大白豬群中PIT1基因多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性研究

鄭安代，李明楊，謝永杰，聶光偉，毛慧敏，王國水，左 波*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點實驗室，武漢 430070；2.浙江天蓬集團(tuán)有限公司，浙江 江山 324111；3.雛鷹農(nóng)牧集團(tuán)股份有限公司，河南 鄭州 451162）

1 概述

PIT-1（pituitary transcription factor1，PIT-1）基因是POU結(jié)構(gòu)域蛋白家族的一員，它是重要的組織特異性轉(zhuǎn)錄因子，參與激活生長激素（GH）、催乳素（PRL）、促甲狀腺素β亞單位（TSHβ）基因的表達(dá)調(diào)控，從而對動物的生長發(fā)育有著直接或間接的作用[1]。另有研究表明，PIT1基因突變會阻礙GH、PRL、TSHβ激素的分泌，從而引起動物矮小[2]。在一些因缺少多種垂體激素而導(dǎo)致侏儒的人體和小鼠中，都可發(fā)現(xiàn)缺少PIT1基因的活性[3，4]?，F(xiàn)在，豬的PIT1基因已被定位在13號染色體上的q46區(qū)域[5]。1993年，Tuggle[6]等將PIT1基因作為影響豬生長性狀的候選基因，研究PIT1基因多態(tài)性與豬生長胴體性狀之間的關(guān)聯(lián)性，并在梅山豬中發(fā)現(xiàn)了一個BamHI的多態(tài)位點。Yu[7]等檢測了BamHI、MspI、RsaI三個酶切位點，并對其進(jìn)行研究，其中PIT1基因的MspI位點與初生重和背膘厚顯著相關(guān)。而Stancekova等在大白豬和大白與長白豬雜家群體中研究MspI酶切位點與重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)背膘厚和瘦肉率均達(dá)到顯著水平[8]。因此，人們研究PIT1基因的多態(tài)性，將其作為重要遺傳標(biāo)記，為生長性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

法系大白豬313頭（源自浙江開盛生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司），體重在85～135 kg，使用一次性采血器在前腔靜脈處采集血液?；蚪MDNA采用血液基因組DNA中量提取試劑

精品思想 市場戰(zhàn)略盒（離心柱型）提取，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

2.2 PCR擴(kuò)增

本實驗主要利用PCR-RFLP 技術(shù)進(jìn)行基因分型，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為10 mL：：2×Es Taq Master Mix（含染料）5.0 mL；ddH2O 4.0 mL；Sense primer（10 mmol）0.25 mL；Antisense primer（10m mol） 0.25 mL ；DNA 0.5 mL。PIT1 基因反應(yīng)程序：94 ℃，5 min；35個循環(huán)（30 s 94 ℃，30 s 65 ℃，30 s 72 ℃）；72 ℃，5 min ；25 ℃，1 min。

圖1 PIT-1基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

圖2 PIT-1基因PCR-MspIRFLP酶切分型凝膠電泳結(jié)果

表1 擴(kuò)增目的基因所用的引物

表2 大白豬群中PIT-1和HDAC1基因型頻率和等位基因頻率

表3 PIT1基因MspI多態(tài)性與大白豬性狀間的關(guān)聯(lián)分析

2.3 PCR-RFLP 分析

PIT1基因用限制性內(nèi)切酶MspI進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體 系 為 ：PCR 產(chǎn) 物 10.0 mL，10×FastDigest Green buffer 2.0 mL，內(nèi)切酶 0.5 mL，ddH2O 7.5 mL。37 ℃消化1 h。酶切產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分型，并拍照保存圖片。

2.4 統(tǒng)計分析

本實驗所采用模型為：Tijkl=μ+Gi+Fj+Sk+Pl+eijklm，Tijkl 為性狀表型值，μ 為平均值，Gi 為基因型效應(yīng)（包括基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)）；Fj、Sk、Pl 為固定效應(yīng)，分別為家系、性別、批次，eijklm 為殘差效應(yīng)。采用SAS 軟件GLM 模型自編程序完成，同時采用reg 程序計算基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，并進(jìn)行顯著性檢驗。

