不同鹽濃度下羅非魚肌球蛋白熱誘導凝膠的形成及機理

朱潘紅，齊慧紅，李婷，周春霞，洪鵬志

(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江,524088)

羅非魚蛋白含量很高，肌原纖維蛋白約占60%～75%，而肌球蛋白占肌原纖維蛋白的55%～60%，是決定肌原纖維蛋白功能特性的主要蛋白質(zhì)[1]。肌球蛋白是鹽溶性蛋白，在一定鹽濃度條件下熱處理會形成凝膠，從而影響肉制品的質(zhì)構(gòu)、外觀和出品率[2]。凝膠化在食品領(lǐng)域中具有重要的功能特性，食品中的蛋白質(zhì)通常通過熱誘導形成凝膠。熱誘導凝膠主要涉及到初始蛋白的去折疊以及隨后蛋白分子的聚集，影響熱凝膠形成的因素包括肌肉類型[3]、pH值[4]、離子強度[3,5]、蛋白濃度[6]、加熱條件[7]等，直接影響肉制品的微觀結(jié)構(gòu)和黏彈性[8]。鯉魚肌原纖維蛋白40 ℃以上時蛋白頭部構(gòu)象發(fā)生顯著變化，結(jié)構(gòu)展開，疏水性氨基酸殘基和巰基相互作用使蛋白分子產(chǎn)生熱聚集[9]。而白鰱魚肌動球蛋白在30 ℃時蛋白開始變性聚集，超過40 ℃時分子間二硫鍵形成，且其影響與pH值(1～13)和離子強度(0.2～2.0 mol/L NaCl)有關(guān)，在pH 5.42時，肌動球蛋白的溶解度最低，而鹽濃度主要影響蛋白的溶解度，對熱處理過程中二硫鍵的斷裂與形成沒有影響[3]。對羅非魚肌球蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，表面疏水性和巰基含量隨著溫度的升高而增大，且肌球蛋白輕鏈由于α-螺旋結(jié)構(gòu)的影響熱穩(wěn)定性較好，電泳分析顯示二硫鍵對肌球蛋白重鏈的熱聚集至關(guān)重要[10]。對鰱魚肌球蛋白的研究發(fā)現(xiàn)二硫鍵和疏水相互作用是導致蛋白聚集的主要因素[11]。本文以羅非魚肌球蛋白為研究對象，研究了不同離子強度條件下肌球蛋白熱誘導凝膠形成過程及機理，為重組類魚肉制品及凝膠類魚肉制品的生產(chǎn)提供理論依據(jù)和指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活羅非魚(Oreochromisspp.)：湛江市昌大昌超市(2016.10～12)，長30 cm，重1 kg。宰殺取其白肉部分切小塊攪碎，并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

二硫蘇糖醇(DTT)，廣州齊云生物科技有限公司；快速Lowry法蛋白含量測定試劑盒，上海荔達生物科技有限公司；其他均為分析純。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機，Beckman公司；恒溫水浴鍋，Bibby Scientific有限公司；熒光分光光度計，日本島津公司；日立S-4800 掃描電子顯微鏡，Hitachi公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

肌球蛋白的提取流程見文獻[12]。采用LOWRY法[13]檢測蛋白含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標準物，測量波長為750 nm。

1.3.2 樣品的制備

將提取的肌球蛋白用不同離子強度的緩沖液(20 mmol/L PBS，NaCl濃度分別為0、50、150、600 mmol/L，pH 7.0)透析24 h，所得即為不同離子強度下的肌球蛋白溶液。取適量的不同離子強度下的肌球蛋白(2 mg/mL)溶液置于比色管中，進行熱處理(20～80 ℃，1 ℃/min)，每10 ℃取樣，進行溶解度、濁度、表面疏水性和巰基含量的測定。

1.3.3 溶解度的測定

將熱處理后的肌球蛋白溶液離心(50 000×g，15 min，4℃)取上清液，采用LOWRY法[13]檢測其蛋白含量[12]。以下各實驗每個樣品均重復3次重復測定3次。

(1)

1.3.4 濁度的測定

參照LIU[3]的方法稍加修改。取3 mL熱處理后的肌球蛋白溶液(蛋白質(zhì)量濃度0.5 mg/mL)，在350 nm下測定肌球蛋白溶液的吸光度(A350nm)，即為肌球蛋白樣品的濁度。

