微流控芯片上循環(huán)腫瘤細(xì)胞高效率分選研究

申少斐， 齊永紅， 張 璇， 寇麗莎， 王德富， 牛顏冰*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西省果業(yè)工作站，山西太原 030001)

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的重大疾病之一。90%以上的腫瘤患者由于早期階段不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移而錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)，最終導(dǎo)致死亡[1 - 2]。腫瘤轉(zhuǎn)移是指具有轉(zhuǎn)移潛能的惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位，經(jīng)淋巴管、血管或體腔等途徑，到達(dá)其它部位繼續(xù)生長的過程[3 - 4]。傳統(tǒng)觀念將惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移視為晚期事件，但近些年的研究認(rèn)為其為早期事件[3]。因此，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的早期檢測對(duì)腫瘤治療和預(yù)后尤為重要，也是當(dāng)前腫瘤患者的迫切期望。然而傳統(tǒng)的活體組織檢測不能在早期階段及時(shí)準(zhǔn)確的預(yù)判腫瘤轉(zhuǎn)移[5 - 6]，因此，需要研究更為精準(zhǔn)的檢測技術(shù)來獲得腫瘤轉(zhuǎn)移的訊息。

近來，已證實(shí)外周血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cell，CTC)在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用,其數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化與腫瘤患者的臨床分期、腫瘤分化程度及預(yù)后密切相關(guān)[7 - 8]。將外周血中CTC表達(dá)水平作為腫瘤的“液體活檢”指標(biāo)，不僅有助于預(yù)判腫瘤細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)移，便于及時(shí)治療，減少死亡發(fā)生；而且對(duì)惡性腫瘤的病情檢測、治療和預(yù)后等具有重要意義。然而常規(guī)的影像學(xué)、病理學(xué)和血清學(xué)等技術(shù)很難檢測到CTC，其主要瓶頸在于外周血中CTC含量極低，每10億個(gè)血液細(xì)胞中可能僅含有1～100個(gè)CTC[4 - 8]。所以，對(duì)其進(jìn)行提前分選是必不可少的步驟。

近些年，微流控芯片技術(shù)已在生命分析研究中廣泛應(yīng)用，其精確操控細(xì)胞的特點(diǎn)為CTC分選提供了新的有力工具[9 - 10]。目前分選技術(shù)主要分為兩大類：主動(dòng)式分選技術(shù)和被動(dòng)式分選技術(shù)[10]。主動(dòng)式分選技術(shù)是指對(duì)分選對(duì)象提供額外的力場來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選，具體分為電場分選[14]、磁場分選[15]、聲波分選[8,16]和光分選[17]等。主動(dòng)式分選技術(shù)靈敏度高，穩(wěn)定性好，但同時(shí)伴隨著設(shè)備昂貴、操作難度大、芯片制作復(fù)雜、樣品處理通量低和容易對(duì)生物樣品產(chǎn)生傷害等缺點(diǎn)。不同于依賴外場作用力的主動(dòng)式分選技術(shù)，被動(dòng)式分選技術(shù)則完全依靠管道設(shè)計(jì)的特殊結(jié)構(gòu)和流體動(dòng)力學(xué)效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分選。具體可分為擠壓流分選[18]、空間位阻分選[19]、親和性分選[20]和慣性微流分選[21]等。這些技術(shù)不需要額外的力場，使得芯片操作方法和芯片制造較為簡單。其中，慣性微流分選還展現(xiàn)出無需抗體標(biāo)記(避免出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果)、處理通量高、集成性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[22]。這些優(yōu)點(diǎn)使得慣性微流控技術(shù)為血液中CTC的高效分選研究提供了一種新的有力工具。

