非清髓預處理及人臍帶血造血干細胞移植對小鼠生精功能的影響

張萌　姚觀平　何方

[摘要] 目的 探討化療藥非清髓預處理與人臍帶血造血干細胞移植（HSCT）對小鼠生精功能的影響。 方法 將30只Balb/c小鼠按照隨機數(shù)字表法分為三組，每組10只，分別為對照組、白消安（BU）聯(lián)合環(huán)磷酰胺（CY）非清髓預處理（BU+CY）組、HSCT組。除對照組外，BU+CY組和HSCT組使用BU 10 mg/kg和CY 120 mg/kg預處理造成睪丸損傷，HSCT組進行人臍帶血HSCT。HSCT移植3周后，稱重法計算睪丸指數(shù)，進行小鼠精液質量常規(guī)分析及睪丸、附睪的病理組織學檢查。 結果 與對照組比較，BU+CY組小鼠睪丸指數(shù)、精子密度和精子活力均顯著降低，而精子畸形率升高（P < 0.01）。HSCT組小鼠移植物抗宿主?。℅VHD）評分較高，睪丸指數(shù)、精子密度和活力均高于BU+CY組（P < 0.05），精子畸形率低于BU+CY組（P < 0.01）。病理學檢查發(fā)現(xiàn)，BU+CY組小鼠睪丸體積較小，生精小管破壞明顯，生精細胞腫脹、排列紊亂，生精上皮變薄，生精小管與附睪管內精子數(shù)目大大減少；與BU+CY組比較，HSCT組睪丸體積增大，生精小管完整性較好，生精小管內精子數(shù)量較高，但生精上皮層數(shù)和精母細胞數(shù)量仍較少。 結論 BU+CY非清髓預處理可造成明顯睪丸損傷，輕度急性GVHD情況下，臍帶血HSCT可一定程度促進睪丸生精功能的恢復。

[關鍵詞] 白消安；環(huán)磷酰胺；臍帶血造血干細胞；睪丸損傷

[中圖分類號] R737.21 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（a）-0009-05

The effects of non-myeloablative conditioning and cord blood hematopoietic stem cells transplantation on spermatogenic function in mice

ZHANG Meng1* YAO Guanping2* HE Fang1 LI Yuxiang3 FAN Zhenhai1 YU Limei1

1.Key Laboratory of Cell Engineering in Guizhou Province， Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Guizhou Province， Zunyi 563000， China； 2.Human Reproductive Medicine Center， Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Guizhou Province， Zunyi 563000， China； 3.Department of Phylaxiology and Pediatric Dentistry， Hospital of Stomatology， Zunyi Medical University， Guizhou Province， Zunyi 563000， China

[Abstract] Objective To explore the effects of chemotherapeutic drugs non-myeloablative pretreatment and human cord blood hematopoietic stem cells transplantation （HSCT） on the spermatogenic function in mice. Methods Thirty Balb/c mice were divided into 3 groups by random digital table method， with 10 mice in each group， which contained control group， Busulfan （BU） combined with Cyclophosphamide （CY） non-myeloablative conditioning （BU+CY） group and HSCT group. In addition to the control group， BU+CY group and HSCT group were pretreated with BU 10 mg/kg and CY 120 mg/kg to induce testicular lesion， and HSCT group was taken human umbilical cord blood HSCT. After HSCT for three weeks， the testicular index was calculated by weighting method. The routine quality analysis of semen and histopathological examination of the testis and epididymis were carried out. Results Compared with the control group， the testicular index， sperm density and sperm viability in BU+CY group were significantly decreased， but the sperm malformation rate was significantly increased （P < 0.01）. The graft versus host disease （GVHD） score was higher in HSCT group. The testicular index， sperm density and sperm viability in HSCT group were higher than those in BU+CY group （P < 0.05）， while the sperm malformation rate was lower than that of BU+CY group （P < 0.01）. The pathological examination found that the testicular volume in BU+CY group was smaller， the seminiferous tubules were obviously impaired， the spermatogenic cells were swelled and arranged in disorder， the seminiferous epithelia was thinned， the number of sperm was significantly reduced in seminiferous tubule and epididymal tubule. Compared with the BU+CY group， the testicular volume in HSCT group was increased， the seminiferous tubule was more integrity， and the number of sperm was increased， but the number of layers seminiferous epithelia cells and spermatocyte were still less. Conclusion BU+CY non-myeloablative conditioning can cause obvious testis injury. Cord blood HSCT can promote a certain extent recovery of testicular spermatogenesis in mild acute GVDH mice.