1.3.5 表面疏水性的測定

ANS熒光探針法[14]。將熱處理后的肌球蛋白溶液離心取其上清液，并測定其濃度，梯度稀釋蛋白(0.1、0.05、0.025、0.012 5 mg/mL)，不同濃度的蛋白各取4 mL，加入20 μL的ANS溶液(8.0 mmol/L ANS，0.01 mol/L PBS，pH 7.0)，振蕩混勻，靜置10 min(避光)，使用熒光分光光度計檢測樣品的熒光強度(FI)。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為374 nm和485 nm，狹縫寬為5 nm。將添加探針樣品熒光強度值減去對應樣品的內(nèi)源熒光強度值即為肌球蛋白的相對熒光強度值(RFI)。以RFI對蛋白質(zhì)量濃度作圖，其斜率為蛋白表面疏水性指標(ANS-S0)。

1.3.6 總巰基的測定

采用DTNB[15]的方法。

1.3.7 動態(tài)黏彈性的測定

動態(tài)黏彈性的測定參照BUAMARD[16]的方法并稍加修改，肌球蛋白樣品的制備方法同凝膠的制備方法相似，只是不用進行熱處理。取透析好的肌球蛋白溶液(20 mg/mL)進行流變學性質(zhì)的測定。取3 mL肌球蛋白樣品置于平板上，除去過量樣品，為了防止樣品蒸發(fā)，圍繞平板周圍滴加薄薄的一層液體石蠟，并蓋上保溫蓋。設定參數(shù)：探頭型號P35TiL，平板直徑35 mm,間隙1 mm，應變1%，頻率0.1 Hz；熱處理溫度范圍：升溫過程20～80 ℃、降溫過程80～20 ℃，1 ℃/min。

1.3.8 凝膠化學作用力的測定

取適量的不同離子強度的肌球蛋白(蛋白質(zhì)量濃度20 mg/mL)溶液分別置于燒杯中，制備肌球蛋白凝膠，20～80 ℃，1 ℃/min，80 ℃保溫30 min，而后迅速放入冰水中冷卻，置于4 ℃冰箱中過夜后用于凝膠化學作用力的和掃描電鏡測定?；瘜W作用力的測定方法參照TAN等[7]的方法。

1.3.9 掃描電鏡的測定

參照蘭冬梅[17]的方法。將制備好的凝膠樣品用刀切成1 cm厚的小塊，首先用2.5%的戊二醛溶液(pH 6.8)固定24 h，然后用0.1 mol/L PBS緩沖液(pH 6.8)重復洗滌3次，每次15 min。接著用不同體積分數(shù)的乙醇(50%、70%、80%、90%)梯度脫水，每次10 min。然后用100%的乙醇脫水3次，每次15 min。脫水后的樣品用三氯甲烷脫脂1 h，最后分別用V(乙醇)∶V(叔丁醇)=1∶1的混合液和100%的叔丁醇溶液各置換1次，每次15 min。在-80 ℃下冷凍24 h，并用真空冷凍干燥機凍干。采用離子濺射鍍膜法對樣品噴金，掃描電子顯微鏡觀察其表面形貌。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 22軟件進行方差分析，差異顯著性(p<0.05)分析使用多重比較。采用Origin 8.5軟件對各指標的變化趨勢進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌球蛋白熱處理過程中溶解度和濁度的變化