本研究將高通量的慣性微流方法與高回收率的微結(jié)構(gòu)方法結(jié)合，發(fā)展了一種新型CTC分選微流控芯片。該裝置首先通過慣性微流分離區(qū)域移除大量的血液細(xì)胞，繼而通過等腰梯形微柱陣列欄桿進(jìn)行二次分離，最終實(shí)現(xiàn)CTC的高通量、高回收率和高活性的分離。對(duì)比于傳統(tǒng)的過濾方法，本研究所設(shè)置的空間位阻結(jié)構(gòu)還能夠有效地避免堵塞或擁堵問題，由于傳統(tǒng)過濾方法的流動(dòng)方向是垂直于過濾結(jié)構(gòu)的，容易導(dǎo)致一些較大的樣品不能穿過微結(jié)構(gòu)而堵塞其流動(dòng)路線[23]。而本芯片空間位阻區(qū)域中樣品的流動(dòng)方向幾乎是與過濾欄桿平行的，極大地避免結(jié)構(gòu)堵塞問題，為長時(shí)間穩(wěn)定過濾樣品和建立新型的細(xì)胞過濾方法提供了新的技術(shù)手段。

圖1 微流控芯片結(jié)構(gòu)和功能機(jī)理圖。(A)微流控芯片實(shí)物圖；(B)灌注紅色染料后微流控芯片實(shí)物圖；(C)基于空間位阻和慣性微流對(duì)血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分離的微流控芯片示意圖(芯片包括四種功能區(qū)域：過濾區(qū)域(a)、慣性聚集區(qū)域(b)、慣性分離區(qū)域(c)和空間位阻區(qū)域(d))；(D)慣性聚集區(qū)域功能詳細(xì)示意圖；(E)慣性分離區(qū)域功能詳細(xì)示意圖；(F)空間位阻區(qū)域功能詳細(xì)示意圖Fig.1 Structural and functional mechanism of the microfluidic device.(A) The photograph of the microfluidic chip;(B) The photograph of the microfluidic chip after injecting red dyes;(C) Schematic diagram of the designed microfluidic device for CTC isolation using steric hindrance and inertial microfluidics(The device comprised four functional regions:filter region(a) inertial focusing region(b) inertial separation region(c) and steric hindrance region(d));(D)Detailed schematic diagram of inertial focusing region;(E)Detailed schematic diagram of inertial separation region;(F)Detailed schematic diagram of steric hindrance region

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

WS-400B-6NPP/LITEXI型旋轉(zhuǎn)涂膜儀(美國，Laurell Technologies公司)；LSP4-4A型微量注射泵(河北保定蘭格恒流泵有限公司)；DHG-9030A型鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；BL-220H型分析天平(日本，島津公司)；H-8100型透射電子顯微鏡(日本，日立公司)。

聚二甲基硅氧烷(Polydimethyliloxane,PDMS)、固化劑購自美國Momentive Performance Materials公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Foetal Bovine Serum,FBS)、胰蛋白酶和CellTracker活細(xì)胞熒光染料，均購自Invitrogen公司；L-谷氨酰胺購自Amresco公司；吖啶橙(Acridine Orange,AO)和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)均購自Sigma公司；人源性乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人源性宮頸癌細(xì)胞(HeLa)均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；人全血，從一位健康的志愿者身上采集，加入含有抗凝血?jiǎng)┑脑嚬苤校４嬖? ℃冰箱中。光掩膜由深圳美精微光電有限公司制作；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的溶液均進(jìn)行無菌處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1芯片制備本實(shí)驗(yàn)使用的微流控芯片采用AutoCAD(AutoCAD 2007,Autodesk Inc.)軟件繪制和設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)完成后由深圳美精微光電有限公司制備光掩膜。隨后利用陽性光刻膠(AZ 50XT)制作模板微結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步采用模塑法中的軟刻技術(shù)制備微流控芯片，并采用PDMS部分固化法封接芯片。圖1A和1B清晰的展示出已制備完成的微流控芯片。

1.2.2細(xì)胞染色本實(shí)驗(yàn)采用AO/PI雙染色法，分析兩種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的活性，并利用細(xì)胞活性熒光染料(CellTracker Green CMFDA和CellTracker Orange CMRA)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，觀察其生長和增殖狀態(tài)，具體方法如下： (1)細(xì)胞活性分析：首先除去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗，然后取500 μL AO的染液(20 μg/mL)，用PBS定容至2 mL，配制成終濃度為10 μg/mL的溶液，放入培養(yǎng)皿中室溫下孵育10 min；再將PI染液用PBS配制成相同的終濃度溶液，放入培養(yǎng)皿室溫下孵育10 min；用熒光顯微鏡觀察。(2)活細(xì)胞染色：首先除去培養(yǎng)基，然后取適量CellTracker工作液(10 μmol/L，37 ℃預(yù)熱)孵育40 min；棄染液，添加已預(yù)熱(37 ℃)的新鮮DMEM溶液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。最后制備適宜濃度的細(xì)胞懸液。