3 結(jié)果與分析

3.1 PIT1基因的PCR-MspI-RFLP多態(tài)性檢測

本研究用于檢測PIT1基因多態(tài)性的擴(kuò)增片段產(chǎn)物長度為2 100 bp，見圖1。利用MspI限制性內(nèi)切酶酶切 后 產(chǎn) 生 1 680 bp、850 bp、830 bp和 420 bp 4個 片段，根據(jù)條帶類型的不同共檢測到3種基因型，分別命名 為 DD基 因 型（850 bp+830 bp+420 bp）、CD基 因型（1 680 bp+850 bp+830 bp+420bp） 和 CC基 因 型（1 680 bp+420 bp）。基因分型結(jié)果見圖2。

3.2 PIT1基因在大白豬中的基因頻率分布及與生長和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析

3.2.1 PIT1基因在大白豬群體中的基因頻率分布

利用PCR- RFLP 技術(shù)對PIT1基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，在法系大白豬中檢測到3種基因型，對各基因型頻率進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果如表2 所示。

由表2得出，在法系大白豬群體PIT1基因的C等位基因和D等位基因的頻率比較接近，D等位基因在群體中的分布略高于C等位基因，且D等位基因為優(yōu)勢等位基因。哈迪-溫伯格（Hardy-Weinbery）平衡結(jié)果顯示，PIT-1基因在大白群體中符合哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)(P＞0.05)。

3.2.2 PIT1基因多態(tài)性與法系大白豬生長及胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析

對PIT1基因多態(tài)性位點的不同基因型與大白豬生長及胴體性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出PIT1基因在在法系大白豬中，DD基因型個體左乳頭數(shù)高于CD型基因型個體乳頭數(shù)，兩者差異顯著（P＜0.05），且高于CC基因型個體，但不顯著。其他性狀都沒有達(dá)到顯著水平，但是DD基因型個體的初生重、活體測體長均高于CC基因型和CD基因型，而CC基因型個體的活體背膘厚、達(dá)100 kg體重日齡要低于CD基因型個體和DD基因型個體。

4 討論

PIT1基因MspI 酶切位點在大白豬群體中有基因分型。其中PIT1基因MspI位點在大白豬品種中D等位基因略高于C等位基因，D等位基因是優(yōu)勢等位基因，這與Stancekova等[8]和柳小春等[9]研究結(jié)果一致。其中，PIT1基因MspI酶切位點3種基因型與大白豬生長性狀之間相關(guān)性不顯著，但 CC基因型個體的活體背膘厚、達(dá)100 kg體重日齡要低于CD基因型個體和DD基因型個體，說明CC基因型在生長速度上要優(yōu)于DD基因型，C等位基因?qū)τ谏L性狀具有正效應(yīng)，而且還具有降低活體背膘厚的作用。而在劉峰[10]的研究中，大白、長白、杜洛克3個品種中CC基因型個體的達(dá)100 kg體重日齡都顯著低于DD基因型個體。本實驗結(jié)果與其是一致的，但與Yu[7]等的結(jié)果是相反的。

PIT1基因的功能對豬的生長發(fā)育影響較大，且該基因CC基因型個體具有背膘薄、瘦肉率高、脂肪率低、生長速度快的特點[8，10]，而本實驗也證明了CC基因型個體背膘薄以及100 kg體重日齡低的特點。這些研究結(jié)果證明PIT1基因可以作為背膘厚、達(dá)100 kg體重日齡等生長胴體性狀的候選基因，并應(yīng)用到分子育種中。而選擇該基因的CC基因型個體能夠使得豬群向著生長速度快、背膘薄的方向發(fā)展。