長(zhǎng)鏈非編碼RNAH19在甲狀腺癌中的表達(dá)及預(yù)后預(yù)測(cè)的研究

劉娜　乞艷華　周琦

[摘要] 目的 探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19（lncRNA H19）在甲狀腺癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性，尋找影響甲狀腺癌治療及預(yù)后的新靶點(diǎn)。 方法 選取2009年1月～2012年1月從西安交大第二附屬醫(yī)院搜集的131例甲狀腺癌組織和癌旁組織為病例組，另外同期選取122例甲狀腺良性腫瘤組織作為對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）方法檢測(cè)lncRNA H19的表達(dá)情況。之后進(jìn)行5年跟蹤隨訪(fǎng)。通過(guò)受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)分析評(píng)估lncRNA H19對(duì)甲狀腺癌的診斷價(jià)值。應(yīng)用Kaplan-Meier方法計(jì)算5年累積生存率，預(yù)后相關(guān)單因素分析采用Log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸模型。 結(jié)果 與甲狀腺良性腫瘤組織及癌旁組織比較，甲狀腺癌組織中l(wèi)ncRNA H19表達(dá)升高（P < 0.05）。lncRNA H19診斷甲狀腺癌ROC曲線(xiàn)下面積（AUC）為0.801，診斷閾值3.58，敏感度和特異度分別為72.5%和75.4%，約登指數(shù)0.479。腫瘤直徑≥1 cm、TNM Ⅲ+Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌組織中l(wèi)nc RNA H19表達(dá)水平明顯高于腫瘤直徑<1 cm、TNM Ⅰ+Ⅱ期及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。lncRNA H19高表達(dá)者5年生存率下降（28.44%）。lncRNA H19表達(dá)水平、腫瘤直徑、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響甲狀腺癌預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。 結(jié)論 lncRNA H19在甲狀腺癌組織中高表達(dá)，lncRNA H19表達(dá)水平上調(diào)與甲狀腺癌預(yù)后差相關(guān)，提示其可能是甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)節(jié)機(jī)制之一，并可為甲狀腺癌早期無(wú)創(chuàng)診斷及治療靶點(diǎn)的尋找提供重要理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 甲狀腺癌；長(zhǎng)鏈非編碼RNAs；長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19；預(yù)后

[中圖分類(lèi)號(hào)] R736.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）05（a）-0025-06

Expression status and prognostic significance of lncRNA H19 in thyroid carcinoma

LIU Na1 QI Yanhua1 ZHOU Qi1 CHENG Chuantao2 YANG Wenbin2

1.Department of Ultrasound， the Second Affiliated Hospital of Xi′an Jiao Tong University， Shaanxi Province， Xi′an 710004， China； 2.Department of General Surgery， the Second Affiliated Hospital of Xi′an Jiao Tong University， Shaanxi Province， Xi′an 710004， China

[Abstract] Objective To explore the expression of long non-coding RNA H19 （lncRNA H19） in thyroid carcinoma （TC）， and its correlation with the clinicopathologic characteristics and prognosis of TC. Methods From January 2009 to January 2012， 131 TC tissues and adjacent tissues were collected from patients after thyroid surgery between as case group. Concurrently， additional 122 normal thyroid tissues from patients with benign thyroid lesions were obtained as normal control group. The expression level of lncRNA H19 were detected by quantitative real-time PCR （qRT-PCR）. five years follow-ups were conducted. Receiver operating curve（ROC） was used to evaluate the diagnostic values of lncRNA H19 for TC. The Kaplan-Meier method were employed to analyze 5-year survival rate of TC patient. Both univariate and multivariate analyses were performed to analyze the prognostic factors of TC. Results The lncRNA H19 expression was higher in TC tissues than that in the adjacent and normal tissues（P < 0.05）. The area under the ROC curve（AUC） of lncRNA H19 were 0.801. Diagnostic boundary point was 3.58. Sensitivity and specificity was 72.5% and 75.4% respectively. Youden index was 0.479. The lncRNA H19 expression in TC tissue with tumor diameter no less than 1 cm， TNM Ⅲ+Ⅳ stage， or lymph node metastasis was evidently higher than that in TC tissue with tumor smaller than 1 cm， TNM Ⅰ+Ⅱ stage， or without lymph node metastasis（P < 0.05）. The 5-year survival rate of TC patients with high lncRNA H19 expression declined （28.44%）. The expression of lncRNA H19， tumor diameter， TNM stage and lymph node metastasis were independent prognostic factors of TC patients （P < 0.05）. Conclusion The increased lncRNA H19 expression levels are associated with clinicopathologic characteristics and poor prognosis in TC patients. And it may be one of the molecular regulation mechanism in TC occurrence and development. This study also can provide basis for noninvasive diagnosis and therapeutic target searching in TC.

