過(guò)表達(dá)SIRT1對(duì)高糖誘導(dǎo)RVECs細(xì)胞的影響及對(duì)VEGF和PEDF表達(dá)的影響

周垂仁，黃衛(wèi)，江玲，龍碧

(1.重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院眼科；2.重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,重慶 402760)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是十分常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，也是導(dǎo)致成人失明的主要原因之一[1]。病程5年以上2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)患者合并DR的發(fā)生率為24%～40%，病程10年以上T2DM患者合并DR的發(fā)生率高達(dá) 53%～84%[2-3]。所以，對(duì)于DR的防治及其發(fā)病機(jī)制的研究具有十分重要的意義。有關(guān)DR的具體發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，一般認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果。近年來(lái)，有關(guān)沉默信息調(diào)節(jié)因子-1(silent information regulator-1，SIRT1)與糖尿病及其并發(fā)癥的相關(guān)研究，越來(lái)越受到眾多學(xué)者的重視[4-6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察過(guò)表達(dá)SIRT1對(duì)高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(retinal vascular endothelial cells，RVECs)增殖、凋亡，及其對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)表達(dá)的影響，從而為DR的臨床防治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

RVECs細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；培養(yǎng)液，胎牛血清，胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；慢病毒載體包裝系統(tǒng)包含pCDH-CMV-MCS-EF1-coHGFP、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G質(zhì)粒(美國(guó)System Biosciences公司)；人SIRT1基因片段(美國(guó)Santa Cruz Biotech公司)；逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(美國(guó)ABI Applied Biosystems公司)；兔抗人SIRT1、兔抗人VEGF、兔抗人PEDF，羊抗兔二抗，BAD顯色試劑盒(美國(guó)Santa Cruz公司)；原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(瑞士羅氏公司)；EcoRⅠ和AgeⅠ內(nèi)切酶，DNA回收和連接試劑盒(日本TaKaRa公司)；Opti-DMEM培養(yǎng)基，Lipofectamine 2000，TRIzol總RNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SIRT1過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)Gen Bank人SIRT1基因信息，委托上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成針對(duì)SIRT1基因的DNA寡核苷酸鏈。正向5’-CCGGGCGGGAATCCAAAGGATAATTCTCGAGAATTATCCTTTGGATTCCCGCTTTTG-3’，反向5’-AATTCAAAAAGCGGGAATCCAAAGGATAATTCTCGAGAATTATCCTTTGGATTCCCGC-3’(內(nèi)含EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位點(diǎn))，以人SIRT1基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，DNA凝膠回收試劑盒回收、純化。采用EcoRⅠ和AgeⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pCDH-CMV-MCS-EF1-coHGFP質(zhì)粒，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，經(jīng)氨芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序。pCHD-SIRT1、pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液經(jīng)0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾，獲得SIRT1過(guò)表達(dá)慢病毒，經(jīng)測(cè)定病毒滴度(MOI)=50。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 RVECs細(xì)胞株接種于10%胎牛血清的人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化、傳代。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，分為3組：(1)正常對(duì)照組(NG組)：正常培養(yǎng)RVECs細(xì)胞，不經(jīng)任何處理；(2)高糖組(HG組)：在含33 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)；(3)SIRT1過(guò)表達(dá)慢病毒組(SIRT1組)：用MOI=50的SIRT1過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并在含33 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后棄去更換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá) TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SIRT1 上游：5’-GACTTCAGGTCAAGGGAT-3’，下游：5’-CGTGTCTATGTTCTGGGTA-3’。 VEGF上游：5’-AAACTGTCAGCTCGGTCAGA-3’，下游：5’-TCAGGGGCCGATTAAAGCTC-3’。PEDF上游：5’-CGATGAGATCAGCATTCTCC-3’，下游：5’-ATTCTGGGTCACTTTCAGGG-3’。GAPDH上游：5’-GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC-3'，下游：5’-ATGCCTGCTTCACCACCACCTTG-3’。擴(kuò)增條件：94 ℃/3 min，94 ℃/1 min，61 ℃/30 s，72 ℃/30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃/7 min。采用2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)含量(RQ)，RQ=2-△△Ct。

