帕金森病模型大鼠腦組織SPTLC2的表達(dá)研究

何曉燕　焦燕　李紅燕

[摘要] 目的 探究絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶長(zhǎng)鏈亞基2（SPTLC2）在帕金森病大鼠腦組織中的表達(dá)。 方法 采用注射6-羥基多巴胺制備帕金森病大鼠模型，將模型組分為三組：模型組（2周）、模型組（4周）、模型組（8周），同時(shí)設(shè)置正常組，采用異常不自主動(dòng)作（AIM）評(píng)分法評(píng)定各組大鼠行為，同時(shí)記錄旋轉(zhuǎn)持續(xù)時(shí)間、啟動(dòng)時(shí)間、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。HE染色法觀察大鼠腦組織變化，免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織中α突觸核蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法測(cè)定大鼠腦組織中SPTLC2 mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)大鼠腦組織中SPTLC2蛋白表達(dá)。 結(jié)果 模型組大鼠AIM評(píng)分、旋轉(zhuǎn)持續(xù)時(shí)間、啟動(dòng)時(shí)間、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均高于正常組，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，AIM評(píng)分、旋轉(zhuǎn)啟動(dòng)時(shí)間、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)逐漸升高，旋轉(zhuǎn)啟動(dòng)時(shí)間逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。免疫組化染色顯示，正常組α突觸核蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸升高。與正常組、模型組（2周）相比，模型組（4周）、模型組（8周）SPTLC2基因、蛋白表達(dá)量均升高；與模型組（4周）相比，模型組（8周）SPTLC2基因、蛋白表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 SPTLC2可能參與帕金森病疾病的發(fā)生，通過(guò)上調(diào)SPTLC2基因、蛋白水平的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

[關(guān)鍵詞] 帕金森病；絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶長(zhǎng)鏈亞基2；腦組織；模型

[中圖分類號(hào)] R742.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）05（a）-0021-04

Study on SPTLC2 expression level in brain tissue in the rat model of Parkinson disease

HE Xiaoyan JIAO Yan LI Hongyan

Department of Neurology， People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830001， China

[Abstract] Objective To explore the expression of serine palmitate transferase long chain subunit 2 （SPTLC2） in brain tissue in the rat model of Parkinson disease. Methods Parkinson rat model was prepared by injecting 6-hydroxy dopamine， and the rats were divided into three groups， 2-week model group， 4-week model group， 8-week model group， and normal group. Behaviors of rats in each group were assessed by using abnormal involuntary movement （AIM） scoring method. Rotation duration， starting time， the cycle number of agent peak were recorded meanwhile. HE staining method was used to observe the changes of brain tissue in rats， and the expression of α synuclein in rat brain tissue was detected by immunohistochemistry， and SPTLC2 and mRNA expression in brain tissue of rats was detected by using RT-PCR， and SPTLC2 protein expression in rat brain tissue was detected by Western blot. Results AIM score， rotation duration， starting time， agent peak rotation number in model group was higher than those in the normal group， and with the extension of time， AIM score， rotating start time， agent peak rotation number gradually increased， while the rotation starting time gradually decreased， with statistically significant differences （P < 0.05）. Immunohistochemical staining showed that the number of positive cells in the normal group was less than that in the normal group， and the number of positive cells in the model group increased significantly. The number of positive cells increased gradually with the extension of time. Compared with those in the normal group and 2-week model group， SPTLC2 gene and protein expression in 4-week and 8-week model group increased， and compared with 4-week model group， SPTLC2 gene and protein expression in 8-week model group increased， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion SPTLC2 may be involved in the pathogenesis of Parkinson disease， via up-regulating SPTLC2 gene and protein expression.

[Key words] Parkinson disease； Serine palmitate transferase long chain subunit 2； Brain tissue； Model

