基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合電子鼻評(píng)價(jià)浸米時(shí)間對(duì)黃酒風(fēng)味品質(zhì)的影響

楊成聰，劉丹丹，葛東穎，石星星，王強(qiáng)，郭壯

(湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽，441053)

作為黃酒生產(chǎn)的前端工藝，浸米對(duì)黃酒品質(zhì)具有直接的影響[1]。浸泡可使糯米中的淀粉充分吸水，進(jìn)而有利于糯米后續(xù)的蒸煮[2]。此外，產(chǎn)乳酸細(xì)菌可利用糯米的水溶性營養(yǎng)物質(zhì)大量繁殖，在降低前酵醪pH值的同時(shí)抑制了雜菌的生長，進(jìn)而保障了黃酒發(fā)酵的順利進(jìn)行[3]。黃酒浸米水中的細(xì)菌主要為植物乳桿菌和短乳桿菌[4]。有研究表明，采用米漿水替代部分投料用水可明顯抑制其他產(chǎn)酸細(xì)菌的代謝活動(dòng)[5]，進(jìn)而賦予酒體更協(xié)調(diào)的風(fēng)味[6]。浸米時(shí)間通常為5～20 d，時(shí)間過短，糯米不能充分吸水且不能使?jié){水達(dá)到一定酸度，從而不利于黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成；若時(shí)間過長，總糖、還原糖、粗脂肪和粗蛋白等主要組分流失嚴(yán)重，亦不利于黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成[7]，因而研究浸米時(shí)間對(duì)黃酒風(fēng)味品質(zhì)的影響就顯得尤為重要。

研究人員常使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)和電子鼻對(duì)食品的風(fēng)味進(jìn)行評(píng)價(jià)。GC-MS可同時(shí)獲得食品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)保留時(shí)間與分子結(jié)構(gòu)兩方面信息，在白酒[8]、紅酒[9]和酸奶[10]等發(fā)酵食品中已有廣泛應(yīng)用。通過模擬人體嗅覺系統(tǒng)，電子鼻傳感器陣列實(shí)現(xiàn)了不同種類化學(xué)物質(zhì)的快速無損檢測，在酒齡辨別[11]、品牌區(qū)分[12]和風(fēng)味分析[13]中亦有著廣泛的應(yīng)用，具有檢測結(jié)果客觀性強(qiáng)且受主觀因素影響小的優(yōu)點(diǎn)。

本研究采用GC-MS和電子鼻聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同浸泡時(shí)間糯米釀造黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量進(jìn)行了分析，同時(shí)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法探討了浸米時(shí)間對(duì)黃酒風(fēng)味品質(zhì)的影響，以期為后續(xù)黃酒品質(zhì)的提升和工藝的改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糯米：市售；生麥曲：購于浙江省麗水市；黃酒專用釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；NaCl：西隴科學(xué)股份有限公司。

PEN3電子鼻，配備10 個(gè)金屬氧化傳感器,德國Airsense公司；GCMS-QP2020氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電子轟擊電離源EI,日本島津公司；SH-Rtx-Wax(30 m×2.25 mm×0.25 μm)色譜柱,日本島津公司；HMT-100蒸飯柜,廣東樂創(chuàng)電器有限公司；LRH-250F生化培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制作

分別稱取700 g糯米洗凈后于20～22 ℃浸泡1、3、5、7、9、11、13、15和17 d，蒸煮30 min，采用攤飯法冷卻至37 ℃，加入0.7 g酒曲、110 g生麥曲、410 mL糯米浸泡液和550 mL清水?dāng)嚢杈鶆蚝笾糜?8 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，后置于18 ℃培養(yǎng)7 d，取上清液制成供試樣液[14]。

1.2.2 基于GC-MS技術(shù)黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

(1)樣品處理。取黃酒樣品9 mL于20 mL樣品瓶，加入3 g NaCl，采用帶有聚四氟乙烯的鋁帽夾緊封口60 ℃攪拌預(yù)熱15 min，平衡15 min，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口解析5 min后進(jìn)入GC-MS 分析[19]。

(2)GC條件。色譜柱：SH-Rtx-Wax，30 m×2.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度200 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；分流比為10：1；載氣為高純氦氣(>99.999 9%)和高純氮?dú)?>99.999 9%)；流速：1 mL/min；升溫程序：起始溫度30 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升到45 ℃，保持10 min，然后以8 ℃/min升到130 ℃，不保持，然后以10 ℃/min升到200 ℃保持7 min。

