分散液液微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法測定中藥甘草中鄰苯二甲酸酯殘留

周艷芬， 高 原， 賀筱雅， 門秀琴， 彭亞鴿， 劉萬毅， 孟 哲

(省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/化學(xué)化工學(xué)院，寧夏大學(xué)，寧夏銀川 750021)

鄰苯二甲酸酯類(Phthalate Esters，PAEs)化合物被廣泛用于塑料制品中，以增大產(chǎn)品的可塑性和強(qiáng)度，它是一類重要的環(huán)境激素類物質(zhì)。塑化劑的過多使用帶來了很大的負(fù)面影響，調(diào)查表明，我國土壤PAEs的污染程度是西方發(fā)達(dá)國家的幾倍到幾十倍[1 - 3]，而土壤中的PAEs超標(biāo)會直接導(dǎo)致農(nóng)作物及中藥材中PAEs的高殘留[3 - 4]。甘草是我國藥食同源非常重要的一味中藥材，市場需求量很大。目前市場流通的中藥甘草主要來自人工栽培，但相關(guān)中藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)還很不健全，因此加強(qiáng)對中藥材環(huán)境污染物的監(jiān)測是一項(xiàng)亟待解決的問題[5 - 6]。

PAEs的測定方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[7 - 8]、高效液相色譜法[9]和液相色譜-質(zhì)譜法[10]等。固相微萃取法(SPME)是近年來備受關(guān)注的新型預(yù)處理方法，但成本高，容易產(chǎn)生過飽和現(xiàn)象[11]。分散液液微萃取(DLLME)是一種采用微量體積的萃取劑，在分散劑作用下樣品溶液形成乳濁現(xiàn)象，使目標(biāo)物在樣品溶液及萃取劑之間快速達(dá)到分配平衡而完成[12 - 14]。該萃取方法具有操作簡單、有機(jī)萃取溶劑用量少、富集倍數(shù)高和對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水環(huán)境體系中農(nóng)藥殘留及有害物質(zhì)的分離富集[15 - 16]。

本文采用分散液液微萃取技術(shù)，針對不同來源的中藥甘草樣品，優(yōu)化了提取溶劑種類、萃取劑種類和體積、分散劑體積及鹽效應(yīng)等前處理?xiàng)l件，建立了鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)和鄰苯二甲酸-正辛酯(DNOP) 5種PAEs的分散液液微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ISQTMThermo單四極桿氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Thermo Scientific)，配EI源、Thermo Scientific “Xcalibur”3.1軟件；QL-866旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；HGC-12A型氮吹儀(金屬浴)(河北潤創(chuàng)科技開發(fā)有限公司)；250 μL的微量進(jìn)樣器(美國，HAMILTON公司)；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)(湘儀)；HX-200型高速中藥粉碎機(jī)(浙江省永康市溪岸五金藥具廠)。

DBP、BBP、DCHP、DEHP、DNOP標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于>98%)，均購自美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷、環(huán)己烷(色譜純，美國Fisher公司)，二氯甲烷、氯仿、四氯化碳(色譜純,德國MERCK公司)；NaCl(分析純，天津科密歐科技有限公司)。載氣(純度>99.9999%的氦氣)購自銀川市寶豐工業(yè)氣體有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用環(huán)己烷分別將DBP、BBP、DCHP、DEHP和DNOP配成濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用環(huán)己烷配成濃度為10 mg/L 的DBP、BBP、DCHP、DEHP和DNOP的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃冰箱保存，臨用前以環(huán)己烷逐級稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品的制備

10份市售中藥甘草收集自安徽亳州(AG1～AG3)、甘肅(BG1～BG3)、寧夏(CG1～CG4)。甘草樣品經(jīng)50 ℃干燥2 h后，粉碎至0.25 mm，袋裝密封后放置在干燥器中。準(zhǔn)確稱取1.0 g甘草粉末，置于10 mL 具蓋玻璃試管中，添加4 mL甲醇，密封并置于60±5 ℃水浴振蕩器中1 h，渦旋1 min，3 500 r/min離心5 min。轉(zhuǎn)移3.5 mL的上層清液于10 mL的玻璃離心管中，加入2.0 mL的水(分散劑)、100 μL的四氯化碳(萃取劑)和0.15 g的NaCl，振蕩出現(xiàn)渾濁并保持1 min，3 500 r/min離心5 min；用微量注射器抽取于玻璃試管中，氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入0.5 mL的環(huán)己烷，0.22 μm濾膜過濾至進(jìn)樣瓶，取0.1 μL注入GC/MS儀進(jìn)行測定。