帕金森病屬于臨床神經(jīng)系統(tǒng)疾病，調(diào)查顯示在我國(guó)發(fā)病率為1%～2%，近年來(lái)發(fā)病率逐年上升，患者認(rèn)知、精神、行為、感覺(jué)出現(xiàn)障礙，給家庭社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)，因此對(duì)帕金森病的研究十分必要[1]。最近研究顯示，絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶長(zhǎng)鏈亞基2（serine palmitoy ltransferase long chain base subunit 2，SPTLC2）在神經(jīng)病變調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，SPTLC2基因發(fā)生突變后導(dǎo)致軸突神經(jīng)病變，喪失感覺(jué)[2]，以往對(duì)帕金森病病變機(jī)制探究較多[3]，但鮮見(jiàn)對(duì)其與SPTLC2基因間的關(guān)系進(jìn)行探究。本研究通過(guò)制備帕金森病大鼠模型，采用不同生物學(xué)方法檢測(cè)腦組織中SPTLC2水平，旨在探究SPTLC2是否參與帕金森病發(fā)病過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SD大鼠26只（北京生命科學(xué)研究所，許可證號(hào)：SYXK2016-0012），均為SPF級(jí)動(dòng)物，雄性。所有動(dòng)物均在統(tǒng)一環(huán)境中進(jìn)行飼養(yǎng)，溫度控制在（23±2）℃，濕度65%，自動(dòng)光照控制（7：00～19：00照明），飼養(yǎng)時(shí)嚴(yán)格按照動(dòng)物管理規(guī)則執(zhí)行。

1.2 試劑與儀器

水合氯醛（北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：305-17-6）；6-羥基多巴胺購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：162843；SYBR PCR Master Mix購(gòu)自于日本Takara公司，批號(hào)：170219；兔抗大鼠α-synuclein蛋白、SPTLC2單克隆抗體一抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自于美國(guó)Santa cruz公司，批號(hào)：161106、170826、170524；RNA提取試劑盒購(gòu)自于北京生化科技有限公司，批號(hào)：213506；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自于日本Takara公司批號(hào)：170523；BCA測(cè)定試劑盒購(gòu)自于上海碧云天生物科技有限公司，批號(hào)：170628；PVDF膜購(gòu)自于美國(guó)Millpore公司批號(hào)：171021；380R高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自于德國(guó)Hettich公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自于上海光學(xué)儀器廠；熒光定量PCR儀購(gòu)自于美國(guó)BioRed公司。

1.3 方法

1.3.1 帕金森病大鼠模型制備 取20只大鼠進(jìn)行模型制備采用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，將大鼠固定于定位儀上，進(jìn)行頭部去毛，常規(guī)消毒，切開(kāi)顱骨皮膚，剝離骨膜，使前囟暴露，用顱骨鉆鉆開(kāi)顱骨，將6-羥基多巴胺用微量注射器注入黑質(zhì)部，注射速率為1 mm/min，注射結(jié)束后醫(yī)用海綿填塞顱骨孔，縫合切口。

1.3.2 大鼠行為評(píng)定 采用異常不自主動(dòng)作（abnormal involuntary movement，AIM）[4]評(píng)分法進(jìn)行評(píng)定，設(shè)計(jì)前肢、口面部、軸性及運(yùn)動(dòng)4部分，根據(jù)情況嚴(yán)重程度分為5個(gè)等級(jí)：無(wú)，0分；偶爾出現(xiàn)，1分；經(jīng)常出現(xiàn)，2分；持續(xù)存在，刺激后可停止，3分；持續(xù)存在，刺激后也無(wú)法停止，4分。同時(shí)記錄旋轉(zhuǎn)持續(xù)時(shí)間、啟動(dòng)時(shí)間、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。

1.3.3 HE染色 分別于2、4、8周取6只大鼠處死后，取腦組織放入4%多聚甲醛中進(jìn)行固定，常規(guī)制備石蠟切片，在70℃烤片機(jī)上加熱10 min，在二甲苯中進(jìn)行2次脫蠟，每次10 min，在100%、95%、80%乙醇中分別脫水5 min，蒸餾水、磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后，加入蘇木精進(jìn)行染色10 min，浸入1%鹽酸后用蒸餾水進(jìn)行沖洗。加入伊紅染液均染色3 min，依次在75%、85%、95%、100%中脫水2 min，加入二甲苯進(jìn)行透明處理，滴加中性樹(shù)脂進(jìn)行封片，將切片放置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.4 免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織中α突觸核蛋白的表達(dá) 將制備好的石蠟切片置于3%雙氧水-甲醇溶液中10 min，PBE溶液漂洗3次，95℃加熱10 min，蒸餾水沖洗后晾干，滴加α-突觸核蛋白一抗，置于4℃冰箱中過(guò)夜孵育，PBS清洗后晾干，加入HRP標(biāo)記鏈霉素亂掰素溶液，室溫下孵育10 min，PBS漂洗后，滴加50 μL DAB顯色鮮室溫下染色2 min，蒸餾水沖洗后加入蘇木精復(fù)染，自來(lái)水沖洗后加入0.1%鹽水酒精溶液中浸泡1 min，在75%、85%、95%、100%梯度酒精中脫水2 min，加入二甲苯進(jìn)行透明處理，滴加中性樹(shù)脂進(jìn)行封片，將切片放置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.5 RT-PCR法測(cè)定大鼠腦組織中SPTLC2 mRNA表達(dá) 將腦組織在PBS緩沖液中清洗后用無(wú)菌剪刀剪碎后，提取組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR引物由廣州Invitrogen公司合成。SPTLC2序列，F(xiàn)：GT？鄄ACGCCACGTCAATGTCAC；R：CAGCATCTCTCTCCC？鄄AAAGG。GAPDH序列，F(xiàn)：CTCATGACCACAGTCCAT？鄄GC；R：TTCAGCTCTGGGATGACCTT。反應(yīng)體系：2×SYBR Mix10 μL；1cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，H2O 8 μL。在PCR儀上設(shè)置95℃ 2 min、95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)后在CFX manager 3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以GADPH作為內(nèi)參基因按照2-ΔΔCt算法進(jìn)行基因相對(duì)定量表達(dá)分析。