[Key words] Busulfan； Cyclophosphamide； Cord blood hematopoietic stem cell； Testis injury

不孕不育的夫婦中，男性因素約占50%，且有60%～65%的男性不育為特發(fā)性，其中大部分被認為是由遺傳缺陷和表觀遺傳學異常所致[1]，也有相當一部分患者存在由藥物和環(huán)境等因素所致病。白血病、再生障礙性貧血等疾病治療中常用較大劑量白消安（Busulfan，BU）和環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CY）進行清髓或非清髓預處理，殺死大量腫瘤細胞，清除受者大量免疫細胞的同時，也會造成包括生殖器官在內的多種組織器官損傷[2]。單次腹腔注射較大劑量的CY或BU及二者聯(lián)用也是建立非梗阻性無精癥動物模型的常用方法[3]，一次性腹腔注射BU 10 mg/kg和CY 120 mg/kg，第4周小鼠出現(xiàn)睪丸生精小管內精子及精子細胞消失、睪丸指數(shù)下降，直至第12周產生間質纖維化和20周仍處于無精子狀態(tài)[4]。非清髓處理后進行異基因臍帶血造血干細胞移植（hematopoietic stem cells transplantation，HSCT），不但可明顯促進骨髓造血免疫功能恢復，同時對大劑量化療藥物所致多組織器官的損傷具有促進再生修復的作用[2，5，6]，也有少數(shù)患者2年內恢復生育能力的報道，更多的研究認為HSCT受者睪丸生精功能及其精子質量會受到慢性移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）嚴重程度的影響，從而與受者不育癥發(fā)生有關[7]，因此本研究在建立非清髓預處理致睪丸損傷的基礎上，主要觀察了臍帶血HSCT后急性GVHD內對雄性小鼠生精功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臍血標本 經(jīng)產婦或家屬知情同意，HBSAg、梅毒、HIV血清學檢測陰性者，無菌采集足月剖宮產新生兒臍血，200 U/mL肝素抗凝，4 h內密度梯度離心分離人臍帶血單個核細胞，流式檢測臍帶血CD34+造血干細胞含量0.4%～0.7%。

1.1.2 藥物 BU（Sigma公司，美國）和CY（江蘇恒瑞有限公司，0.2 g/瓶）均以生理鹽水溶解，分別配制為1%和0.2%的儲存液，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 動物 30只雄性Balb/c小鼠4～6周齡，體重18～22 g，購于解放軍陸軍軍醫(yī)大學，動物生產許可證號：SCXK（渝）2012-0005，動物批號：0000523。飼養(yǎng)于貴州省麻醉與器官保護基礎重點實驗室SPF級動物房，溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。按照中華人民共和國科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》飼養(yǎng)和處理動物標準。