(3)MS 條件。離子源：EI源；離子源溫度：230 ℃；連接口溫度：280 ℃；電子轟擊能量70 eV；m/z范圍：33.00～450 amu；采集方式：Q3 Scan。

(4)定性分析。NIST14標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫定性；保留指數(shù)定性。

(5)定量分析。利用峰面積對(duì)樣品中主要組分進(jìn)行相對(duì)含量分析。

1.2.3 基于電子鼻技術(shù)測定黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

取黃酒樣品10 mL，稀釋2倍后置于120 mL樣品瓶中使用電子鼻進(jìn)行氣味檢測。檢測器由10 個(gè)金屬氧化傳感器組成，分別對(duì)不同類型揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定。測定前傳感器進(jìn)行95 s自動(dòng)清潔，樣品測試時(shí)間為60 s，每間隔1 s測定一個(gè)響應(yīng)值。響應(yīng)值為傳感器測試樣品時(shí)的電阻G和測試空氣的電阻GO的比值，比值與1的偏離度越大，說明與之相對(duì)應(yīng)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的濃度越大。電子鼻化學(xué)傳感器及其對(duì)應(yīng)的敏感物質(zhì)類型如表1所示[15]。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用聚類分析(cluster analysis，CA)和主成分分析(principal component analysis，PCA)對(duì)不同浸米時(shí)間黃酒風(fēng)味整體結(jié)構(gòu)的差異性進(jìn)行分析；使用曼-惠特尼檢驗(yàn)(mann-whiney test)和冗余分析(redundancy analysis，RDA)對(duì)與浸米時(shí)間顯著相關(guān)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行甄別。使用Canoco 4.5軟件做RDA，其他分析使用Matlab 2010軟件；使用Matlab 2010軟件繪制熱圖，其他圖使用origin 8.5繪制。

表1 化學(xué)傳感器及其對(duì)應(yīng)的敏感物質(zhì)類型Table 1 Chemical sensors and their corresponding sensitive material types

2 結(jié)果與分析

2.1 基于GC-MS技術(shù)浸米時(shí)間對(duì)黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

該文首先利用GC-MS技術(shù)對(duì)黃酒樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了定性和相對(duì)定量分析，結(jié)果見表2。

表2 不同浸米時(shí)間黃酒揮發(fā)性組分及相對(duì)含量分析 單位：%Table 2 The relative abundance of volatile components of Chinese rice wine fermented by glutinous rice soaked at different times

續(xù)表2

序號(hào)物質(zhì)名稱浸米時(shí)間/d1 d3 d5 d7 d9 d11 d13 d15 d17 d10十二甲基環(huán)己硅氧烷0.08-0.220.150.110.10.250.280.1411乙酸異戊酯1.51.841.08-1.420.820.390.41-12正己酸乙酯0.280.310.21-0.310.160.222.982.5513(S)-乳酸乙酯-----0.190.40.33-14醋酸-------0.551.34152,3-丁二酮------0.740.66-16乙酸苯乙酯--0.070.10.070.05---17乙酸乙烯酯--0.540.30.280.48---18十四甲基環(huán)庚硅氧烷0.13-0.27-0.050.030.340.250.0419癸酸乙酯0.090.060.140.280.160.120.110.110.0520十六烷基環(huán)十八烷基硅氧烷--0.07---0.070.07-21十四烷酸乙酯---0.050.030.05---22辛酸乙酯0.180.170.420.550.550.150.320.250.0623苯乙醇0.360.131.32.121.381.020.760.770.4924羰基硼烷0.860.890.40.510.380.380.40.380.4325丁酸異戊酯-------0.05-263-苯丙酸乙酯--------0.127(R)-2-戊醇--------0.1128八甲基環(huán)四硅氧烷-------0.13-29甲基乙酰甲醇--------0.28302-戊酮--------0.8531十甲基環(huán)戊硅氧烷0.060.050.060.170.10.08-0.20.1532乳酸乙酯--------2.77332-甲氧基乙酸乙酯--------5.83343-甲基-4-氧代戊酸11.3913.3610.48-10.611.5813.078.238.8635乙酸異丁酯0.33---0.24----36(S)-L-丙氨酸乙基酰胺--0.750.850.670.60.570.680.7137乙酸異丁酯-0.33-------38乙醇0.420.190.120.140.130.150.170.130.1739甘油縮甲醛02.19-------40乙縮醛2.21--------412,3-丁二醇-0.37-------42甲酸14.3213.7713.8317.0113.3115.1614.5513.6214.85

