黃芩素對喉癌細(xì)胞周期、凋亡率及細(xì)胞核DNA的影響

孫吉鳳　劉劍凱

【摘要】 目的：探索黃芩素（baicalein，BAI）對喉癌細(xì)胞周期、凋亡率及細(xì)胞核DNA的影響。方法：體外培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞，加入不同濃度的BAI，藥物作用后，用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況；用流式細(xì)胞術(shù)檢測對細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率的影響；用DNA瓊脂糖凝膠電泳法檢測對凋亡細(xì)胞核DNA的影響。結(jié)果：MTT法檢測到BAI（10、20、40、80 μmol/L）可明顯抑制Hep-2細(xì)胞的增殖，呈時間-劑量依賴性（P<0.05）；FCM法檢測到BAI（40 μmol/L）可誘使細(xì)胞阻滯在S期，凋亡率升高（P<0.05）；BAI（40、80 μmol/L）可誘使細(xì)胞核DNA形成“梯狀”條帶；呈時間-劑量依賴性（P<0.05）。結(jié)論：一定濃度的BAI，可抑制人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯在S期，細(xì)胞凋亡率升高，晚期凋亡細(xì)胞核DNA斷裂形成DNA Ladder。

【關(guān)鍵詞】 黃芩素； 喉癌； 細(xì)胞周期； 凋亡率

Effect of Baicalein on Cell Cycle，Apoptosis Rate，DNA of Apoptotic Cells in Laryngeal Cancer Cells/SUN Jifeng，LIU Jiankai.//Medical Innovation of China，2018，15（16）：0-016

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Baicalein（BAI） on cell cycle，apoptosis rate，DNA of apoptotic cells in laryngealcancer cells.Method：Hep-2 cells were exposed to BAI at various concentrations respectively，in vitro.MTT assay was used to determine cell proliferation；flow cytometry were used to analyze cell cycle and apoptosis rate；the effect on the DNA was detected by agarose gel electrophoresis.Result：MTT assay showed that the proliferation of Hep-2 cells were significantly inhibited by BAI（10，20，40 and 80 μmol/L），in a time and dose dependent manner（P<0.05）.Hep-2 cells are arrested at the S phase and the apoptosis rate was significantly increased by BAI（40 μmol/L）through flow cytometry（P<0.05）.DNA ladder in Hep-2 cells was induced by BAI（40，80 μmol/L）.Conclusion：BAI can inhibite proliferation of Hep-2 cells，increase the apoptosis rate，induce Hep-2 cells in S phase and late apoptotic cells DNA broken into DNA Ladder.

【Key words】 Baicalein； Laryngeal cancer； Cell cycle； Apoptosis rate

First-authors address：Changchun Medicial College，Changchun 130031，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.16.004

喉癌是喉部最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率目前有明顯增高趨勢[1-7]。隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)等相關(guān)生命學(xué)科的迅猛發(fā)展，正在逐步揭示惡性腫瘤的本質(zhì)，同時抗腫瘤藥物研究也進(jìn)入了一個新階段。尋找有效的防癌、抗癌藥物一直是腫瘤防治研究的一個重要方面。

黃芩素（baicalein，BAI）是我國傳統(tǒng)中藥黃芩的主要的有效成分，屬于黃酮類化合物，具有抑菌、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基和降血脂等多種藥理作用[8-10]。近年來發(fā)現(xiàn)黃芩素可能是一種潛在的新型的植物抗腫瘤藥物。已有研究表明，黃芩素在體外對于腫瘤細(xì)胞系具有抑制作用，而對正常組織細(xì)胞幾無毒性[11-14]。本實驗中，不同濃度黃芩素對人喉癌Hep-2細(xì)胞周期時相、凋亡率、凋亡細(xì)胞DNA影響展開研究，從而為進(jìn)一步闡明黃芩素的抗喉癌機(jī)制及臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品 BAI購自美國SIGMA公司，用DMSO溶解后置于-20 ℃冰箱保存，實驗時稀釋至所需濃度。四甲基偶氮唑鹽（MTT）、碘化丙啶（PI）、二甲基亞砜（DMSO）購于北京鼎國生物技術(shù)公司。人喉癌Hep-2細(xì)胞購自上海細(xì)胞生物研究所。RPMI1640培養(yǎng)基購于Gibco/BRL公司。DNA Ladder抽提試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 喉癌細(xì)胞株Hep-2于含5%胎牛血清FBS、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)傳代，24～48 h傳代一次，傳代濃度為5×105個/mL。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率 收集對數(shù)期生長的Hep-2細(xì)胞，調(diào)整為細(xì)胞濃度5×104個/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加200 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，同步化培養(yǎng)24 h，再加入終濃度分別為10、20、40、80 μmol/L的BAI繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置陰性對照組，只加入溶劑DMSO；設(shè)置空白對照組，只加入培養(yǎng)液。每組設(shè)5個復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2孵箱中，分別培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入