1.2 方法

采用隨機數(shù)字表法將30只Balb/c小鼠分為三組，每組10只，分別為對照組、BU聯(lián)合CY非清髓預處理（BU+CY）組和HSCT組。除對照組給予等量生理鹽水外，其余兩組先連續(xù)灌胃給予BU混懸液16 mg/（kg·d），4 d，再連續(xù)3 d腹腔注射CY溶液150 mg/（kg·d），第8天HSCT組進行HSCT，小鼠尾靜脈移植臍帶血造血干細胞0.3 mL（臍帶血單個核細胞懸液5×106個細胞/只），對照組和BU+CY組尾靜脈注射等量磷酸鹽緩沖液（PBS）。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般狀況和急性GVHD評分 給予BU后的第28天，稱取小鼠體重，并密切觀察小鼠活動、精神狀態(tài)及皮毛疏密、光澤、飲食和存活情況，計算存活率，同時依照文獻[8]進行急性GVHD評分，通過體重、體位、活動能力、毛發(fā)、皮膚完整性5個指標，每項指標按正常、輕、中、重度改變評定為0、1、2分，總分不超過10分。

1.3.2 睪丸指數(shù) BU+CY預處理后第28天，麻醉后處死小鼠，稱體重、雙側睪丸（含附睪）重量，按公式計算，睪丸指數(shù)=雙側睪丸重量（mg）/體重（g）。

1.3.3 組織病理學檢查 留取兩側睪丸，肉眼觀察睪丸大小和外觀，取左側睪丸和附睪，經(jīng)4%多聚甲醛液固定后，送遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，HE染色，顯微鏡下觀察睪丸和附睪組織病理學變化。

1.3.4 精子檢查 參照文獻[9]的方法，將雙側附睪置于37℃、15 mL精子營養(yǎng)液的平皿中，剪碎附睪組織，靜置2 h，使精子充分游離、釋放出來，取5 μL精子懸液滴于精子計數(shù)板上，全自動精子分析儀（北昂醫(yī)療）檢測出精子密度、活力。另取0.5 μL精子懸液滴于Testsimpletes玻片上，油鏡下觀測精子形態(tài)，計數(shù)200個精子，計算精子畸形率。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BU+CY及HSCT對一般狀況和睪丸指數(shù)的影響

給予BU后第5天，除對照組外，其余兩組小鼠逐漸表現(xiàn)出精神萎靡、體毛稀疏、無光澤、食欲及體重下降；第28天，BU+CY組和HSCT組小鼠體重開始逐漸恢復，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。BU+CY組和HSCT組小鼠睪丸重量和睪丸指數(shù)均明顯低于對照組（P < 0.01），而HSCT組睪丸指數(shù)高于BU+CY組（P < 0.05），見表1。HSCT以后，動物發(fā)生較強烈的移植物抗宿主反應，導致HSCT組小鼠死亡，對照組、BU+CY組、HSCT組小鼠存活率依次為100%、100%和50%。

2.2 BU+CY及HSCT對精子質量的影響

BU+CY組的精子密度、精子活力均顯著低于對照組（P < 0.01），而精子畸形率均顯著高于對照組（P < 0.01），HSCT組的精子密度顯著低于對照組（P < 0.01），精子畸形率顯著高于對照組（P < 0.01），而精子活力與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；HSCT組的精子密度和精子活力明顯高于BU+CY組（P < 0.05），而精子畸形率明顯低于BU+CY組（P < 0.01），但HSCT組的精子密度與畸形率均未恢復到對照組水平（表2、圖1）。

2.3 BU+CY及HSCT對小鼠睪丸和附睪組織學變化的影響

肉眼可見，HSCT組小鼠睪丸體積較BU+CY組大，但小于對照組，睪丸表面光滑、飽滿、色較粉潤，而BU+CY組色較蒼白（圖2）。鏡下可見，對照組小鼠睪丸生精小管完整，各級生精細胞排列整齊，層次清晰，管腔內有大量精子，支持細胞形態(tài)、數(shù)量正常。BU+CY組睪丸組織中生精小管完整性遭破壞，生精細胞排列紊亂，細胞腫脹明顯，生精上皮層次減少雖不明顯，但次級精母細胞和精子極少，生精小管管腔內滲出物較多。HSCT組睪丸組織細胞腫脹明顯減輕，生精小管各層細胞雖數(shù)量較少，但已可見到少量次級精母細胞和精子，間質炎細胞浸潤增多（圖3）。三組附睪管官腔上皮細胞的組織學未見明顯差異，但對照組附睪管管腔內精子數(shù)量較多，而BU睪管官組和HSCT明顯較少（圖4）。