1.4 氣相色譜/質(zhì)譜條件

色譜條件：TG -5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；程序升溫：初溫為50 ℃，保持0.5 min，以30 ℃/min升至180 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至290 ℃，保持5 min,最終以30 ℃/min升至320 ℃，保持5 min；載氣：高純氦氣，流速1.2 mL/min；進(jìn)樣方式：自動，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：0.1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI)，電子轟擊能量70 eV；質(zhì)譜傳輸溫度280 ℃；離子源溫度280 ℃；溶劑延遲時(shí)間至4.0 min；掃描模式：全掃描模式(Full)用于定性分析，其質(zhì)量掃描范圍m/z50～600 Da；選擇離子掃描模式(SIM)，通過分段選擇每一個(gè)目標(biāo)物的特征碎片離子進(jìn)行掃描，目標(biāo)分析物的保留時(shí)間、定性和定量離子見表1。

表1 5種PAEs化合物的保留時(shí)間及用于PAEs確認(rèn)和測定的碎片離子

圖1 不同提取溶劑對被分析物回收率的影響Fig.1 Effect of different extractants on the recovery of five PAEs

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、丙酮、乙腈、甲醇∶丙酮(1∶1，V/V)和甲醇∶丙酮(1∶2，V/V)為提取溶劑時(shí)對目標(biāo)物的提取效果。采用基質(zhì)加標(biāo)法(10 μg/L)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可知，甲醇對甘草中DBP、BBP、DCHP、DEHP和DNOP 5種待測物的提取回收率比其它溶劑高，其回收率均穩(wěn)定在大于78.67%±5%和小于103.80%±3%之間，因此選取甲醇作為實(shí)際甘草樣品中目標(biāo)物的提取溶劑。

2.2 分散液液微萃取條件的優(yōu)化

2.2.1萃取劑及其體積的選擇取3.5 mL甲醇提取溶液，分別考察萃取劑的種類和最佳萃取體積?？焖偌尤?00 μL萃取劑和2.0 mL水及0.15 g NaCl，振蕩產(chǎn)生濁化現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，二氯甲烷作為萃取劑，溶液不出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象且分層效果很差；氯仿作為萃取劑，溶液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，但有機(jī)相體積變化大(145±20 μL)、回收率低；四氯化碳作為萃取劑，溶液濁化現(xiàn)象明顯，分層效果好，有機(jī)相體積約為65±5 μL，5種被測物的回收率在75.81%～103.65%之間，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5.61%。因此選取高密度、低水溶性的四氯化碳為樣品溶液中待測物PAEs的萃取溶劑。

分別取40、60、80、100、120、140和160 μL四氯化碳考察體積用量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，萃取劑體積小于40 μL，沉淀相中的四氯化碳液滴很難取出。隨著四氯化碳體積的增加，樣品溶液中待測物的回收率增大。當(dāng)萃取劑四氯化碳的體積大于120 μL后，待測物的回收率有所下降。綜合考慮四氯化碳的最佳體積選為100 μL。

圖2 不同萃取劑對被分析物回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction solvents on the recovery of five PAEs

圖3 不同體積萃取溶劑對被分析物回收率的影響Fig.3 Effect of volume of extraction solvent on the recovery of five PAEs

2.2.2分散劑及其體積的選擇實(shí)驗(yàn)選擇水為分散劑，考察了其加入體積為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL時(shí)，溶液的濁化現(xiàn)象及四氯化碳的提取效率。結(jié)果表明水的體積在2.0 mL溶液的濁化現(xiàn)象較好，DBP、BBP、DCHP、DEHP和DNOP 5種待測物的響應(yīng)值較高且穩(wěn)定。但隨著水體積的增加，混合溶液的濁化現(xiàn)象消失，原因是5種待測物在體系中的分散程度增大，從而導(dǎo)致四氯化碳的萃取效率降低。因此，實(shí)驗(yàn)選取水作為分散劑，最佳體積為2.0 mL。