1.2.4 蛋白印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心獲取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度。等量總蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)漂洗，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗人一抗工作液(抗SIRT1、抗VEGF、抗PEDF，1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS漂洗，加入羊抗兔二抗工作液(1∶500)，37 ℃孵育1 h。PBS漂洗，BAD顯色，Bio-rad系統(tǒng)分析，目的蛋白表達(dá)量=目的蛋白光密度值/內(nèi)參光密度值。

1.2.5 噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 RVECs細(xì)胞株接種于96孔板，具體分組及處理同1.2.2所述，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組只加培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入20 μL噻唑藍(lán)(5 mg/mL)。孵育4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜。振搖15 min，充分溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀測(cè)定OD (570)值。假設(shè)NG組細(xì)胞增值率為100%，計(jì)算SIRT1組和HG組細(xì)胞增殖率=(SIRT1組或HG組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(NG組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.6 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡 RVECs細(xì)胞株接種于放置蓋玻片的6孔板中，具體分組及處理同1.2.2。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組蓋玻片，二甲苯浸洗2次，梯度酒精浸洗1次，PBS漂洗2次。加入Proteinase K工作液，37 ℃下孵育30 min。PBS漂洗2次，加入50 μL的TUNEL反應(yīng)混合液，封膜，暗濕盒中37℃下孵育30 min。PBS漂洗3次，加50 μL 的converter-POD工作液，封膜，暗濕盒中37 ℃下孵育30 min。PBS漂洗3次，加入100 μL的DAB顯色劑，25 ℃下孵育10 min。PBS漂洗3次，蘇木素，自來(lái)水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡400倍光鏡下，取7個(gè)陽(yáng)性視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞百分比作為凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SIRT1、VEGF和PEDF基因表達(dá)比較

經(jīng)單因素方差分析，NG組、HG組和SIRT1組細(xì)胞SIRT1、VEGF和PEDF基因表達(dá)水平存在顯著性差異(F=11.279，P=0.002；F=10.815，P=0.002；F=19.601，P<0.001)。經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，HG組細(xì)胞SIRT1基因表達(dá)水平低于NG組(t=3.623，P<0.001)，而VEGF和PEDF基因表達(dá)水平高于NG組(t=4.339、6.037，P<0.001)；SIRT組SIRT1基因表達(dá)水平較HG組顯著增加(t=3.754，P<0.001)，而VEGF和PEDF基因表達(dá)水平顯著降低(t=4.445、5.893，P<0.001)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞SIRT1、VEGF和PEDF基因表達(dá)水平比較

注：所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次，*P<0.001，與HG組比較；#P<0.001，與NG組比較。

2.2 SIRT1、VEGF和PEDF蛋白表達(dá)比較

經(jīng)方差分析，NG組、HG組和SIRT1組細(xì)胞SIRT1、VEGF和PEDF蛋白表達(dá)水平均存在顯著性差異(F=16.327、27.433、19.981，P<0.001)。經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，HG組SIRT1蛋白表達(dá)水平較NG組顯著降低(t=11.766，P<0.001)，而VEGF和PEDF蛋白表達(dá)水平顯著增加(t=6.797、5.296，P<0.001)；SIRT組SIRT1蛋白表達(dá)水平較HG組顯著增加(t=12.475，P<0.001)，而VEGF和PEDF蛋白表達(dá)水平顯著降低(t=5.674、6.012，P<0.001)。見(jiàn)表2和圖1。

表2 各組細(xì)胞SIRT1、VEGF和PEDF蛋白表達(dá)水平比較

注：所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次，*P<0.001，與NG組比較；#P<0.001，與HG組比較。

2.3 過(guò)表達(dá)SIRT1對(duì)RVECs細(xì)胞增殖和凋亡的影響

經(jīng)方差分析，NG組、HG組和SIRT1組細(xì)胞增殖率、凋亡率均存在顯著性差異(F=57.152、7.718，P<0.001)。經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，HG組細(xì)胞增殖率較NG組顯著增加(t=7.302，P<0.001)，而凋亡率顯著降低(t=4.014，P<0.001)；SIRT1組細(xì)胞增殖率較HG組顯著降低(t=6.543，P<0.001)，而細(xì)胞凋亡率顯著增加(t=4.783，P<0.001)。見(jiàn)表3和圖2。