3 討論

化療藥物可引起短期的無精癥，并使殘存的生殖干細胞的分化存在較長的停滯期[9]，BU特異性地損傷生精干細胞和精原細胞，破壞精子產生，直接損害生精上皮，減少精子密度，減弱精子活性。CY則主要通過烷化作用，造成DNA損傷，而周期特異性地阻滯細胞增殖，產生生殖毒性，導致睪丸損傷，引起無精子癥或少精子癥，造成不育[10-12]。臨床研究證實，兒童期因白血病、實體腫瘤或自身免疫性疾病接受CY治療的男性患兒，成年后80.2%～92.6%為無精子癥或少精子癥，可導致不育或者出現(xiàn)子代遺傳性缺陷或畸形[13]。由此可見，非清髓預處理及異基因HSCT產生的睪丸生殖功能損傷，隨著異基因HSCT治療的逐漸增多，值得關注。

BU+CY非清髓預處理后，小鼠除一般狀態(tài)較差外，睪丸指數(shù)、精子密度、精子活力均顯著下降，而精子畸形率顯著增高，睪丸生精小管完整性受損，生精上皮排列紊亂、次級精母細胞和精子數(shù)量銳減，附睪管中精子數(shù)量明顯減少，表明BU+CY的處理，雖然滿足了HSCT的需要，但在一定時期內，對睪丸生精功能和附睪管中精子均造成了損傷，引起的少精癥、弱精癥和精子畸形與文獻報道相似[6]。

在BU+CY非清髓預處理基礎上移植臍帶血造血干細胞后，睪丸指數(shù)、精子密度和活力明顯增高，精子畸形率降低，睪丸組織的病理改變也得到一定改善，生精小管結構完整性較好，次級精母細胞和精子數(shù)量有所增加，但仍低于正常對照水平，表明HSCT后，在小鼠急性GVHD較輕的情況下，受損的骨髓造血免疫功能和外周血血象短期內得到明顯恢復的同時[14-15]，還可減輕非清髓化療藥物處理造成的睪丸損傷或促進損傷的修復，一定程度上改善睪丸的生精功能，但是HSCT治療3周，睪丸的生精功能遠不及正常對照，HSCT組的病理結果與文獻報道相似[12，16]，表現(xiàn)出受鼠睪丸組織中存在明顯的睪丸生殖和支持細胞的不足，從HSCT組小鼠高達50%的死亡率及存活小鼠GVHD評分來看[15]，HSCT后不同程度的GVHD可能也一定程度地影響了小鼠的生精功能。

小鼠的生精周期為36 d左右，盡管HSCT組睪丸生精功能得到了一定改善，但精子進入附睪及其發(fā)育成熟、活化尚未全部完成，而病理結果顯示BU+CY和HSCT對附睪組織結構沒有明顯影響，但二者對精子活力及畸形率的改變，提示BU+CY可能對附睪管的功能有一定抑制，而HSCT一定程度提高了附睪管的功能。

此外，精子質量受到睪丸支持細胞、生精細胞與睪丸間質細胞相互作用、性激素及其受體活化、微環(huán)境細胞因子變化等多環(huán)節(jié)、多因素的影響[17]，且異基因HSCT后，嚴重的慢性GVHD也和受者的不育密切相關，因此非清髓預處理基礎上HSCT對睪丸損傷保護作用的機制還需要進一步探討，針對靶點，選擇既可提高HSCT效果，又能減輕急性GVHD，同時可治療不育癥、減輕精子損傷或調節(jié)垂體-睪丸內分泌軸作用的藥物或干細胞[17-19]，干預非清髓處理后HSCT受者的生精功能，可能是最為理想的策略。

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（收稿日期：2018-01-25 本文編輯：張瑜杰）