注：“-”表示未檢出。

由表2可知，9個(gè)黃酒樣品中共檢測到42 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類化合物18 種、醇類化合物10 種、烷烴類化合物6 種、酸類化合物3 種、酮類化合物2 種、醛類化合物2 種和胺類化合物1 種。其中，醇類和酯類化合物為黃酒中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其平均相對(duì)含量分別為62.67%和10.00%。王旭等人研究結(jié)果與本研究相同[16]，其采用GC-MS技術(shù)對(duì)不同酒齡黃酒中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酯類和醇類為金色年華黃酒中主要風(fēng)味物質(zhì)。通過對(duì)不同品牌黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，LUO[17]和CAO[18]亦證實(shí)醇類和酯類在黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量上均占優(yōu)勢。值得一提的是，在浸米時(shí)間超過11 d糯米釀造的黃酒中均檢測到了正丁醇和丁酸乙酯，而乙酸苯乙酯、乙酸乙烯酯和十四烷酸乙酯只能在浸米時(shí)間≤11 d糯米釀造的黃酒中檢測到。

2.2 與浸米時(shí)間顯著相關(guān)黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的甄別

在對(duì)黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量解析的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)不同浸米時(shí)間糯米釀造黃酒進(jìn)行了非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)聚類分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 基于聚類分析的浸米時(shí)間對(duì)黃酒風(fēng)味品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of soak time of glutinous rice on the flavor quality of Chinese rice wine based on cluster analysis

由圖1可知，黃酒樣品整體上可劃分為兩個(gè)聚類，其中聚類I由浸泡1、3、5、7、9和11 d糯米釀造的黃酒構(gòu)成，而聚類Ⅱ由13、15和17 d樣品構(gòu)成。由此可見，當(dāng)浸米時(shí)間達(dá)到11 d以上時(shí)黃酒的風(fēng)味可能會(huì)發(fā)生明顯的變化。本研究進(jìn)一步采用Mann-Whiney分析，對(duì)隸屬于兩個(gè)聚類黃酒的醇類、酸類、酮類、烷烴類和酯類化合物相對(duì)含量進(jìn)行了分析，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 隸屬于聚類I和聚類II黃酒樣品揮發(fā)性成分的比較分析Fig.2 Comparative analysis of volatile components of Chinese rice wine samples belong to cluster I and II(注：NS，差異不顯著；*，p<0.05。)

由圖2可知，隸屬于聚類I的黃酒樣品其醇、酸和酯類化合物的相對(duì)含量分別為69.79%、24.14%和3.27%，而在聚類II中分別為47.78%、25.02%和24.75%。由圖2亦可知，浸米時(shí)間達(dá)到13 d時(shí)黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中醇類的相對(duì)含量顯著下降(p<0.05)，而酯類含量顯著升高(p<0.05)。究其原因可能在于，隨著浸米時(shí)間的延長，黃酒中的醇類物質(zhì)被氧化為酸，而醇與酸又進(jìn)一步發(fā)生了酯化反應(yīng)[19]。本研究進(jìn)一步以聚類I/聚類II為分組依據(jù)，采用RDA對(duì)與浸米時(shí)間顯著相關(guān)的黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了甄別，結(jié)果如圖3所示。

圖3 RDA雙序圖Fig.3 biplot of the RDA

由圖3可知，2-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、乙基硼酸二乙酯、十四烷酸乙酯、十六烷酸乙酯、甲酸、(S)-乳酸乙酯、正丁醇、2,3-丁二酮和丁酸乙酯等11 種物質(zhì)與RDA排序圖約束軸上的樣品賦值良好相關(guān)，因而代表了與浸米時(shí)間顯著相關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。其中2-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇和3-甲基-1-丁醇在聚類I一側(cè)，說明這3 種物質(zhì)在浸泡1～11 d糯米釀造的黃酒中相對(duì)含量較高，而其他8 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈現(xiàn)出相反的趨勢。經(jīng)Mann-Whiney發(fā)現(xiàn)，十六烷酸乙酯、乙基硼酸二乙酯和丁酸乙酯3 種酯及2-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇和正丁醇4 種醇在兩類黃酒中差異顯著(p<0.05)。浸米時(shí)間對(duì)上述7 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量的影響如圖4所示。