表3 過(guò)表達(dá)SIRT1對(duì)RVECs細(xì)胞增殖和凋亡的影響

注：所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次，*P<0.001，與NG組比較；#P<0.001，與HG組比較。

2.4 SIRT1與VEGF和PEDF的相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，SIRT1表達(dá)水平與VEGF和PEDF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.814，P=0.005；r=-0.593，P=0.029)。

3 討論

SIRT1是一種組蛋白脫乙?；鞍酌?，通過(guò)其脫乙?；饔枚鴧⑴c體內(nèi)眾多蛋白酶和轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)節(jié)[7-8]。Mortuza等[4]研究發(fā)現(xiàn)，高糖可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-195的表達(dá)，并通過(guò)與SIRT1的3’端非編碼區(qū)(3’-UTR)結(jié)合而抑制SIRT1表達(dá)。Li等[5]研究證實(shí)，糖尿病腎病模型大鼠SIRT1表達(dá)顯著降低。Hou等[6]學(xué)者認(rèn)為，SIRT1通過(guò)促進(jìn)能量代謝平衡重建、調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)、抗細(xì)胞凋亡、抑制炎癥和改善腎纖維化等方面發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。以上結(jié)果說(shuō)明SIRT1在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而有關(guān)SIRT1在DR發(fā)生、發(fā)展中的作用研究，鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HG組細(xì)胞增殖率較NG組顯著增加，凋亡率顯著降低；SIRT1組細(xì)胞增殖率較HG組顯著降低，凋亡率顯著增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)RVECs細(xì)胞增殖和降低其凋亡，而過(guò)表達(dá)SIRT1能夠逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的RVECs細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

DR的主要病理特征表現(xiàn)為視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及新生血管形成等。VEGF和PEDF被認(rèn)為是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增生及新生血管形成的關(guān)鍵細(xì)胞因子，二者表達(dá)的失衡是引起DR 發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[9-11]。正常情況下，眼部組織VEGF呈低表達(dá)，從而維持眼部血管的完整性。如果VEGF過(guò)度表達(dá)，則會(huì)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管形成，并增加血管通透性，引起血-視網(wǎng)膜屏障損傷[12-14]。目前，臨床上采用VEGF抗體治療DR患者黃斑水腫和新生血管，已取得令人滿意的療效[15]。PEDF可拮抗VEGF表達(dá)阻斷新生血管形成，能上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)阻止神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是維持新生血管穩(wěn)態(tài)的必要條件[16-17]。Matsuyama等[18]學(xué)者報(bào)道顯示DR患者血清PEDF表達(dá)顯著高于健康人群。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HG組細(xì)胞VEGF和PEDF表達(dá)均顯著高于NG組，而SIRT1組細(xì)胞VEGF和PEDF表達(dá)較HG組顯著降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)RVECs細(xì)胞VEGF和PEDF表達(dá)增加，而過(guò)表達(dá)SIRT1能夠逆這一現(xiàn)象。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)SIRT與VEGF的研究較少。邵瀅等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-217通過(guò)與SIRT1的3’-UTR結(jié)合而抑制SIRT1表達(dá)，從而上調(diào)HIF-1α表達(dá)。Kang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高糖可誘導(dǎo)HIF-1α激活，繼而刺激其下游VEGF表達(dá)增加，誘導(dǎo)新生血管形成。說(shuō)明SIRT與VEGF之間存在某種關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SIRT1表達(dá)與VEGF呈負(fù)相關(guān)。有關(guān)SIRT1與PEDF的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中也觀察到HG組PEDF表達(dá)增加，且過(guò)表達(dá)SIRT1可逆轉(zhuǎn)高糖引起的PEDF表達(dá)增加。我們推測(cè)可能是由于高糖誘導(dǎo)VEGF表達(dá)增加，而引起PEDF代償性表達(dá)增加。

綜上所述，高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)RVECs細(xì)胞增殖、減少凋亡，并上調(diào)細(xì)胞VEGF和PEDF表達(dá)。過(guò)表達(dá)SIRT1能夠抑制高糖誘導(dǎo)的RVECs細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，并且下調(diào)VEGF和PEDF表達(dá)。