圖4 5種PAEs化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖(TIC)Fig.4 TIC of five PAEs standard solution(concentration 10 μg/L)

2.2.3離子強(qiáng)度的影響溶液的離子強(qiáng)度主要影響目標(biāo)物在分散劑和萃取劑之間的分配系數(shù)[12 - 14]。實(shí)驗(yàn)考察了樣品中NaCl的添加量(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g)對萃取效率的影響。隨著NaCl加入量增加至0.15 g時(shí)，100 μL萃取劑的回收體積為65±5 μL，5種PAEs的回收率明顯增加。而NaCl加入量增加至0.20 g時(shí)，100 μL萃取劑的回收體積為90±6 μL，5種PAEs的回收率略有下降。原因是隨著NaCl添加量的增加溶液趨于飽和，甲醇在水中溶解度降低而使萃取劑的回收體積增加，導(dǎo)致待測物的濃縮倍數(shù)降低。綜合考慮，選取NaCl添加量為0.15 g。在最佳的優(yōu)化條件下，5種PAEs標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見圖4。

2.3 線性關(guān)系與檢出限

在優(yōu)化分散液液萃取-GC/MS條件下，以各待測物的峰面積(y)對對應(yīng)的質(zhì)量濃度(x，μg/L)繪制回歸曲線，結(jié)果見表2。5種PAEs在1～5 000 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9990。該方法的檢出限和定量限分別為0.16～0.58 μg/kg和0.34～1.92 μg/kg。

2.4 方法回收率與精密度

在實(shí)際的甘草樣品中進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表3。5種PAEs的平均回收率為87.80%～120.63%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.14%～7.43%(n=5)。

表2 5種PAEs線性關(guān)系、檢出限及定量限

表3 5種PAEs的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.5 實(shí)際樣品的測定

圖5 實(shí)際甘草樣品中PAEs的種類和含量Fig.5 The types and contents of PAEs in licorice herbs sample(a)Blank,(b)AG1-AG3,(c)BG2-BG3 and CG1-CG3,(d)CG4 spiked.

采用本方法對三個(gè)省的10個(gè)甘草樣品(AG1～AG3、BG1～BG3、CG1～CG4)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性樣品需對目標(biāo)物進(jìn)一步確認(rèn)。依據(jù)實(shí)際甘草樣品CG4加標(biāo)(5.0 μg/L)后如圖5(d)，被分析物DBP、BBP、DCHP、DEHP和DNOP的保留時(shí)間分別為13.88、21.15、23.93、24.39和27.18 min，及其相應(yīng)的特征碎片離子與表1相符。結(jié)果表明所有甘草樣品BG1～BG3、CG1～CG3如圖5(c)，AG1～AG3如圖5(b)，均被檢測出DBP和DEHP，平均含量為0.13 mg/kg和0.09 mg/kg。三省甘草樣品中5種PAEs化合物總濃度(ΣPAEs)在0.22～0.58 mg/kg范圍，尤其DBP和DEHP的檢出率為100%。目前，在我國甘草類中藥材多為人工栽培，而對農(nóng)業(yè)環(huán)境中PAEs污染特征的系統(tǒng)研究較少，尤其對中藥材中殘留的PAEs引起的健康風(fēng)險(xiǎn)缺乏關(guān)注。結(jié)合文獻(xiàn)[1 - 3,17 - 19]的報(bào)道，土壤及設(shè)施農(nóng)業(yè)環(huán)境中PAEs的污染分布與該法測定的中藥甘草樣品中所含PAEs的污染量成正相關(guān)性。

3 結(jié)論

建立了分散液液微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定及確認(rèn)中藥甘草中PAEs組分的方法。采用該方法對10個(gè)中藥甘草樣品中PAEs進(jìn)行測定，所有甘草藥材中均被檢測出DBP和DEHP，平均含量為0.13和0.09 mg/kg。三省甘草樣品中5種PAEs化合物總濃度(ΣPAEs)在0.22～0.58 mg/kg范圍。