土壤水溶性有機(jī)碳的高錳酸鉀氧化比色法測定研究

王 星， 孫沙沙， 王桂紅， 王萍萍， 郭 振， 焦克強(qiáng)， 段建軍， 王小利

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽 550025； 2.貴州大學(xué)煙草學(xué)院/貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室，貴州貴陽 550025)

水溶性有機(jī)碳(water-soluble organic carbon，簡稱WSOC)通常是指能通過0.45 mm微孔濾膜的水溶性有機(jī)物質(zhì)[1]，是陸地生態(tài)系統(tǒng)極為活躍的有機(jī)碳組分，雖然它在土壤中含量很低，一般不超過200 mg/kg[2]，但容易被土壤微生物物吸收和利用[3]，對調(diào)節(jié)土壤陽離子淋失、土壤中有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化、遷移和降解也起到重要的作用[4-6]，因此，土壤水溶性有機(jī)碳的測定已成為土壤化學(xué)性質(zhì)分析的一個重要項目。

目前，WSOC的測定方法主要有：重鉻酸鉀-濃硫酸外加熱容量法(濕氧化法)[7-8]、總有機(jī)碳測定儀(TOC)法測定[9]。濕氧化法由于不能保證樣品完全氧化，并且測定所需時間長，很難消除鉻和強(qiáng)酸，測定結(jié)果誤差較大[10]；干燒法有機(jī)碳氧化所需溫度高，儀器比較昂貴，并且測定之前須對提取液蒸干，操作復(fù)雜、費時，整體分析運(yùn)行成本偏高[11-12]。因此，找到一種廉價、操作簡單、具有一定精度的WSOC測定方法對WSOC的研究具有重要意義。

WSOC是一種活性有機(jī)碳，目前，土壤活性有機(jī)碳常用的測定方法是高錳酸鉀氧化比色法[13-14]，即根據(jù)土壤與高錳酸鉀作用后高錳酸鉀的消耗量來計算土壤活性有機(jī)碳的含量。本研究在活性有機(jī)碳測定的基礎(chǔ)上，通過分析高錳酸鉀比色液吸收曲線、反應(yīng)時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作等因素，以期創(chuàng)建一種準(zhǔn)確、簡單、方便的WSOC測定方法。

1 原理

活性有機(jī)碳高錳酸鉀氧化法測定的具體步驟[15]：取含有15 mg碳土壤樣品于離心管中并加入25 mL的333 mmol/L高錳酸鉀，振蕩或靜置一定時間，離心后取上清液用去離子水以1 ∶250稀釋，在分光光度計565 nm下測定稀釋樣品的吸光度，由不加土壤的空白對照與土壤樣品的吸光長之差，計算出高錳酸鉀濃度的變化，并進(jìn)而計算出氧化的碳量(氧化過程中高錳酸鉀濃度變化1 mmoL可消耗9 mg碳[16])，而土壤中水溶性有機(jī)碳的含量一般不超過200 mg/kg，根據(jù)假設(shè)，在氧化的過程中高錳酸鉀濃度變化1 mmol/L可消耗9 mg碳，為此本研究采用4 mmol/L的高錳酸鉀氧化水溶性有機(jī)碳，從而測定出水溶性有機(jī)碳的含量。以草酸溶液、水楊酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做參比，土壤樣品分別采用高錳酸鉀氧化比色法和TOC進(jìn)行測定，并進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計分析，對新方法進(jìn)行評價。

式中：B為高錳酸鉀濃度變化值(mmol/L)，濃度變化值通過查標(biāo)準(zhǔn)曲線確定；V1為比色液的體積(mL)；9為高錳酸鉀氧化碳的比例系數(shù)；V2為WSOC浸提的水的體積(mL)；V3為定容時使用的離心上清液的體積(mL)；m為烘干土樣質(zhì)量(g)。

2 材料與方法

2.1 試劑與儀器

4 mmol/L的高錳酸鉀溶液。由于高錳酸鉀自身氧化性較強(qiáng)，與還原性物質(zhì)易發(fā)生反應(yīng)，例如空氣中的塵埃及氨等還原性物質(zhì)[17]，影響溶液的穩(wěn)定性。另外，高錳酸鉀溶液見光易分解，很難長期穩(wěn)定保存，所以本實驗使用的高錳酸鉀溶液均為現(xiàn)配現(xiàn)用，并避光保存。所用水均為蒸餾水。吸光度的測量和波長的掃描均采用分光光度計。