1.2.3圖像獲取與分析粒子運(yùn)動(dòng)熒光圖片通過熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS,CKX41)和配套的CCD圖像采集系統(tǒng)(OLYMPUS,DP73)來拍攝。圖片以及數(shù)據(jù)分別通過Image-Pro? Plus 6.0(Media Cyternetics,Silver Spring,MD)，origin 9(origin Inc.)，和 SPSS 12.0(SPSS Inc.)軟件來處理和分析。圖中的結(jié)果和誤差線通過平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。

1.2.4分離效率計(jì)算公式循環(huán)腫瘤細(xì)胞回收率和富集率的計(jì)算公式如下所示：

(1)

(2)

其中，noutlet 1代表從出口1收集的血細(xì)胞數(shù)量，ninlet代表初始灌注時(shí)血細(xì)胞的數(shù)量，Routlet 1代表出口1收集的癌細(xì)胞數(shù)量與血細(xì)胞數(shù)量的比值，Rinlet代表初始灌注時(shí)癌細(xì)胞數(shù)量與血細(xì)胞的比值。

2 結(jié)果與討論

2.1 芯片設(shè)計(jì)原理

圖2 四種功能區(qū)域(過濾區(qū)域(A)、慣性聚集區(qū)域(B)、慣性分離區(qū)域(C)和空間位阻區(qū)域(D))的掃描電鏡(SEM)圖(標(biāo)尺分別為400 μm(A)、90 μm(B)、250 μm(C)、50 μm(D))Fig.2 SEM images of four functional regions(filter region(A),inertial focusing region(B) inertial separation region(C) and steric hindrance region(D))(Scale bar:400 μm in Fig.2A,90 μm in Fig.2B,250 μm in Fig.2C,and 50 μm Fig.2D)

如圖1C所示，芯片包括四種功能區(qū)域：過濾區(qū)域(a)、慣性聚集區(qū)域(b)、慣性分離區(qū)域(c)和空間位阻區(qū)域(d)。過濾區(qū)域通過十字形結(jié)構(gòu)的設(shè)置(圖2A)，可以有效防止聚集的細(xì)胞或外來碎片堵塞微管道，是處理高通量血液樣品的關(guān)鍵步驟。慣性聚集區(qū)域是由120個(gè)收縮/擴(kuò)張管道單元組成，總長為3.6 cm。每個(gè)收縮擴(kuò)張管道長度均為150 μm，其中擴(kuò)張管道的寬度為180 μm，收縮管道的寬度為60 μm(圖2B)。細(xì)胞在一連串的收縮擴(kuò)張管道運(yùn)動(dòng)中，能夠形成不同運(yùn)動(dòng)軌跡[11]，較大體積的癌細(xì)胞可以聚焦在中間，較小體積的血細(xì)胞會(huì)分布在兩邊(圖1D)。慣性分離區(qū)域的主通道是由兩個(gè)側(cè)通道和一個(gè)中央通道組成(圖2C)，其中兩個(gè)側(cè)通道分別與出口1和出口3相連接，用于移除小尺寸的細(xì)胞(血細(xì)胞)。中央通道與出口2相連接用于收集大尺寸的靶細(xì)胞(CTC)(圖1E)。空間位阻區(qū)域包含周期性的相互具有固定間隔的等腰梯形微柱陣列欄桿(圖2D),具體設(shè)置參數(shù)如表1和圖3所示。這些微柱陣列的設(shè)置則可進(jìn)一步篩選不同體積大小的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的二次富集(圖1F)。

圖3 微流控裝置中空間位阻區(qū)域的結(jié)構(gòu)示意圖(放大圖片展示出等腰梯形微柱陣列的設(shè)計(jì)圖，更詳細(xì)的設(shè)計(jì)參數(shù)如表1所示)Fig.3 Schematic diagram of the steric hindrance region in the microfluidic device(The amplifying image shows the diagram of isosceles trapezoid-shaped pillar array,more detailed design parameters can be found in Table 1)