肌球蛋白在熱處理過程中溶解度和濁度的變化見圖1。隨著熱處理溫度的升高，肌球蛋白的溶解度逐漸降低，濁度逐漸變大。在試驗范圍內(nèi)，當NaCl濃度為1 mmol/L時，肌球蛋白的溶解度只有36.63%，之后隨著離子強度的增加，溶解度逐漸增大，當NaCl濃度為600 mmol/L時，肌球蛋白的溶解度達到最大值。肌球蛋白是鹽溶性蛋白，在高離子強度下分散成單體存在，處于可溶狀態(tài)，溶解度高，濁度值較??；而在體外低離子強度下，肌球蛋白易形成絲狀聚合物，溶解度較小，濁度值高[18]；隨著熱處理溫度的升高，肌球蛋白的溶解度逐漸降低，濁度值增大，因為溫度升高使肌球蛋白變性聚集，在高濃度時就會形成凝膠；低離子強度(1、50 mmol/L NaCl)條件下肌球蛋白的溶解度在30 ℃就顯著下降，而生理離子(150 mmol/L NaCl)及高離子強度(600 mmol/L NaCl)下，肌球蛋白溶解度的顯著降低則出現(xiàn)在40 ℃(p<0.05)。說明了不同離子強度下肌球蛋白的變性溫度不同。這主要與肌球蛋白頭部的聚集有關(guān)[19]，溫度升高蛋白發(fā)生變性聚集，溶解度降低，濁度值變大。這與劉海梅[11]的研究結(jié)果一致，鰱魚肌球蛋白的溶解度在40 ℃顯著降低，濁度明顯增大，且銀鯉肌動球蛋白的濁度在40 ℃時變化最顯著，在40 ℃之前變化不顯著或沒有變化，而高于40 ℃后逐漸趨于平穩(wěn)[3]。濁度值的增大主要跟光的散射有關(guān)，加熱導致肌球蛋白變性形成大的聚集體，增加了光的散射，因此濁度值逐漸變大。濁度反映了樣品顆粒的大小，從而反映了肌球蛋白分子的聚集程度，對研究肌球蛋白熱誘導凝膠起到輔助作用[20]。由此可見，不同離子強度下肌球蛋白的變性溫度不同，這主要跟肌球蛋白在溶液中的存在狀態(tài)有關(guān)。

2.2 肌球蛋白熱處理過程中表面疏水性的變化

肌球蛋白的表面疏水性用來表征蛋白三級結(jié)構(gòu)的變化。肌球蛋白在熱處理過程中表面疏水性的變化見圖2。未經(jīng)熱處理時，隨著離子強度的增加，可溶性肌球蛋白表面疏水性明顯增大(p<0.05)，可能與高離子強度下肌球蛋白的溶解度較好以及肌球蛋白由粗絲轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w狀態(tài)有關(guān)，使得更多的疏水基團暴露[18]，對雞胸肌球蛋白的研究也表明在高離子強度下的ANS-S0值最大[21]。隨著熱處理的進行，肌球蛋白表面疏水性逐漸增加，分子部分展開，且不同離子強度條件下變化不完全相同。當NaCl濃度為1、50、150 mmol/L時，溫度為30 ℃時肌球蛋白的ANS-S0值顯著增加，而高離子強度(600 mmol/L NaCl)下，肌球蛋白的ANS-S0值急劇增加則發(fā)生在40 ℃時(p<0.05)。這可能是因為溫度較低(30 ℃)時，高離子強度下肌球蛋白還沒有變性或小部分變性，肌球蛋白的疏水基團大都包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部；然而隨著溫度的逐漸升高，肌球蛋白受熱就會發(fā)生變性，肌球蛋白的雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，尾部的疏水性氨基酸逐漸從包埋狀態(tài)開始轉(zhuǎn)變，暴露于蛋白分子表面，導致他們相互聚集形成疏水性區(qū)域，隨后發(fā)生疏水相互作用，蛋白表面的ANS-S0值就會隨著變性溫度的逐漸升高而逐漸增大[11]。比目魚肌球蛋白熱誘導凝膠的研究也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，隨著溫度的升高ANS-S0值逐漸增大，蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[1]。肌球蛋白在熱處理過程中ANS-S0值的增大說明了肌球蛋白在熱處理過程中發(fā)生了變性，肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)受到破壞，同時也說明了疏水相互作用參與了凝膠的形成，也說明了高離子強度下肌球蛋白的熱穩(wěn)定較好。

圖2 不同離子強度條件下熱處理對羅非魚肌球蛋白體系表面疏水性的影響Fig.2 Effect of heating treatment on surface hydrophobicity of tilapia myosin dispersion under different ionic strength conditions