2.2 試驗方法

2.2.1 高錳酸鉀比色波長和反應(yīng)時間的確定 配制 4 mmol/L 的高錳酸鉀溶液100 mL，吸取5 mL于100 mL容量瓶用蒸餾水定容；定容后的溶液在450～600 nm波長范圍內(nèi)掃描(1 cm比色杯)，然后以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖得到高錳酸鉀的吸收曲線，曲線描述了高錳酸鉀對不同波長光的吸收能力。

取0.90、1.35 mg/L的草酸溶液分別與高錳酸鉀溶液反應(yīng)，每30 min測定吸光度，直至反應(yīng)完全，繪制在室溫條件下比色測定結(jié)果與顯色時間的關(guān)系圖，從而確定顯色時間。

2.2.2 高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 首先配制4 mmol/L的高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，從標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取3、4、5、6、7、8 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容(對應(yīng)的濃度分別為0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mmol/L)，溶液同“2.2.1”節(jié)比色測定。以吸光度為橫坐標(biāo)，高錳酸鉀濃度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果與分析

3.1 高錳酸鉀氧化比色法的吸收曲線和反應(yīng)時間

同一物質(zhì)的吸收曲線隨波長的變動而變動，應(yīng)取吸光度最大時對應(yīng)的波長，此時比色更精確。本試驗中4 mmol/L高錳酸鉀的吸收曲線見圖1。從圖1可以看出，在480 nm～530 nm 處出現(xiàn)2個吸收峰，其中在490 nm和525 nm吸收值相差不大，因此在比色的時候，可以選擇在490 nm、525 nm處進(jìn)行測定。

待測液與4mmol/L高錳酸鉀溶液的反應(yīng)時間對于比色測定結(jié)果也有很大影響，如果反應(yīng)時間太短，待測液反應(yīng)不完全，造成結(jié)果偏低；反應(yīng)時間太長，已經(jīng)穩(wěn)定的顏色就可能會褪去，導(dǎo)致結(jié)果偏高。由于水溶性有機(jī)碳的含量比較低，所以要保證待測液的量完全被高錳酸鉀所氧化，在本試驗中 4 mmol/L 的高錳酸鉀溶液理論上最多消耗2.16 mg的C。配制0.90 mg/L、1.35 mg/L的草酸溶液反應(yīng)與高錳酸鉀的反應(yīng)時間見圖2。

由圖2可見，0.90、1.35 mg/L的草酸溶液分別與高錳酸鉀反應(yīng)在0～2 h內(nèi)吸光度均呈下降趨勢；在2～8 h內(nèi)，2種溶液吸光度基本保持穩(wěn)定，差異不顯著(P<0.05)。

為進(jìn)一步確定顯色時間，在0.5、1、1.5、2、8 h測定2種不同濃度待測溶液的水溶性碳的值，結(jié)果如表1所示，在0.5、1 h時，2種待測液測定值比標(biāo)準(zhǔn)值小，并且相差比較大，可能是反應(yīng)時間太短，樣品反應(yīng)不是很完全；而在1.5、2、8 h時，2種待測液的測定值均與標(biāo)準(zhǔn)值相差不大，這說明在 1.5～8 h 時，溶液中的碳已反應(yīng)完全，而在 2 h 時水溶性有機(jī)碳的回收率高于1.5 h時的回收率且測定值也更接近理論值，因此比色時間取2 h即可，能達(dá)到節(jié)能、高效的效應(yīng)。

表1 不同時間下可溶性碳的測定值

注：平均值為C濃度，回收率指測量值占標(biāo)準(zhǔn)值的百分?jǐn)?shù)。

3.2 不同種類有機(jī)碳化合物高錳酸鉀氧化比色法與TOC儀器法測定結(jié)果的比較

分別配制0.45、0.90、1.35 mg/L的草酸溶液、水楊酸溶液比色測定(每個濃度梯度設(shè)置10個平行)，并與理論含碳值和TOC儀器法測定結(jié)果進(jìn)行比較分析。

表2結(jié)果顯示，TOC儀器法測定6種樣品的測定結(jié)果均高于高錳酸鉀氧化比色法的測定結(jié)果，高錳酸鉀氧化比色法測定的樣品回收率小于TOC儀器法測定結(jié)果，這說明TOC儀器法對有機(jī)碳氧化得更完全。高錳酸鉀氧化比色測定結(jié)果和TOC儀器法測定結(jié)果之間呈極顯著相關(guān)性，與TOC儀器法測定結(jié)果的相對偏差相比，高錳酸鉀氧化比色法的相對偏差更大，這說明TOC儀器法更加穩(wěn)定，因此當(dāng)測量精確度要求不高的時候，也可采用高錳酸鉀氧化比色法測定水溶性有機(jī)碳。并且從表2可以看出，高錳酸鉀氧化比色測定的回收率都高于80%，同種濃度的草酸和水楊酸相比，水楊酸的回收率都高于草酸。