2.2 慣性微流分離細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)分別將人源性乳腺癌細(xì)胞(數(shù)量為～50 cells/mL，直徑為18.8 ± 2.3 μm)，以及人源性宮頸癌細(xì)胞(數(shù)量為～50 cells/mL，直徑為14.6 ± 2.8 μm)，添加到2%血細(xì)胞比容(～2.64 ×108cells/mL)的血液中來模擬全血中的低豐度腫瘤細(xì)胞樣品(循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞比率為～1/107)。人類血細(xì)胞主要包括紅細(xì)胞和白細(xì)胞。紅細(xì)胞直徑6.0～8.5 μm，厚度為1.8～2.8 μm，呈雙凹圓盤狀，具有高度變形性；白細(xì)胞近乎球形，直徑為7.0～20 μm，也具有可變形性質(zhì)。大部分血細(xì)胞的直徑大小都要小于所要灌注的癌細(xì)胞直徑[12]。

圖5 不同Rec條件下細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡分析結(jié)果圖Fig.5 Analytical results of cell trajectories under different Rec

圖4 在不同Rec下慣性聚焦區(qū)域(A)和慣性分離區(qū)域(B)中的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡(紅色虛線被用于分析相同縱向位置的細(xì)胞分布情況，分析結(jié)果分別在圖5中展示出來(標(biāo)尺為100 μm))Fig.4 Effects of Rec on cell trajectories in the inertial focusing region(A) and separation region(B)(The red dotted lines were used to analyze cell distributions at the same longitudinal positions.Analytical results are listed in Fig.5A,corresponding to Fig.4A;Fig.5B,corresponding to Fig.4B,respectively(Scale bar:100 μm))

然后將癌細(xì)胞和血細(xì)胞的混合樣品以不同管道雷諾數(shù)：Rec=ρUmDh/μ(ρ代表流體密度，μ代表流體動(dòng)態(tài)粘度，Um代表管道中流體的最大速度，Dh代表管道的流體力學(xué)直徑)灌入所設(shè)計(jì)的微流控芯片，進(jìn)行血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離篩選。首先我們將同樣位置的無細(xì)胞背景圖片提前拍攝，然后再利用背景矯正功能與相同位置的血細(xì)胞運(yùn)動(dòng)圖片相疊加，得到高清晰度的血細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡。如圖4A所示，當(dāng)Rec為50時(shí)，血細(xì)胞和癌細(xì)胞只能運(yùn)動(dòng)聚焦到管道的中心位置，而當(dāng)Rec增加到72.22時(shí)，幾乎所有的血細(xì)胞都能聚焦到靠近兩側(cè)管壁的平衡位置上，并形成清晰的60～120 μm寬度(圖5A)(這個(gè)寬度是通過測量血細(xì)胞占據(jù)兩個(gè)區(qū)域距離的半峰全寬得到的)。這種現(xiàn)象的形成是因?yàn)殡S著Rec的增加，較大的慣性升力促使直徑較小的血細(xì)胞更好的克服拖曳力向兩側(cè)管壁方向聚焦。最后當(dāng)Rec增加到94.44時(shí)，血細(xì)胞和癌細(xì)胞形成了三條細(xì)胞條帶，彼此之間不能清晰分開。因此基于上述結(jié)果，當(dāng)Rec為72.22時(shí)，血細(xì)胞在慣性聚焦區(qū)域能夠獲得聚焦到兩側(cè)管壁的最佳灌注條件。