2.3 肌球蛋白熱處理過程中巰基含量的變化

巰基屬于較弱的次級鍵，主要是用來維持蛋白的三級結(jié)構(gòu)，巰基的變化可以用來反映蛋白變性的程度[22]。肌球蛋白在凝膠形成過程中伴隨著巰基含量的變化。由圖3可以看出，不同離子強度下，肌球蛋白巰基含量差異顯著，并且隨著溫度的升高，巰基含量顯著下降(p<0.05)，是因為隨著溫度的升高巰基被氧化形成二硫鍵，使巰基含量降低[1]。由此可以推斷二硫鍵參與了凝膠的形成。而銀鯉肌動球蛋白在較高溫度(≥40 ℃)下由于巰基氧化或二硫化物的內(nèi)部交換形成了二硫鍵，其總巰基含量顯著減少。不同離子強度下巰基的變化情況不完全相同，低離子強度(1、50 mmol/L NaCl)下，當溫度低于40 ℃時巰基變化不顯著(p<0.05)；生理離子強度(150 mmol/L NaCl)和高離子強度(600 mmol/L NaCl)下巰基含量在30 ℃就顯著減少。低離子強度下肌球蛋白的變性溫度較高，可能是因為此時的溫度不足以使蛋白完全展開使埋藏在蛋白內(nèi)部的巰基暴露?？値€基含量在線性升溫(20～80 ℃)范圍內(nèi)顯著減少，不僅說明了凝膠網(wǎng)絡的形成有二硫鍵的參與，還預示了肌球蛋白頭部參與了蛋白的凝聚。

圖3 不同離子強度條件下熱處理對羅非魚肌球蛋白體系總巰基含量的影響Fig.3 Effect of heating treatment on total SH content of tilapia myosin dispersion under different ionic strength conditions

2.4 肌球蛋白熱誘導動態(tài)彈性模量的變化

動態(tài)彈性模量反應了肌球蛋白從溶液狀態(tài)逐漸變?yōu)槟z狀態(tài)，定量描述每一個溫度點下熱凝膠形成的流變參數(shù)的變化。圖4為離子強度對肌球蛋白動態(tài)彈性模量的影響。隨著離子強度的增大，肌球蛋白的彈性模量呈現(xiàn)出一個逐漸增大的趨勢，說明了離子強度對肌球蛋白的彈性模量(G′)影響顯著(p<0.05)。當溫度達到40～50 ℃時，肌球蛋白首次出現(xiàn)最大G′值。不同離子強度下，肌球蛋白達到最大G′值的溫度不同，當NaCl濃度為150和600 mmol/L時，肌球蛋白的最大G′值所對應的溫度為50 ℃；當NaCl濃度為1、50 mmol/L時，肌球蛋白在45 ℃達到最大G′值。而比目魚肌球蛋白的彈性模量在34 ℃首次達到最大值，這可能是凝膠劣化的初始溫度[1]。初始肌球蛋白彈性模量的增加可能是由于低溫條件下蛋白和蛋白之間的相互作用引起的。在某種程度上肌球蛋白的彈性網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)得到加強，形成了較為疏松的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[1]。隨著溫度的進一步升高至50～55 ℃，肌球蛋白的彈性模量急劇下降。這可能是有2個原因引起的：(1)在50～55 ℃溫度范圍內(nèi)，熱激活蛋白酶具有較高的活性，降解了肌球蛋白，形成了較為松散的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。(2)肌球蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變可能破壞蛋白質(zhì)網(wǎng)絡的完整性并且增加了半凝膠的流動性[23]。隨著溫度的繼續(xù)升高，彈性模量又逐漸增大，當溫度為55～80 ℃時，彈性模量值逐漸趨于穩(wěn)定。逐漸穩(wěn)定的彈性模量值說明了在較高溫度下形成了穩(wěn)定堅固的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這主要歸因于二硫鍵和疏水相互作用。在降溫階段，彈性模量繼續(xù)增加，這說明了冷卻使凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)得到加強。

圖4 不同離子強度條件下羅非魚肌球蛋白體系熱誘導動態(tài)彈性模量的變化Fig.4 Changes of heat-induced dynamic elastic modulus of tilapia myosin dispersion under different ionic strength conditions

