固相萃取/18O標(biāo)記高氯酸根稀釋高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中高氯酸鹽

姚清華， 柯秋璇， 李 捷， 林 虬， 林永輝， 顏孫安

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(福州)，福建福州 350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，福建福州 350003；3.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，福建福州 350001)

我國(guó)是茶葉生產(chǎn)、消費(fèi)和出口大國(guó)。近期，歐盟將干燥茶葉中高氯酸鹽的參考限量定為0.75 mg/kg，因此，茶葉中高氯酸鹽含量引起社會(huì)廣泛關(guān)注[1]。高氯酸鹽具高溶解度和低吸附性，導(dǎo)致其易溶于水，可通過水環(huán)境系統(tǒng)擴(kuò)散，經(jīng)植物吸收富集后，通過食物鏈進(jìn)入人體，是一種持久性的化學(xué)污染物。由于高氯酸鹽與碘結(jié)構(gòu)相似，可妨礙甲狀腺對(duì)碘的吸收，導(dǎo)致甲狀腺激素T3、T4合成量減少。甲狀腺激素減少可對(duì)兒童的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不良影響，尤其是對(duì)胎兒和嬰兒的大腦發(fā)育有負(fù)面影響[1 - 2]。

目前，高氯酸鹽的檢測(cè)方法主要有離子色譜法[3]、離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[2,4 - 7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8 - 9]等。本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，結(jié)合同位素18O標(biāo)記高氯酸根作為內(nèi)標(biāo)，可有效消除前處理過程帶來的影響，減少測(cè)量干擾，有效解決茶葉復(fù)雜基質(zhì)對(duì)高氯酸鹽測(cè)定的影響。該方法分別經(jīng)紅茶、綠茶、烏龍茶3種茶葉，以及多份實(shí)際樣品檢測(cè)分析驗(yàn)證，具有經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、穩(wěn)定性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

LC-20AD液相色譜-AB 4000三重四極桿質(zhì)譜儀(日本，島津公司)；SYNERY UV超純水器(美國(guó)，密理博公司)；IKA-MS3漩渦振蕩器(德國(guó)，IKA公司)；TDL-40B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；50 mL聚丙烯離心管(德國(guó)，Greiner公司)；C18固相萃取小柱(3 mL/500mg，美國(guó)Superlco公司)，經(jīng)甲醇、水活化后備用。

高氯酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(美國(guó)O2Si公司)。高氯酸鈉18O4內(nèi)標(biāo)(標(biāo)準(zhǔn)品，CIL公司)；甲酸(色譜純，Merck公司)；乙酸銨(分析純，F(xiàn)isher公司)；甲醇、乙腈(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用的試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液存儲(chǔ)容器均用30%HNO3預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確吸取高氯酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于容量瓶中，用超純水定容，濃度為100 mg/L 4 ℃ 保存?zhèn)溆?。?biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用水配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度依次為0、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。0.2%甲酸和5 mmol/L乙酸銨溶液：稱取0.315 g乙酸銨，用水溶解，加入2 mL甲酸，移入1 L容量瓶中，加水至刻度，搖勻備用。

1.2.2樣品提取與凈化稱取1 g(精確至0.01 g)茶葉樣品至50 mL離心管中，加入0.1 mL 1.0 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，加入20 mL提取溶劑(500 mL超純水和500 mL甲醇混合溶液)，振蕩提取30 min。以5 000 r/min離心5 min。吸取1 mL上清液經(jīng)C18固相萃取小柱凈化，收集流出液，經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾后，待進(jìn)樣分析。

1.2.3液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜條件色譜條件：Phenomenex Luna Hillic色譜柱(100×2 mm，3 μm)。流動(dòng)相：A為5 mmol乙酸銨水溶液(含0.2%甲酸)；B為甲醇，梯度洗脫：初始為5%A，保持1.5 min，在0.5 min內(nèi)，線性變換為40%A，保持3 min；在1 min內(nèi)，線性變換為5%A，保持1 min；全程共6 min。流速始終保持0.4 mL/min。進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：40 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧電離，負(fù)離子模式(ESI-)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)；氣簾氣壓力(CUR):25.0 kPa；霧化氣壓力(GS1):50.0 kPa；輔助加熱氣壓力(GS1):50.0 kPa；碰撞氣壓力(CAD)：Medium；電噴霧電壓(IS)：-1 000 V；離子源溫度(TEM):550 ℃；監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞能量、去簇電壓、采集時(shí)間和保留時(shí)間見表1。