表2 不同濃度的草酸和水楊酸高錳酸鉀氧化比色測定與TOC儀器法測定結(jié)果比較

3.3 WSOC高錳酸鉀氧化比色法測定與TOC測定結(jié)果的比較

以貴州普定縣陳家寨喀斯特小流域為研究區(qū)域，在耕地、果園、荒草地、灌木林地和人工林這5種土地利用方式下各取9個土壤樣品，共計45個樣品，稱取5 g(干質(zhì)量)土樣，加入 2 400 mL 蒸餾水，于常溫下振蕩30 min，4 000 r/min離心 10 min，上清液過0.45 μm的濾膜，浸提液中有機(jī)碳采用高錳酸鉀氧化比色法測定。高錳酸鉀氧化比色法測定結(jié)果和TOC儀器法測定結(jié)果比較見表3。

高錳酸鉀氧化比色法測定45個WSOC含量在0.02～0.4 mg/g 之間，TOC儀器法的測定結(jié)果為0.04～0.56 mg/g。2種方法測定的45個土樣水溶性有機(jī)碳含量的高低變化基本一致，但TOC儀器法的測定水溶性有機(jī)碳含量的平均值高于高錳酸鉀氧化比色法測定的結(jié)果，這可能是因為TOC高溫燃燒把水溶性有機(jī)碳氧化得更完全。高錳酸鉀氧化比色法的變異系數(shù)值為61.53%，高于TOC測定的變異系數(shù)值。在配對樣品的t檢驗方面，二者的相關(guān)性高達(dá)0.941，重復(fù)取樣的顯著性P>0.05，說明2種方法測定的結(jié)果不存在顯著性差異，具有良好的一致性。應(yīng)用線性方程擬合高錳酸鉀氧化比色法和TOC法所測的土壤水溶性數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)二者線性擬合較好(圖3)。

表3 WSOC高錳酸鉀氧化法與TOC儀器法的測定結(jié)果比較

高錳酸鉀氧化比色法測定的WSOC結(jié)果偏低，可以通過圖3線性方程的關(guān)系進(jìn)行矯正，即高錳酸鉀氧化比色法測定的WSOC結(jié)果乘以1.28等于TOC儀器法的測定結(jié)果。

4 討論與結(jié)論

借鑒土壤活性有機(jī)碳的高錳酸鉀氧化比色法，探索并確定了土壤水溶性有機(jī)碳的高錳酸鉀氧化比色法，在測定WSOC值時，波長可選擇490 nm和525 nm，顯色在2 h即可。已知碳濃度的有機(jī)化學(xué)試劑與高錳酸鉀氧化比色時，相同濃度的水楊酸比草酸的回收率更高，這可能是由于含脂肪鏈的草酸與高錳酸鉀反應(yīng)沒有水楊酸敏感，但是不同濃度的草酸和水楊酸與高錳酸鉀氧化比色得到的含碳值和其理論的含碳值相差不大，占理論值的80%以上，這也說明氧化的過程中高錳酸鉀濃度變化1 mmol所消耗9 mg碳的假設(shè)在水溶性有機(jī)碳的測定中也是成立的。但是土壤中水溶性有機(jī)碳主要包括脂肪酸、芳香酸、氨基酸、單糖、低聚糖和低分子量的富里酸等，如果不同的土壤組成差異比較大的話，采用該方法就可能存在一定偏差。通過配對樣品的t檢驗得知，高錳酸鉀氧化比色法測定WSOC的值與TOC儀器法的測定結(jié)果不具有顯著性差異，說明可以用高錳酸鉀氧化比色法測定WSOC，雖然相對于TOC儀器法的測定結(jié)果較低，但是與TOC儀器法的測定結(jié)果有著良好的線性關(guān)系，乘以矯正系數(shù)1.28即為TOC儀器法的測定值。由于不同研究者采用土壤樣品的類型和數(shù)量不同、土壤溶液的浸提方法不同，造成轉(zhuǎn)換方程式也會不同，相應(yīng)的矯正系數(shù)也會出現(xiàn)差別。盡管本研究的研究區(qū)域具有一定的代表性，土壤樣品數(shù)量也較多，由于仍局限于某個區(qū)域不夠系統(tǒng)化，因此需更多區(qū)域的土壤樣品來進(jìn)行檢驗，以不斷修正轉(zhuǎn)換方程式和參數(shù)。