂孢霉、裴氏著色真菌、高大毛霉、黃綠青霉、黃柄曲霉進行抑菌試驗。結(jié)果顯示IPBC對綠色木霉、盤菌科菌、黃柄曲霉的抑制作用較強，而對枝頂孢霉、高大毛霉、鐮刀霉抑制作用較差，特別對鐮刀霉作用最弱。

3 討 論

干濕交替是防霉大忌。遺址內(nèi)的木構(gòu)件為了保濕，防干裂，要階段性噴水，增加了防霉工作的難度。遺址于2007年、2012年均對IPBC處理前后木樁群進行過霉菌類型鑒定，結(jié)果如表5。對比2．1的結(jié)果分析可知，木樁本次分離到多種前兩次未分離到過的霉菌類型，包括分布最廣的綠色木霉和盤菌科下未分類的一株菌。這些霉菌里要特別引起注意的是綠色木霉，它以產(chǎn)纖維素酶高而著名。自然界腐爛的植物上常能見到，它的大量出現(xiàn)勢必會加快木構(gòu)件的降解。篩選高效抑制綠色木霉的防霉劑勢在必行。

表5 IPBC處理前后木樁群侵蝕微生物種類變化

IPBC是優(yōu)異的防霉劑，高效環(huán)保，是本遺址常用防霉劑。用IPBC對分離到的霉菌進行單菌抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，其對綠色木霉和盤菌的抗性較強，但是這兩個菌還是在遺址木構(gòu)件中廣泛存在。造成這樣結(jié)果的原因是木構(gòu)件不間斷噴水防裂使藥物流失，藥效不能很好地發(fā)揮。因此，藥物的抗流失性和施用方法也是今后值得研究的方向。

4 結(jié) 論

本次工作探明了遺址木樁上主要危害菌的豐度及種類，這為有針對性篩選防霉劑及使用濃度和使用期限奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，正在利用分離到這8種霉菌為試驗指示菌，有針對性地篩選抑制遺址木材特定霉菌的防霉劑，特別是抑制綠色木霉和盤菌，包括對IPBC的改良。已找到與對照防霉劑IPBC比更廣譜，抑菌效果明顯，持久性提高的藥物。實地試驗正在進行中，相關(guān)試驗結(jié)果將陸續(xù)發(fā)表。