隨后，為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，慣性分離區(qū)域中樣品的運(yùn)動(dòng)情況也被研究(圖4B)。另外，通過測量其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞光強(qiáng)度值，更清晰的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)情況能被觀察到(圖5B)。當(dāng)Rec為50時(shí)，血細(xì)胞會(huì)在慣性分離區(qū)域形成一個(gè)較寬的分布范圍。隨著Rec的增加，血細(xì)胞開始傾向于向兩邊側(cè)管道運(yùn)動(dòng)。如圖6A所示，直到Rec為72.22時(shí)，幾乎所有的血細(xì)胞都會(huì)向兩側(cè)運(yùn)動(dòng)，癌細(xì)胞在中間運(yùn)動(dòng)(紅色箭頭標(biāo)注)。當(dāng)Rec再進(jìn)一步增加到94.44時(shí)，血細(xì)胞又會(huì)出現(xiàn)三條細(xì)胞帶的分布情況，這與慣性聚焦區(qū)域中觀察到的細(xì)胞軌跡現(xiàn)象是一致的。由于三條細(xì)胞帶中的一條細(xì)胞帶是要從中央管道出去，它會(huì)降低癌細(xì)胞在中央管道出口處(出口2)的富集率。所以基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Rec=72.22是血液中CTC分離的最佳灌注條件，這與慣性聚焦區(qū)域的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3 空間位組分離細(xì)胞

圖6 在管道Rec=72.22下慣性分離區(qū)域(A)和空間位組區(qū)域(B)中細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡圖。(A)紅色箭頭展示出慣性分離區(qū)域中癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡圖;(B)紅色箭頭展示出分離后的癌細(xì)胞在欄桿作用下運(yùn)動(dòng)軌跡圖(標(biāo)尺為200 μm)Fig.6 Cell trajectories in the inertial separation region(A) and steric hindrance region(B) under Rec=72.22.(A) The red arrows indicate that the cell trajectories of isolated cells in the inertial separation region;(B) The red arrows indicate that the isolated cells were railed by the micropost array(Scale bar:200 μm)

利用前面優(yōu)化出的灌注條件，空間位阻區(qū)域中的混合樣品運(yùn)動(dòng)軌跡也被研究(圖6B)。當(dāng)人源性乳腺癌細(xì)胞或人源性宮頸癌細(xì)胞進(jìn)入空間位阻區(qū)域后，有些細(xì)胞并不能在中心線上形成單一的中央細(xì)胞條帶。本研究通過設(shè)置間距為10 μm的等腰梯形微柱陣列欄桿，能夠引導(dǎo)沒有聚焦在中心線的癌細(xì)胞沿著微柱陣列欄桿運(yùn)動(dòng)(紅色箭頭標(biāo)注)，最終進(jìn)入出口2，實(shí)現(xiàn)CTC的二次富集。另外，在慣性分離區(qū)域中未分離出的血細(xì)胞還會(huì)被設(shè)置的微柱陣列欄桿過濾掉，實(shí)現(xiàn)血細(xì)胞的二次移除，增加癌細(xì)胞的回收率和富集率。

2.4 分離效率與細(xì)胞活性

圖7 血細(xì)胞中人源性乳腺癌細(xì)胞分離前(Ⅰ和i)和分離后出口2(Ⅱ和ii)，出口1(Ⅲ和iii)，以及出口3(Ⅳ和ⅳ)的明視場圖和暗視場圖(為方便細(xì)胞回收率的計(jì)數(shù)，人源性乳腺癌細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前通過CellTracker Green進(jìn)行活細(xì)胞染色)(標(biāo)尺為150 μm)Fig.7 Comparison of bright-field(Ⅰ-Ⅳ) and fluorescence(ⅰ to ⅳ) images of the mixture of MCF-7 and blood cells before separation(Ⅰ and ⅰ),cells collected from outlet 2(Ⅱ and ⅱ),cells from outlet 1(Ⅲ and ⅲ),and cells from outlet 3(Ⅳ and ⅳ)(To facilitate the count of cell recovery,MCF-7 cells were stained with CellTracker Green)(Scale bar:150 μm)

圖8 人源性乳腺癌細(xì)胞和人源性宮頸癌細(xì)胞收集效率和富集效率統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖Fig.8 Evaluation of microfluidic system performance using cancer cells(MCF-7 and HeLa cells)

圖9 AO/PI雙重染色法細(xì)胞活性測試圖。(A)兩種癌細(xì)胞的明視場圖(上)和暗視場圖(下)；(B)兩種癌細(xì)胞活性的定量分析圖(標(biāo)尺為50 μm)Fig.9 Cell viability of separated MCF-7 and HeLa cells using AO/PI double-staining method.(A) The bright-field(top) and fluorescence(bottom) images of two cancer cells；(B) Quantitative analysis of cellular viability of control(unseparated) and separated rare cells(Scale bars:50 μm)