20 μL MTT，孵育4 h，棄上清，加入150 μL DMSO，輕輕振蕩10 min，待藍(lán)紫色結(jié)晶物完全溶解后，利用酶標(biāo)儀，在570 nm波長處檢測各孔OD值計算藥物對細(xì)胞增殖的抑制率[15]。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡 收集對數(shù)期生長的Hep-2細(xì)胞以1×106個/mL細(xì)胞數(shù)接種于培養(yǎng)瓶中，按照上述細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，并加入終濃度為40 μmol/L BAI，設(shè)5個平行樣，同時設(shè)置陰性對照組。分別培養(yǎng)24、48 h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次后，以冷的70%乙醇固定，4 ℃條件下固定過夜，用PI溶液避光染色30 min，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡情況，通過Modifit LT軟件進(jìn)行分析處理。

1.5 DNA Ladder檢測 取對數(shù)生長期的Hep-2細(xì)胞，上述細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，并分別加入終濃度為40、80 μmol/L BAI，設(shè)5個平行樣，同時設(shè)置陰性對照組。分別培養(yǎng)24、48 h后，收集細(xì)胞于Eppendorf管中，用PBS洗滌3次后，采用DNA- Ladder抽提試劑盒提取DNA，取5 μL DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（75 V，60 min），EB染色后，凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)用（x±s）表示，采用方差分析進(jìn)行重復(fù)測量的計量資料分析，其他資料用單因素方差分析或t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BAI對Hep-2細(xì)胞增殖的抑制率 BAI（10、20、40、80 μmol/L）作用24 h后，各濃度的抑制率分別從（8.23±0.05）%增加到（86.54±0.04）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；作用48 h后，各濃度的抑制率分別為（14.52±0.11）%增加到（96.43±0.02）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；見表1和圖1。BAI對喉癌Hep-2細(xì)胞增殖具有抑制作用，且抑制率呈劑量-時間依賴性（P<0.05）。其中40 μmol/L BAI作用24、48 h，對Hep-2細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（53.85±0.07）%和（69.85±0.03）%，為后期研究提供參考濃度和作用時間。

2.2 BAI對Hep-2細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，終濃度為40 μmol/L BAI作用于Hep-2細(xì)胞24 h后，S期細(xì)胞比例較陰性對照組明顯增多，說明BAI誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞阻滯在S期；48 h作用后，也表現(xiàn)出相同的影響趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。此外，終濃度為40 μmol/L BAI作用24 h后細(xì)胞凋亡率較陰性對照組顯著升高；48 h作用后，也表現(xiàn)出相同的影響趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2和表2。

2.3 BAI對Hep-2細(xì)胞凋亡后DNA的影響 陰性對照組僅存在一條50 kb以上的大片段基因組DNA，40、80 μmol/L BAI作用后，可見典型的小片段的DNA梯帶，即DNA Ladder。80 μmol/L作用后的DNA Ladder條帶比40 μmol/L作用后條帶亮度更高（P<0.05）。但是24 h作用后與48 h作用后比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。說明BAI可以誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞核DNA斷裂，形成DNA Ladder，呈劑量依賴性。見圖3。

3 討論

研究結(jié)果表明，BAI（10～80 μmol/L）作用于Hep-2細(xì)胞后，對細(xì)胞增殖的抑制率最高可達(dá)（96.43±0.02）%，呈時間-劑量依賴性（P<0.05），這結(jié)果與前期所完成研究成果趨勢相同[15]。說明BAI可以抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖。其中，40 μmol/L BAI作用24 h后，對Hep-2細(xì)胞的抑制為（53.85±0.07）%，這為后續(xù)研究提供了有效濃度參考。

本研究進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測BAI對喉癌Hep-2細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用及對細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果表明，終濃度為40 μmol/L BAI，一方面可誘使大量的喉癌Hep-2細(xì)胞阻滯在S期。另一方面，可以誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡率顯著升高。研究表明，在細(xì)胞凋亡晚期，細(xì)胞內(nèi)依賴Ca2+的核酸內(nèi)切酶被激活，高分子量DNA減少，核內(nèi)基因組DNA被水解斷裂，斷裂發(fā)生在核小體之間，產(chǎn)生長度為180～200 bp及其整倍數(shù)的DNA片段（DNA Ladder），這種現(xiàn)象是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志之一，而壞死細(xì)胞不具有此特征。雖然并非所有細(xì)胞凋亡均出現(xiàn)該特征，但出現(xiàn)該特征的一定是凋亡細(xì)胞。利用這一特征，可以證明存在大量細(xì)胞凋亡[16-21]。結(jié)合本研究中，BAI作用后可見典型的DNA Ladder，以及上述流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果，說明了BAI可誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡，呈時間-劑量依賴性（P<0.01）。