1.3.6 Western blot檢測(cè)大鼠腦組織中SPTLC2蛋白表達(dá) 將腦組織剪碎后加入蛋白裂解液在冰上反應(yīng)30 min，3000 r/min離心10 min收集上清液，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，制備8%分離膠、12.5%濃縮膠，蛋白上樣量統(tǒng)一為30 μg，當(dāng)樣品進(jìn)濃縮膠后電壓設(shè)置為80 V，進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)整為120 V，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白凝膠至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜反應(yīng)在冰上進(jìn)行，電壓設(shè)置為100 V，反應(yīng)時(shí)間為1 h，加入TBST溶液進(jìn)行清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗PVDF膜，加入一抗稀釋液（SPTLC2），4℃震蕩過(guò)夜，加入PBST溶液清洗3次，每次10 min，加入二抗稀釋液，室溫下孵育2 h，PBST清洗后在凝膠成像儀中觀察蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間對(duì)比采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠行為評(píng)定結(jié)果

模型組大鼠AIM評(píng)分、旋轉(zhuǎn)持續(xù)時(shí)間、啟動(dòng)時(shí)間、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均高于正常組，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，AIM評(píng)分、旋轉(zhuǎn)啟動(dòng)時(shí)間、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)逐漸升高，旋轉(zhuǎn)啟動(dòng)時(shí)間逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 大鼠腦組織HE染色及α突觸核蛋白的表達(dá)

腦組織HE染色顯示正常組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞染色呈橢圓形、圓形，細(xì)胞核染色較均勻呈藍(lán)紫色數(shù)量較多，模型組神經(jīng)元細(xì)胞較小，顏色較淺，數(shù)量有所降低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量逐漸降低，模型組2周神經(jīng)元細(xì)胞與正常組相比并無(wú)明顯差異。免疫組化染色顯示陽(yáng)性細(xì)胞染色呈棕褐色，大部分細(xì)胞位于細(xì)胞核中，正常組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸升高。見(jiàn)圖1（封三）。

2.3 腦組織中SPTLC2基因、蛋白表達(dá)

與正常組、模型組（2周）比較，模型組（4周）、模型組（8周）SPTLC2基因、蛋白表達(dá)量均升高，與模型組（4周）比較，模型組（8周）SPTLC2基因、蛋白表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。正常組與模型組（2周）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖2。

3 討論

目前學(xué)者對(duì)帕金森病病變機(jī)制的研究主要包括以下幾方面：①機(jī)體內(nèi)活性氧集團(tuán)數(shù)量過(guò)多產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞死亡，且腦組織對(duì)此反應(yīng)更敏感；②居住環(huán)境中存在較多工業(yè)化學(xué)物質(zhì)能夠毒害神經(jīng)，使神經(jīng)元死亡；③線粒體功能異常，使機(jī)體細(xì)胞內(nèi)能量生成出現(xiàn)障礙以及自由基水平升高，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡；④隨著年齡增長(zhǎng)，神經(jīng)系統(tǒng)老化，多巴胺脫梭酶以及酪氨酸羥化酶活力較弱，神經(jīng)元出現(xiàn)退變；⑤具有家族遺傳史，可能為顯性遺傳病變[5-6]。

