口腔鱗狀細(xì)胞癌miR的生物信息學(xué)挖掘與分析

樊麗娜，胡雪剛，邱在玲，呂紅兵，周文土，傅 升

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是最常見的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，其局部浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率很高，5年生存率為40%～50%［1－2］。因此迫切需要深入探索 OSCC的分子特征，尋找新的靶向治療策略。

微小RNA（microRNA，miR）是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA分子（18～25個(gè)核苷酸），能夠與靶mRNA特異性結(jié)合，從而降解或抑制mRNA的蛋白質(zhì)翻譯［3］。miR在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和代謝等多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［4－7］。但是，目前缺乏對 OSCC中 miR表達(dá)譜的全面和系統(tǒng)的分析。本研究使用癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫發(fā)布的OSCC miR高通量數(shù)據(jù)來篩選人OSCC與正常組織之間的差異表達(dá)miR，并進(jìn)行其靶基因的預(yù)測和GO功能富集分析。

1 材料與方法

1.1 TCGA 中 miR 數(shù)據(jù)集 從 TCGA（http：／／cancergenome.nih.gov／）數(shù)據(jù)庫下載人 OSCC的組織樣本和正常組織樣本的miR的表達(dá)數(shù)據(jù)，使用Illumina HiSeq系統(tǒng)檢測miR的表達(dá)水平，作為TCGA的第3階段數(shù)據(jù)，提取標(biāo)準(zhǔn)化miR數(shù)據(jù)，去除零表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2 篩選差異表達(dá)的miR 使用R軟件的edger函數(shù)篩選差異倍數(shù)＞2、P＜0.05條件下正常口腔組織樣本和OSCC組織樣本之間的差異表達(dá)miR，繪制OSCC與癌旁組織差異miR火山圖，選取其中差異倍數(shù)＞10，P＜0.01的miR進(jìn)行熱圖繪制。

1.3 差異表達(dá)miR靶基因預(yù)測與篩選 使用TargetScan軟件預(yù)測差異 miR靶基因［8］。運(yùn)用Venny工具進(jìn)行集合，獲取與OSCC相關(guān)差異miR的共同靶基因。

1.4 差異表達(dá)miR靶基因的GO功能富集分析采用 DAVID（https：／／david.ncifcrf.gov／home.jsp）在線工具對集合得到差異miR的共同靶基因進(jìn)行GO功能富集分析［9］，P＜0.01為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0與 GraphPad Prism 7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。OSCC與癌旁組織的miR表達(dá)比較采用非配對t檢驗(yàn)。P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 樣本間miR表達(dá)數(shù)據(jù) 根據(jù)篩選條件下載的389個(gè)樣本共有1 599個(gè)miR表達(dá)譜，包括44個(gè)正常組織樣本和345個(gè)OSCC組織樣本。

2.2 OSCC與癌旁組織間差異miR的篩選 在正常組織樣本和OSCC組織樣本之間共有402個(gè)差異miR（差異倍數(shù)＞10，P＜0.05），其中表達(dá)上調(diào)的有250個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有152個(gè)。通過上述分析結(jié)合t檢驗(yàn)，繪制OSCC組織樣本及癌旁組織樣本間差異miR火山圖（圖1），其中差異倍數(shù)＞10，P＜0.01的miR共17個(gè)（6個(gè)下調(diào)，11個(gè)上調(diào)）（圖2），對這17個(gè)差異miR進(jìn)行聚類熱圖繪制（圖3）。

圖1 口腔鱗癌和癌旁組織二者差異miR火山圖Fig 1 The volcano map between oral squamous cell carcinoma and adjacent tissues of differential miR

2.3 差異miR靶基因預(yù)測及篩選 應(yīng)用靶基因預(yù)測網(wǎng)站對差異miR的靶基因進(jìn)行預(yù)測，篩選得到差異miR及其預(yù)測靶基因數(shù)目（表1）。利用Venny工具對預(yù)測的靶基因進(jìn)行集合，獲取OSCC差異miR的共同靶基因564個(gè)，其中上調(diào)的差異miR有561個(gè)共同靶基因，下調(diào)的差異miR有3個(gè)共同靶基因（圖4）。

圖2 口腔鱗癌和癌旁組織間17個(gè)顯著差異表達(dá)miRFig 2 17miR were expressed differentially between oral squamous cell carcinoma and adjacent tissues

圖3 口腔鱗癌和癌旁組織間17個(gè)顯著差異表達(dá)miR熱圖Fig 3 Heatmap of differentially expressed seventeen－miR between oral squamous cell carcinoma and adjacent tissues

圖4 差異miR靶基因的Venn圖Fig 4 Venn diagrams of differential miR target genes

2.4 靶基因的GO功能富集分析 通過GO注釋描述得到15個(gè)基因的GO細(xì)胞組分、22個(gè)基因的GO分子功能及93個(gè)基因的GO生物學(xué)過程的注釋信息（圖5）。結(jié)果顯示，差異表達(dá)的基因主要分布在細(xì)胞外膜、細(xì)胞器膜、突觸等，參與前體miR過程，正調(diào)控大分子生物合成過程，RNA過程，蛋白酶參與細(xì)胞蛋白降解過程、正調(diào)控細(xì)胞增殖過程，發(fā)揮蛋白結(jié)合、RNA結(jié)合、鈣離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合、轉(zhuǎn)換生長因子受體結(jié)合、結(jié)構(gòu)活性分子等功能（表2）。