[Key words] Thyroid carcinoma； Long non-coding RNAs； lncRNA H19； Prognosis

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，且30年來(lái)，發(fā)病率逐漸增高，目前統(tǒng)計(jì)我國(guó)甲狀腺癌的發(fā)病率和病死率分別為0.32%和0.03%[1]。甲狀腺乳頭狀癌是主要的病理類(lèi)型，占所有甲狀腺惡性腫瘤的86%[2]。甲狀腺癌根治術(shù)是目前治療甲狀腺癌的主要方式，雖然絕大多數(shù)患者手術(shù)切除后有很好的總體生存率，但也有部分患者手術(shù)治療后預(yù)后差。甲狀腺癌的侵襲特征、發(fā)生機(jī)制尚不明確，分子調(diào)控機(jī)制是一個(gè)新的思路。一個(gè)理想的生物標(biāo)志物有助于早期診斷甲狀腺癌，判斷其預(yù)后情況。lncRNAs（long non-coding RNAs）一般是指大于200個(gè)核苷酸，缺少為蛋白質(zhì)編碼功能的RNA[3]。已有證據(jù)表明lncRNAs與多種惡性腫瘤的發(fā)生、遷移、凋亡過(guò)程相關(guān)[4]。lncRNA H19在人胚胎組織，骨骼肌肉組織大量表達(dá)，其調(diào)節(jié)通路與許多腫瘤如胃腸道腫瘤、結(jié)腸腫瘤和膀胱腫瘤的基因凋亡有關(guān)[5]。另外，長(zhǎng)鏈非編碼RNA相對(duì)于短鏈和中鏈非編碼RNA的研究歷史更長(zhǎng)，數(shù)據(jù)庫(kù)較全[6]。但是，關(guān)于lncRNAs和它在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所扮演的角色鮮有報(bào)道。因此，探索lncRNA H19與甲狀腺癌預(yù)后的相關(guān)性，期望發(fā)現(xiàn)一種新的甲狀腺癌早期診斷和預(yù)后判斷的方法，是本文的宗旨。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2009年1月～2012年1月，收集在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）行甲狀腺癌根治術(shù)的131例甲狀腺癌組織和癌旁組織（距甲狀腺癌組織3～5 cm。同期，收集122例行甲狀腺部分切除術(shù)的甲狀腺良性疾病的甲狀腺組織作為對(duì)照組。所有組織標(biāo)本用10%甲醛固定并石蠟包埋，切面厚度4 μm備用。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署使用其組織樣本知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者除了病理診斷為甲狀腺癌，其他器官?zèng)]有嚴(yán)重疾病。②患者尚未進(jìn)行甲狀腺癌術(shù)后為期3周的放射治療。③患者術(shù)前甲功正常；④患者無(wú)其他惡性腫瘤病史或放射線(xiàn)暴露史。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或肺轉(zhuǎn)移（包括合并其他腫瘤或原發(fā)性肺癌）。②患者有精神疾患或情緒不穩(wěn)定無(wú)法配合。③患者有慢性疾病如心肌梗死、腦卒中、心力衰竭和心房纖顫。④患者術(shù)前甲功不正常。⑤患者有其他惡性腫瘤病史或放射線(xiàn)暴露史。

病例組中，男43例，女88例；年齡15～78歲，平均（45.3±8.2）歲。對(duì)照組中，男38例，女84例；年齡20～74歲，平均（47.1±8.7）歲。兩組年齡和性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。病例組中，87例腫瘤直徑≥1.0 cm，44例腫瘤直徑< 1.0 cm；甲狀腺癌術(shù)后病理分型中，76例為甲狀腺乳頭狀癌，29例濾泡癌，26例髓樣癌；52例腫瘤突破包膜，79例腫瘤未突破包膜；根據(jù)2002年UICC指南中甲狀腺癌TNM分期[7]，51例TNM Ⅰ+Ⅱ期，80例TNM Ⅲ+Ⅳ期；69例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，62例沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

采用TRIzol法提取病例組與對(duì)照組樣本組織RNA。按照TAKARA試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄第一個(gè)單鏈DNA（TAKARA，寶生物工程大連有限公司），合成出的cDNA作為模板用于擴(kuò)增H19和GAPDH（內(nèi)參基因）。PCR反應(yīng)體系（20 μL）組成包括7.8 μL的雙蒸餾水，1.0 μL DNA模板，各0.4 μL上游和下游引物，0.4 μL ROX參考染料（50×），10.0 μL SYBR。反應(yīng)流程：95℃條件下，預(yù)變性2 min，接著40個(gè)循環(huán)，95℃，5 s；冷卻到60℃，34 s，延伸到68℃，30 s；取各個(gè)樣本的cDNA及其相對(duì)應(yīng)的引物（表1）按照以上方法混合，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，收集熒光信號(hào)，進(jìn)行熔接曲線(xiàn)分析，反應(yīng)結(jié)束后由系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算相對(duì)定量的結(jié)果，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.3 隨訪(fǎng)觀察