本研究參考國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)制備帕金森病大鼠模型[7]，采用單點(diǎn)法注射6-羥基多巴胺注射后。有關(guān)研究表明，在制備模型后，腦組織中黑質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元會(huì)逐漸發(fā)生凋亡，神經(jīng)元數(shù)量降低，突觸后膜多巴胺受體敏感性增強(qiáng)，導(dǎo)致?lián)p傷側(cè)多巴胺受體過(guò)度興奮動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生偏向健側(cè)的旋轉(zhuǎn)[8]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠AIM評(píng)分、旋轉(zhuǎn)持續(xù)時(shí)間、啟動(dòng)時(shí)間、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均高于正常組，表明在注射6-羥基多巴胺后能夠影響動(dòng)物行為變化，發(fā)生旋轉(zhuǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)也逐漸增加，與2、4周相比具有明顯的差異性，表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠腦部受傷越嚴(yán)重，這與國(guó)外相關(guān)研究相符[9]。

α突觸核蛋白由酸性氨基酸組成，親水性較高，在黑質(zhì)、海馬、皮質(zhì)等與記憶相關(guān)區(qū)域均表達(dá)，參與神經(jīng)元的發(fā)育以及神經(jīng)退變。國(guó)外報(bào)道顯示α突觸核蛋白能夠與多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合形成蛋白復(fù)合體，參與調(diào)控多巴胺的合成，機(jī)體內(nèi)α突觸核蛋白由異常增多導(dǎo)致其調(diào)控功能降低，進(jìn)而使突觸中多巴胺水平升高，使氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，細(xì)胞毒性增強(qiáng)[10]。有學(xué)者研究顯示，α突觸核蛋白在神經(jīng)細(xì)胞胞漿中常與tau蛋白結(jié)合形成神經(jīng)纖維纏結(jié)淀粉樣斑塊，染色后可出現(xiàn)棕黑色沉淀[11]。本研究大鼠腦組織HE染色顯示，正常組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞染色呈橢圓形、圓形，細(xì)胞核染色較均勻呈藍(lán)紫色數(shù)量較多，模型組神經(jīng)元細(xì)胞較小，顏色較淺，數(shù)量有所降低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量逐漸降低，提示帕金森病模型大鼠腦部受損后能夠?qū)е律窠?jīng)元數(shù)量降低，免疫組化染色顯示，正常組α突觸核蛋白陽(yáng)性數(shù)量較少，模型組陽(yáng)性數(shù)量明顯增多，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸升高，提示帕金森病動(dòng)物模型隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，α突觸核蛋白表達(dá)量升高，腦部受損嚴(yán)重導(dǎo)致病情加重。

SPT是神經(jīng)酰胺從頭合成關(guān)鍵酶，SPTLC2屬于其中一個(gè)亞基，在神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡中發(fā)揮重要作用[12]。相關(guān)學(xué)者研究顯示SPTLC2雜合子小鼠中，鞘磷脂、神經(jīng)酰胺的合成能力增加，細(xì)胞膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用增強(qiáng)，血清中脂蛋白水平升高，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[13]。還有研究顯示SPTLC2基因突變后能夠引發(fā)周圍神經(jīng)突變，導(dǎo)致神經(jīng)感覺(jué)喪失，如引發(fā)自主神經(jīng)病變Ⅰ型[14]。國(guó)外學(xué)者研究顯示SPTLC2基因缺失型小鼠神經(jīng)酰胺以及鞘磷脂含量明顯降低，胰島素敏感性增強(qiáng)，能夠有效抑制肥胖以及胰島素抵抗[15]。國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)研究顯示，通過(guò)過(guò)表達(dá)SPTLC2基因，能夠提高神經(jīng)酰胺含量，促進(jìn)細(xì)胞自噬、凋亡[16]。本研究通過(guò)不同檢測(cè)方法顯示，與正常組、模型組（2周）相比，模型組（4周）、模型組（8周）SPTLC2基因、蛋白表達(dá)量均升高，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，含量逐漸上升，表明SPTLC2基因、蛋白含量升高，能夠引起帕金森病大鼠疾病的加重，提示其可能參與神經(jīng)病變的調(diào)控，但具體的機(jī)制還有待后續(xù)研究。

本研究也存在一定的局限性，注射的6-羥基多巴胺濃度梯度選取較少，后期需要設(shè)置不同梯度的6-羥基多巴胺進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，此外并未對(duì)SPTLC2基因影響神經(jīng)病變的機(jī)制進(jìn)行深入研究，僅比較表達(dá)水平的差異，后期還需深入探究。總之，SPTLC2可能參與帕金森病疾病的發(fā)生，并通過(guò)上調(diào)SPTLC2基因、蛋白水平的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

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（收稿日期：2017-10-07 本文編輯：張瑜杰）