圖4 浸米時(shí)間對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量的影響Fig.4 Effect of soak time of glutinous rice on the relative abundance of volatile flavor in Chinese rice wine

由圖4可知，隨著浸米時(shí)間的增加黃酒中2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丁醇在13 d時(shí)呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，乙基硼酸二乙酯、丁酸乙酯和正丁醇在浸米時(shí)間達(dá)到13 d時(shí)呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。

2.3 基于電子鼻技術(shù)浸米時(shí)間對(duì)黃酒風(fēng)味品質(zhì)影響的評(píng)價(jià)

通過CC-MS法研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)浸米時(shí)間達(dá)到11 d以上時(shí)黃酒的風(fēng)味可能會(huì)發(fā)生明顯的變化，本研究進(jìn)一步采用電子鼻技術(shù)對(duì)該結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證。基于電子鼻技術(shù)不同浸米時(shí)間黃酒風(fēng)味品質(zhì)的PC1與PC2因子載荷圖如圖5所示。

圖5 不同浸米時(shí)間黃酒風(fēng)味品質(zhì)的PC1與PC2因子載荷圖Fig.5 Graphical representation of the PCA of Chinese rice wine samples fermented by glutinous rice soaked at different times showing PC1 vs.PC2: Factor loading

由圖5可知，第一主成分(PC1)由W5C、W5S和W2W等3 個(gè)傳感器檢測的指標(biāo)構(gòu)成并占全部變量權(quán)重的88.73%，而第二主成分(PC2)主要是由W1C、W3C、W6S、W1W、W2S、W1S和W3S等7 個(gè)傳感器檢測的指標(biāo)組成，占全部變量權(quán)重的9.17%?；陔娮颖羌夹g(shù)不同浸米時(shí)間黃酒風(fēng)味品質(zhì)PC1和PC2的因子得分圖見圖6。

圖6 不同浸米時(shí)間黃酒風(fēng)味品質(zhì)的PC1與PC2因子得分圖Fig.6 Graphical representation of the PCA of Chinese rice wine samples fermented by glutinous rice soaked at different times showing PC1 vs.PC2 Factor scores

由圖6可知，浸泡1、3、5、7、9 d糯米釀造的黃酒樣品主要集中在X軸上方，而浸泡11、13、15和17 d糯米釀造的黃酒樣品主要集中在X軸下方。由此可見，使用電子鼻檢測的結(jié)果與GC-MS基本一致，即糯米浸泡時(shí)間達(dá)到11 d以上時(shí)會(huì)對(duì)黃酒的風(fēng)味產(chǎn)生明顯的影響。結(jié)合圖5可知，隨著浸米時(shí)間的延長，傳感器W5C(對(duì)烷烴、芳香類物質(zhì)靈敏)和W5S(對(duì)氮氧化物靈敏)的響應(yīng)值呈下降趨勢，而傳感器W2W(對(duì)有機(jī)硫化物靈敏)響應(yīng)值呈上升趨勢。由此可見，當(dāng)浸米時(shí)間達(dá)到11 d以上時(shí)，釀造黃酒中芳香類物質(zhì)明顯下降。綜合GC-MS和電子鼻分析發(fā)現(xiàn)，浸米時(shí)間不應(yīng)超過11 d，否則會(huì)對(duì)黃酒風(fēng)味品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響。通過以浸米漿水中總酸含量、乳酸含量及乳酸菌數(shù)為指標(biāo)，姬中偉等認(rèn)為浸米時(shí)間控制在8～12 d時(shí)所得漿水對(duì)黃酒發(fā)酵比較合適[20]，其結(jié)論與本研究相符。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)醇類和酯類化合物為黃酒中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，且隨著浸米時(shí)間的延長黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中醇類的相對(duì)含量顯著下降，而酯類含量顯著升高。當(dāng)浸米時(shí)間達(dá)到11 d以上時(shí)，黃酒的風(fēng)味會(huì)發(fā)生明顯的變化，且芳香類物質(zhì)明顯下降。由此可見，以黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)作為考察指標(biāo)來反應(yīng)浸米時(shí)間對(duì)黃酒品質(zhì)的影響時(shí)，浸泡時(shí)間控制在11 d內(nèi)，所得漿水對(duì)黃酒發(fā)酵比較有利。