對(duì)患者的隨訪(fǎng)主要通過(guò)門(mén)診復(fù)查、電話(huà)及電子郵件的方式，一般在術(shù)后第1個(gè)月進(jìn)行1次，第1年每3個(gè)月隨訪(fǎng)1次，第2年每6個(gè)月隨訪(fǎng)1次，以后每1年隨訪(fǎng)1次，一直隨訪(fǎng)至2017年1月31日結(jié)束。隨訪(fǎng)率達(dá)到100%，所有患者相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)都被隨訪(fǎng)記錄了5年。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher's 精確概率檢驗(yàn)；ROC曲線(xiàn)評(píng)價(jià)lncRNA H19對(duì)甲狀腺癌的診斷價(jià)值；Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)法及Log-Rank檢驗(yàn)分析不同lncRNAH19表達(dá)程度患者5年總體生存期的差異；COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析lncRNAH19表達(dá)及臨床病理特征對(duì)總體生存期的影響，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lnc RNA H19在甲狀腺癌組織、癌旁組織及正常甲狀腺組織中的表達(dá)情況

qRT-PCR結(jié)果顯示，lnc RNA H19在甲狀腺癌組織、癌旁組織及正常甲狀腺組織中表達(dá)分別為（4.02±0.85）、（3.24±0.73）和（3.07±0.81）。與癌旁組織及正常甲狀腺組織比較，lnc RNA H19在甲狀腺癌組織中表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。lnc RNA H19在癌旁組織和正常甲狀腺組織中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 ROC曲線(xiàn)評(píng)價(jià)lnc RNA H19對(duì)甲狀腺癌的診斷價(jià)值

lnc RNA H19表達(dá)診斷甲狀腺癌 ROC曲線(xiàn)下面積0.801（P < 0.001；95%CI：0.747～0.855），診斷閾值3.58，敏感度和特異度分別為72.5%和75.4%，約登指數(shù)0.479。提示當(dāng)lncRNA H19表達(dá)水平≥3.58時(shí)，甲狀腺癌發(fā)生機(jī)會(huì)增加。見(jiàn)圖2。

2.3 lnc RNA H19表達(dá)水平與甲狀腺癌不同臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)約登指數(shù)，選取靈敏度和特異度之和的最高點(diǎn)為截?cái)嘀担琹nc RNA H19 診斷界點(diǎn)為3.58，≥3.58表示H19高表達(dá)，<3.58表示H19低表達(dá)。結(jié)果顯示，腫瘤直徑≥1 cm、TNM Ⅲ+Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌組織中l(wèi)nc RNA H19表達(dá)水平明顯高于腫瘤直徑<1 cm、TNM Ⅰ+Ⅱ期及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。lnc RNA H19的表達(dá)水平在不同性別、年齡、組織病理分型及包膜浸潤(rùn)的甲狀腺癌組織中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 lnc RNA H19表達(dá)與甲狀腺癌預(yù)后的相關(guān)性

術(shù)后隨訪(fǎng)5年的131例患者中，53例患者存活，78例患者死亡，死亡率為59.5%。131例患者術(shù)后病理證實(shí)，22%周?chē)M織侵犯，10%遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，6%對(duì)側(cè)甲狀腺轉(zhuǎn)移，40%頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例中，8例肺轉(zhuǎn)移，1例肝轉(zhuǎn)移，4例骨轉(zhuǎn)移，1例腎上腺轉(zhuǎn)移。其中乳頭狀癌死亡41例，髓樣癌死亡18例，濾泡狀癌死亡19例。其中64例死于該腫瘤，14例死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Kaplan-Meier生存分析曲線(xiàn)顯示，lncRNA H19高表達(dá)者5年生存率為28.44%（27/95），低表達(dá)者5年生存率為72.2%（26/36）。見(jiàn)圖3。

2.5 單因素分析影響甲狀腺癌預(yù)后因素

預(yù)后相關(guān)單因素分析采用Log-rank檢驗(yàn)，結(jié)果顯示腫瘤直徑≥1.0 cm，高的TNM分期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，平均生存率降低（P < 0.05）?？傮w生存率與性別、年齡、組織病理分型、有無(wú)包膜浸潤(rùn)等臨床病理特征無(wú)明顯相關(guān)性（P > 0.05）。見(jiàn)表3。