3 討 論

過去幾十年，已有大量的基礎(chǔ)和臨床研究揭示了OSCC的形成、進(jìn)展和潛在機(jī)制，而大多研究集中在單個(gè)基因或者單一隊(duì)列。目前，癌癥的早期診斷和疾病進(jìn)展的檢測對于有效治療OSCC和獲得理想的臨床效果至關(guān)重要。因此，需要進(jìn)一步對OSCC的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)進(jìn)行研究，以便OSCC的早期診斷、病理鑒定、治療和監(jiān)測。

圖5 靶基因的GO功能富集分析Fig 5 Enrichment of functions of the target genes was conducted by GO

表1 口腔鱗癌中差異miR及其預(yù)測靶基因數(shù)目Tab 1 Differential miR and their target genes in OSCC

本研究使用來自TCGA數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)百個(gè)高通量的miR表達(dá)譜數(shù)據(jù)鑒定正常組織樣本與相應(yīng)的腫瘤組織樣本相關(guān)的基因突變和失調(diào)，也有一些研究使用TCGA數(shù)據(jù)對現(xiàn)有的生物標(biāo)記物進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證［10－12］。miR作為非編碼RNA的家族成員參與基因水平的調(diào)控，因?yàn)槠湓跈z測人類各種癌癥時(shí)表現(xiàn)出的穩(wěn)定性和便利性，已被公認(rèn)為重要的干預(yù)靶標(biāo)和預(yù)測工具［13－14］。大量研究證實(shí)，miR 在OSCC中具有致癌或抑癌作用。Lin等表明，OSCC患者血漿中的miR－24表達(dá)水平顯著高于對照［15］；Hung等研究證實(shí)，血漿中miR－146a水平升高對OSCC有診斷價(jià)值，且通過靶向調(diào)控IRAK1、TRAF6和NUMB基因增強(qiáng)致癌性［16］。

表2 差異表達(dá)基因的GO分析Tab 2 GO analysis of differently expressed genes

在本研究中，筆者整合了來自TCGA中大量的高通量數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析，篩選出顯著差異表達(dá)的miR共17個(gè)（6個(gè)顯著下調(diào)，11個(gè)顯著上調(diào)）。Xie等研究表明，miR－375是影響肝癌患者生存期的獨(dú)立因素，其低表達(dá)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為指導(dǎo)肝癌治療和預(yù)后的生物標(biāo)志物［17］。本研究結(jié)果與之一致。Siow等證實(shí)，miR－375的低表達(dá)與OSCC的晚期病變、腫瘤大小和侵襲模式顯著相關(guān)，提示它在OSCC的發(fā)生中起重要作用［18］。Hou等的研究也證明，miR－196b在OSCC中的表達(dá)水平顯著高于相鄰的正常組織樣本，其高表達(dá)可促進(jìn)口腔癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而沉默miR－196b的表達(dá)可抑制口腔癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲，miR－196b可以作為OSCC潛在的預(yù)后標(biāo)志物或治療靶標(biāo)［19］。其他差異表達(dá)miR大部分都與腫瘤有著密切的關(guān)系［20－23］。因此，推測篩選出的差異表達(dá)miR或許可作為OSCC的診斷生物標(biāo)志物及治療靶標(biāo)。

本研究對差異miR靶基因進(jìn)行GO注釋富集分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，靶基因顯著富集離子，特別是鈣離子的運(yùn)輸。Ca2＋可通過激活或抑制細(xì)胞信號通路，從而調(diào)控多種細(xì)胞生物過程，許多Ca2＋介導(dǎo)的信號通路參與腫瘤侵襲或轉(zhuǎn)移過程［24］。已有研究報(bào)道，一些Ca2＋通道或Ca2＋泵的異常表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。Gonzales等研究證實(shí)，TRPV1通道在OSCC中表達(dá)，且TRPV1拮抗劑能夠有效抑制OSCC細(xì)胞在體內(nèi)生長［25］；Saito等表明，PMCA1的下調(diào)與OSCC的進(jìn)展顯著相關(guān)，TRPM8在前列腺癌中高表達(dá)，而SERCA3在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)［26］。此外，功能注釋結(jié)果同樣表明，差異表達(dá)的基因主要分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜等與細(xì)胞生物學(xué)活動密切相關(guān)的部位，參與前體miR合成、細(xì)胞蛋白降解、蛋白激酶合成等生物過程，發(fā)揮與RNA結(jié)合、鈣離子結(jié)合、轉(zhuǎn)換生長因子受體結(jié)合等涉及發(fā)育和轉(zhuǎn)錄的分子功能。

綜述所述，本研究利用信息生物學(xué)方法篩選出hsa－miR－105－1、 hsa－miR－105－2、 hsa－miR－767、hsa－miR－1269b、hsa－miR－548f－1、hsa－miR－1269a、hsa－miR－885、hsa－miR－375、hsa－miR－135a－2等11個(gè)在OSCC組織樣本中顯著差異表達(dá)的miR，這些差異miR或許可作為OSCC潛在的生物標(biāo)志物，為OSCC患者的診斷或靶向治療研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。