綜上所述，BAI可抑制人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖；使細(xì)胞周期阻滯在S期，誘發(fā)Hep-2細(xì)胞凋亡率升高；BAI誘使得凋亡晚期細(xì)胞的核DNA被剪切為DNA Ladder，進(jìn)而啟動后續(xù)的細(xì)胞凋亡信號，誘使人喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗癌作用。這些研究成果是對BAI抗癌特性的突破性認(rèn)識，拓展了對BAI抗癌機(jī)制的研究，并對進(jìn)一步研究BAI誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制指明了方向，如與細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]李玉軍.全喉切除術(shù)與喉部分切除術(shù)治療喉癌的效果分析[J].中國實用醫(yī)刊，2017，30（4）：556-557.

[2]于振坤，張慶翔，龔單春，等.早期喉癌的治療選擇[J].臨床誤診誤治，2014，27（9）：6-8.

[3]胡小琴，吳可明，鄭國峰.老年喉癌患者手術(shù)治療的遠(yuǎn)期療效及預(yù)后的影響因素[J].中國老年學(xué)雜志，2017，37（12）：2972-2974.

[4]龔虹云，宋啟斌，胡偉國，等.首選化放療或手術(shù)治療喉癌療效的系統(tǒng)評價[J].循證醫(yī)學(xué)，2014，14（4）：229-233.

[5]張亞娜.喉部分切除術(shù)與全喉切除術(shù)治療晚期喉癌的Meta分析[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2017.

[6]謝芳.236例喉癌患者手術(shù)治療生存效果分析[D].上海：上海交通大學(xué)，2014.

[7]馬士崟，王曉敏，韓躍峰，等.381例喉癌保留喉功能的手術(shù)治療[J].中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志，2016，24（5）：347-352.

[8]田碩，洪濤，張多，等.黃芩素的藥理作用及分子機(jī)制的最新研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥，2015，28（6）：1195-1199.

[9]肖靈芝.中藥黃芩的藥理和應(yīng)用[J].中醫(yī)臨床研究，2014，6（3）：133-134.

[10]鄭勇鳳，王佳婧，傅超美，等.黃芩的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].中成藥，2016，38（1）：141-147.

[11] Ma G Z，Liu C H，Wei B，et al.Baicalein inhibits DMBA/TPA-induced skin tumorigenesis in mice by modulating proliferation，apoptosis，and inflammation[J].Inflammation，2013，36（2）：457-467.

[12]劉梅，曲樂，尹新江，等.黃芩素聯(lián)合阿維A酸對皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞SCL-12 凋亡Caspa-ses的影響[J].中國免疫學(xué)雜志，2014，30（3）：353-356.

[13]孫吉鳳，劉詩音，宋英明.黃芩素抗腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2015，22（14）：24-26.

[14]張淑群，高曉燕，薛興歡，等.黃芩素對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株SATB1表達(dá)的影響[J].中國腫瘤臨床，2014，41（6）：355-358.

[15]孫吉鳳，劉劍凱，張淑芳.黃芩素對喉癌Hep-2細(xì)胞增殖的抑制作用[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，12（21）：4-6.

[16]萬書麗，龐鑫，東野廣智，等.不同劑量地塞米松對小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，33（1）：35-44.

[17] Suman S，Pandey A，Chandna S.An improved non-enzymatic“DNA ladder assay”for more sensitive and early detection of apoptosis[J].Cytotechnology，2012，64（1）：9-14.

[18] Zhang N，Wang W，Li W，et al.Inhibition of 11β-HSD2 expression by triclosan via induction of apoptosis in human placentalsyncytiotrophoblasts[J].Clin Endocrinol Metab，2015，100（4）：E542-E549.

[19]李敏，林俊.細(xì)胞凋亡途徑及其機(jī)制[J].國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2014，41（2）：103-107.

[20]郭茜茜，于廣，吳丹丹，等.細(xì)胞凋亡率檢測方法的探索[J].免疫學(xué)雜志，2015，35（5）：425-429.

[21]周國運，王熙，曹干生，等.雙氫青蒿素對肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用[J].中國老年學(xué)雜志，2017，37（8）：1874-1876.

（收稿日期：2018-02-07） （本文編輯：張帥）