表1 高氯酸鹽的質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

2.1.1提取溶劑的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分別采用水、乙酸、乙腈、甲醇對(duì)茶葉中高氯酸鹽進(jìn)行提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用50%甲醇溶液提取時(shí)效果最好，3種茶葉中高氯酸鹽回收率穩(wěn)定(102.5%～105.3%)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小(1.2%～2.8%)。其它的提取溶劑存在回收率不穩(wěn)定或本底干擾明顯的現(xiàn)象。因此選取甲醇/水為最佳提取劑。同時(shí)，為避免前處理使用的水存在的本底污染，在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)用水進(jìn)行驗(yàn)證。

2.1.2凈化柱的選擇本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了C18固相萃取柱、石墨碳黑柱和HLB柱對(duì)3種茶葉中高氯酸鹽提取液的凈化效果。C18固相萃取可有效去除提取液中的茶葉色素和大分子類干擾物質(zhì)，效果明顯優(yōu)于石墨碳黑柱和HLB柱，且回收試驗(yàn)理想，具有操作時(shí)間短，預(yù)處理過程簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇C18固相萃取柱為凈化柱。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)以5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.2%甲酸)-甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫，對(duì)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，分析碎片離子信息，以響應(yīng)值高、基線噪音值低的離子對(duì)m/z98.9/83.0,100.9/85.0(定性離子對(duì)),選擇信號(hào)最強(qiáng)的m/z98.9/83.0作為定量離子對(duì)。結(jié)果表明，采用甲醇替代乙腈為流動(dòng)相，可以去除水中高氯酸鹽的本底影響。

根據(jù)高氯酸鹽的結(jié)構(gòu)特征，選擇電噴霧(ESI)離子源，在負(fù)離子模式下高氯酸丟失1個(gè)氧原子，故以m/z98.9/83.0作為高氯酸鹽的定量離子對(duì)。同時(shí)，對(duì)氣簾氣壓力、霧化氣壓力、輔助加熱氣壓力、碰撞氣壓力、電噴霧電壓等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了分子離子m/z98.9與特征碎片離子m/z83.0的最佳靈敏度。高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及茶葉樣品的總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)及茶葉樣品(b)的HPLC-MS/MS總離子流(TIC)圖Fig.1 TIC of perchlorate standard(a) and tea sample(b)

2.3 方法的評(píng)價(jià)

2.3.1方法的線性范圍將不同濃度的高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，以峰面積(y)與對(duì)應(yīng)高氯酸鹽質(zhì)量濃度(x，ng/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。高氯酸鹽在1.0～20.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，高氯酸鹽與峰面積呈良好的線性關(guān)系：y=0.287x，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。

2.3.2方法準(zhǔn)確度和精密度分別向3種茶葉樣品中添加20、100、200 ng/mL 3個(gè)不同質(zhì)量濃度的高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化后的方法重復(fù)測(cè)定6次?？鄢枞~本底后，樣品中高氯酸鹽的含量、加標(biāo)回收率及精密度(RSD)如表2示。

表2 茶葉樣品中高氯酸鹽含量、加標(biāo)回收率及精密度(n=6)

2.3.3方法檢測(cè)限和定量限在優(yōu)化條件下，分別按信噪比(S/N)>10和信噪比(S/N)=3計(jì)算，高氯酸鹽的定量限為0.02 mg/kg，高氯酸鹽在茶葉中的檢測(cè)限為0.006 mg/kg。本方法的定量限遠(yuǎn)低于歐盟規(guī)定的高氯酸鹽在茶葉中的參考?xì)埩粝蘖恐?.75 mg/kg，能夠滿足我國(guó)茶葉中高氯酸鹽的檢測(cè)要求。

2.4 方法的應(yīng)用

將該方法用于60份綠茶、60份紅茶和109份烏龍茶的測(cè)定，人員及實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性好，穩(wěn)定、可靠。

3 結(jié)論

本文以同位素18O標(biāo)記高氯酸根作為內(nèi)標(biāo)，建立了固相萃取-高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中高氯酸鹽含量的方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，有效解決了茶葉基質(zhì)較復(fù)雜的問題，具有良好的凈化富集效果和較高的回收率。