2.6 多因素分析影響甲狀腺癌預(yù)后因素

采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，分析lnc RNA H19表達(dá)程度、年齡、性別、腫瘤直徑、組織病理分型、有無(wú)包膜浸潤(rùn)、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與甲狀腺癌預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示lnc RNA H19表達(dá)，腫瘤直徑，TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響甲狀腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P < 0.05）。年齡、性別、組織病理分型、有無(wú)包膜浸潤(rùn)與甲狀腺癌預(yù)后無(wú)關(guān)（P > 0.05）。表見(jiàn)4。

3 討論

發(fā)現(xiàn)控制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)腫瘤發(fā)生和腫瘤治療至關(guān)重要。本研究旨在探索lnc RNA H19表達(dá)與甲狀腺癌不同臨床病理特征的關(guān)系，及對(duì)甲狀腺癌預(yù)后影響，探索其機(jī)制，以提供更好的早期診斷和治療方式。

首先，本研究結(jié)果顯示lnc RNA H19在甲狀腺癌組織中表達(dá)較高。lnc RNA已被證實(shí)參與多種腫瘤發(fā)生[8]，lncRNAs失調(diào)影響表觀遺傳信息，發(fā)揮細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)惡性腫瘤生長(zhǎng)[9]。其中l(wèi)nc RNA H19是典型的例子，但它在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色鮮有報(bào)道。H19基因位于人染色體11p15，可轉(zhuǎn)錄成大小約2.3 kb的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，即lnc RNA H19參與基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程[10]，轉(zhuǎn)錄的H19保守印記基因簇也轉(zhuǎn)錄編碼胰島素樣生長(zhǎng)因子2（IGF2），H19-IGF2基因?qū)ε咛グl(fā)育和生長(zhǎng)控制有重要的作用，H19抑制胚胎胎盤(pán)生長(zhǎng)，在胚胎發(fā)育過(guò)程中調(diào)節(jié)印記基因[11]。然而它在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的角色，是致癌基因還是抑癌基因，依賴(lài)于腫瘤分型和細(xì)胞內(nèi)成分[12]。

其次，本研究證實(shí)lnc RNA H19表達(dá)上調(diào)者與低表達(dá)者比較，甲狀腺癌5年生存率減低，除此之外，腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等也被證實(shí)是影響甲狀腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有證據(jù)顯示H19在不同惡性腫瘤多種病理狀態(tài)下呈現(xiàn)高表達(dá)[13]，其表達(dá)上調(diào)表明了他的致癌屬性的可能性[14]。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)了H19在膀胱癌組織中高表達(dá)，揭示了H19表達(dá)與腫瘤尺寸及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)H19能夠促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，H19表達(dá)情況在膀胱癌組織中高于其旁非腫瘤組織[16]。更進(jìn)一步證實(shí)了H19在胃癌組織有高表達(dá)率，且與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移都是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素[17]。還有研究者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)促進(jìn)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)H19促進(jìn)乳腺癌腫瘤細(xì)胞侵襲性。Raveh等[18]研究發(fā)現(xiàn)H19在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，并證實(shí)H19在人類(lèi)惡性腫瘤中有促進(jìn)轉(zhuǎn)移的功能。p53是抑癌基因，能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。p53基因突變是人類(lèi)惡性腫瘤最常見(jiàn)的基因改變[19]，進(jìn)一步討論H19與p53的關(guān)系，他們的關(guān)聯(lián)可導(dǎo)致P53失活，另外在膀胱癌中，H19可正向調(diào)控microrna-675（miR-675）表達(dá)，抑制P53基因活化。研究者也進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)H19與miR-675在胃癌發(fā)展過(guò)程中的交互作用，指出H19在在所有乳腺癌細(xì)胞系中能夠減少泛素蛋白鏈接酶E3家族（c-Cbl和Cbl-b）的表達(dá)[20]。提示lncRNA H19在預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移方面有很好的預(yù)后判斷價(jià)值。

綜上所述，本研究提示，與良性甲狀腺組織和癌旁組織比較，甲狀腺組織中l(wèi)ncRNA H19的表達(dá)水平明顯增高，且lncRNA H19高表達(dá)的患者總體生存期變短。lncRNA H19表達(dá)是影響甲狀腺癌預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。這些結(jié)果表明lncRNA H19可能在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但由于受樣本量限制，其與甲狀腺癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性尚不明確，因此，對(duì)未來(lái)進(jìn)一步研究的期望，尚需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究論證，細(xì)化腫瘤分期，繼續(xù)進(jìn)行深入討論關(guān)于甲狀腺癌不同臨床病理特征的相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)。并對(duì)lncRNAH19表達(dá)情況做更進(jìn)一步遠(yuǎn)期生存率的觀察。研究lncRNAH19在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展所扮演的角色，期望發(fā)現(xiàn)一種新的甲狀腺癌早期診斷和預(yù)后判斷的方法。

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（收稿日期：2018-01-18 本文編輯：任 念）