2.5 肌球蛋白熱誘導凝膠的化學作用力

在肌球蛋白形成凝膠的過程中，蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，形成新的分子間作用力，變性的蛋白質(zhì)分子有序聚集形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，此時體系中蛋白分子的相互作用力達到一種平衡狀態(tài)[24]。本試驗研究了不同離子強度條件下肌球蛋白熱誘導凝膠的化學作用力。由圖5可知，當NaCl濃度為1 mmol/L時，對應熱誘導凝膠的疏水相互作用和非二硫共價鍵所占的比例較大，是維持低鹽濃度條件下肌球蛋白蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的主要作用力，而離子鍵和氫鍵所占的比例較小，在凝膠形成過程中只參與肌球蛋白分子尾部的纏繞而不參與頭部的聚集[11]。魚糜凝膠過程中疏水作用顯著增強，疏水相互作用是維持凝膠穩(wěn)定的化學作用力[25]，這與我們的試驗結(jié)果基本一致。當NaCl濃度為50 mmol/L時，疏水相互作用是維持蛋白凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)最主要的作用力；隨著離子強度的增大，離子鍵的含量顯著增大，但在生理離子強度(150 mmol/L NaCl)條件下，凝膠的離子鍵的含量顯著減小(p<0.05)；而氫鍵隨著離子強度的增大與離子鍵的變化基本一致；離子強度對凝膠疏水相互作用的影響顯著(p<0.05)，隨著離子強度的增大，凝膠的疏水相互作用逐漸增強，在NaCl濃度為600 mmol/L時有下降的趨勢；離子強度對二硫鍵的影響顯著，這說明了二硫鍵參與了凝膠的形成。對雞胸肌原纖維蛋白研究的發(fā)現(xiàn)，疏水相互作用對其凝膠的形成至關(guān)重要，二硫鍵的作用不大；但是也有研究表明維持鰱魚魚糜凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要化學作用力是二硫鍵[27]。

S1-離子鍵;S2-氫鍵;S3-疏水相互作用;S4-二硫鍵;S5-非二硫共價鍵圖5 不同離子強度條件下羅非魚肌球蛋白熱凝膠化學作用力的變化Fig.5 Changes of chemical interactions of heat-induced gelation from tilapia myosin under different ionic strength conditions

2.6 肌球蛋白熱誘導凝膠的微觀結(jié)構(gòu)

在實驗范圍內(nèi)，肌球蛋白在較低離子強度條件下(1、50 mmol/L NaCl)形成不透明的凝膠，而在生理離子(150 mmol/L NaCl)和高離子強度(600 mmol/L NaCl)下形成透明的凝膠，由此進一步通過掃描電鏡研究凝膠的亞顯微結(jié)構(gòu)。由圖6可知，在實驗范圍內(nèi)，不同離子強度下的肌球蛋白體系經(jīng)熱處理后均形成了較為穩(wěn)定的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，比較而言，在低離子強度下，肌球蛋白熱誘導凝膠不均一，孔洞較大；而在高離子強度下則形成較均勻的表面結(jié)構(gòu)，且形成的凝膠有序、孔徑細小，凝膠的結(jié)構(gòu)也比較致密，其三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這是因為在高離子強度下，肌球蛋白以單體形式存在，在經(jīng)過熱處理后，先凝聚形成顆粒，然后再交聯(lián)形成比較均一的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，多孔性佳。這與徐幸蓮[19]的研究結(jié)果一致，在0.25 mmol/L KCl條件下骨骼肌肌球蛋白熱誘導形成細絲的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而在0.6 mmol/L KCl條件下則形成球狀顆粒凝集的凝膠立體結(jié)構(gòu)。根據(jù)高聚物理論，聚合物分子單體越小越均勻，聚合物的彈性越好。因此認為在高離子強度下形成的凝膠彈性較高，與動態(tài)流變學的檢測結(jié)果一致，當NaCl濃度為600 mmol/L時，肌球蛋白熱誘導彈性模量最大。

圖6 不同離子強度條件下羅非魚肌球蛋白熱誘導凝膠的微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.6 Scanning electron micrographs of heat3induced gels from tilapia myosin under different ionic strength conditions

3 結(jié)論

不同離子強度下，隨著熱處理溫度的升高，蛋白受熱變性、聚集，肌球蛋白的溶解度顯著減小，濁度增大；溫度升高使得肌球蛋白去折疊，埋藏在分子內(nèi)部的疏水基團暴露，表面疏水性顯著增加，巰基氧化形成二硫鍵，巰基含量顯著減小，說明二硫鍵參與肌球蛋白熱誘導凝膠的形成；不同離子條件下，蛋白的熱穩(wěn)定性不同，高鹽條件下肌球蛋白的熱穩(wěn)定性更好；維持凝膠三維結(jié)構(gòu)的主要作用力是疏水相互作用、二硫鍵和非二硫共價鍵，高鹽條件下，肌球蛋白熱誘導的凝膠孔洞小而均勻，而低鹽濃度條件下，熱誘導肌球蛋白凝膠孔洞較多、不均勻，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。