最后，在最優(yōu)灌注條件Rec=72.22下，我們對(duì)每個(gè)獨(dú)立樣品進(jìn)行了分離效率的統(tǒng)計(jì)分析(圖7)。首先，癌細(xì)胞在灌注前通過活細(xì)胞染色進(jìn)行了熒光標(biāo)記，便于計(jì)算其回收率和富集率(人源性乳腺癌細(xì)胞用CellTracker Green CMFDA進(jìn)行活細(xì)胞染色，人源性宮頸癌細(xì)胞用CellTracker Orange CMRA進(jìn)行活細(xì)胞染色)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種癌細(xì)胞的回收率均大于95.20%，富集效率均大于2.05×105(圖8)。由于一些沒有良好聚焦的癌細(xì)胞在經(jīng)過等腰梯形微柱陣列欄桿時(shí)，會(huì)受到高剪切應(yīng)力的影響，它們的細(xì)胞活性需要被進(jìn)一步檢測。利用AO/PI雙重染色法對(duì)參與分離和未參與分離(對(duì)照組)的癌細(xì)胞進(jìn)行活性分析統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，通過芯片結(jié)構(gòu)分離后的癌細(xì)胞仍然具有較好的活性，與對(duì)照組的癌細(xì)胞活性相似，都能達(dá)到93%以上的細(xì)胞存活率(圖9)。

圖10 分選后人源性乳腺癌細(xì)胞和人源性宮頸癌細(xì)胞活性測試圖(培養(yǎng)36 h)(標(biāo)尺為50 μm)Fig.10 Cellular viability assay of isolated MCF-7 and HeLa cells by reseeding them back in culture for 36 h(Scale bar：50 μm)

最后，我們通過培養(yǎng)和增殖兩種染色的癌細(xì)胞，如圖10所示。進(jìn)一步證明了本實(shí)驗(yàn)方法不會(huì)對(duì)CTC活性產(chǎn)生影響。

為此，本研究將高通量的慣性微流方法與高回收率的空間位阻方法結(jié)合，建立一種新型血液CTC分離裝置。該裝置能夠通過慣性微流分離區(qū)域移除大量的血液細(xì)胞，然后再通過等腰梯形微柱陣列欄桿來進(jìn)行二次分離，最終完成高通量、高效率和高活性的CTC分離?；谶@種新方法，利用實(shí)驗(yàn)室所培養(yǎng)的人源性乳腺癌細(xì)胞和人源性宮頸癌細(xì)胞混入正常的人體血液，從而模擬癌癥患者血液，可以在不使用任何抗體標(biāo)記的情況下從血細(xì)胞比容2%的血液中成功分離出癌細(xì)胞。分離速率均達(dá)到3.43 × 107cell/min，癌細(xì)胞回收率與富集率均分別大于95.20%和2.05×105。對(duì)比目前存在的諸多循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離方法，該技術(shù)具有高回收率、高通量、高活性及高富集率的明顯優(yōu)勢(shì)，結(jié)果如表2所示。

表2 血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞不同分離方法的比較

3 結(jié)論

本研究以微流控芯片為基礎(chǔ)，整合不同功能的多級(jí)連續(xù)分離裝置，有潛力應(yīng)用于血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的“液體活檢”，為癌癥早期診斷及治療提供及時(shí)、方便、準(zhǔn)確的檢測方法。這種方法不僅可以達(dá)到高效率分離，而且對(duì)比其他微流控方法，具有結(jié)構(gòu)簡單(無需機(jī)械或電子部件)、操作方便、易于作為功能模塊與現(xiàn)有的一些實(shí)驗(yàn)設(shè)備結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)不但可以大大降低微流控裝置的制作成本，還有利于微流控技術(shù)的推廣和使用。作為一種新的研究方向，微流控芯片上慣性微流與空間位阻的結(jié)合研究具有的諸多優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，一定會(huì)在生物分析、醫(yī)學(xué)研究以及臨床診斷等領(lǐng)域中具有更加廣闊的應(yīng)用前景。作為一種非侵入性的新型診斷工具，它對(duì)建立新型癌癥患者病情檢測微型分析平臺(tái)具有重要意義。