毛細(xì)管區(qū)帶電泳-紅色激光誘導(dǎo)熒光檢測磷酸化氨基酸

夏麗君， 郭小峰， 王 紅

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

蛋白質(zhì)磷酸化是一種重要的蛋白質(zhì)修飾類型，在真核生物細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)、信號傳導(dǎo)以及新陳代謝等細(xì)胞調(diào)控過程中起到關(guān)鍵作用[1-2]，其失調(diào)與癌癥、糖尿病和高血壓等[3]許多疾病有關(guān)。最常見的磷酸化類型為蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸殘基的磷酸化，它們具有作為控制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的分子開關(guān)的能力[4]。蛋白質(zhì)的水解和生物體代謝活動可生成對應(yīng)的磷酸化氨基酸，通過對它們的定量分析，可以了解蛋白質(zhì)磷酸化程度，并探討磷酸化對蛋白質(zhì)功能的影響[5]。

目前，已有多種磷酸化氨基酸的分析方法，如薄層色譜法[6]、同位素標(biāo)記法[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8]、毛細(xì)管電泳法(CE)[5]和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[2]等。其中，CE不僅靈敏度高、分離速度快，且樣品消耗量遠(yuǎn)少于其它方法，特別適合生物樣品的分析。但是，磷酸化氨基酸本身不具備可檢測的熒光信號，需要使用熒光衍生試劑。已報道的用于檢測磷酸化氨基酸的熒光衍生試劑主要有：熒光素異硫氰酸酯(FITC)[9]、2,3-萘二醛(NDA)[10]、9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC)[11]、6-氧-(N-羥基琥珀酰亞胺乙酸酯)-9-(2′-甲氧羰基)熒光素(SAMF)[12]、1-(ε-琥珀酰亞胺羧戊基)-1′-甲基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚碳菁-5,5′-二磺酸單鉀鹽(MeCy5-OSu)[5]、N-羥基琥珀酰亞胺-熒光素-O-乙酸酯(SIFA)[13]、3-(2-呋喃甲酰基)喹啉-2-甲醛(FQ)[14]和5-(4,6-二氯-s-三嗪-2-氨基)熒光素(DTAF)[15]等，它們均通過與磷酸化氨基酸上的氨基反應(yīng)實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記。

1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-(4′-氧乙酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯)-二氟化硼-二吡咯甲烷(DMDSPAB-OSu)是本課題組近期自行設(shè)計并合成的氨基熒光衍生試劑，其結(jié)構(gòu)見圖1。DMDSPAB-OSu以二氟化硼二吡咯甲烷(BODIPY)為熒光基團(tuán)，以高活性的N-羥基琥珀酰亞胺酯為反應(yīng)基團(tuán)，其激發(fā)/發(fā)射波長(617/625 nm)可匹配商品化的半導(dǎo)體激光誘導(dǎo)熒光檢測器。本研究采用DMDSPAB-OSu為熒光衍生試劑，其與磷酸化氨基酸在0.07 mol·L-1H3BO3-Na2B4O7緩沖溶液(pH=8.5)中，室溫下衍生反應(yīng)僅需5 min，衍生產(chǎn)物用毛細(xì)管區(qū)帶電泳-激光誘導(dǎo)熒光(CZE-LIF)分離檢測，在17.5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，檢出限(S/N=3)為1.5～3.2 nmol·L-1，生物樣品中內(nèi)源熒光物質(zhì)和常見氨基化合物均無干擾，方法用于牛奶樣品分析，加標(biāo)回收率為91.1%～103.8%。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

Beckman-Coulter P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(美國，貝克曼庫爾特)，配有半導(dǎo)體激光誘導(dǎo)熒光檢測器(635/675 nm，2 mW)。Delta 320酸度計(梅特勒-托利多(上海))。

L-磷酸化絲氨酸(P-Ser)、L-磷酸化蘇氨酸(P-Thr)、L-磷酸化酪氨酸(P-Tyr)標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司(上海)，溶于水配成5 mmol·L-1的儲備溶液，使用時稀釋到所需的濃度。H3BO3、Na2B4O7、一水合檸檬酸、二水合檸檬酸鈉、乙醇、乙腈購于上海國藥(集團(tuán))試劑有限公司。DMDSPAB-OSu由本實(shí)驗(yàn)室自行合成，溶于乙腈配成2 mmol·L-1儲備溶液。

圖1 DMDSPAB-OSu與氨基化合物的衍生反應(yīng)Fig.1 The reaction of DMDSPAB-OSu with amino compound

1.2 DMDSPAB-OSu與磷酸化氨基酸的衍生

DMDSPAB-OSu與氨基化合物的衍生反應(yīng)如圖1所示。向含有15 μL磷酸化氨基酸混合溶液的Eppendorf管中，加入10 μL 0.07 mol·L-1H3BO3-Na2B4O7緩沖溶液(pH=8.5)，15 μL的DMDSPAB-OSu溶液(2 mmol·L-1)和10 μL乙腈，充分混合后，于室溫下反應(yīng)5 min。

1.3 樣品處理

牛奶酪蛋白提?。簩㈩A(yù)熱到40 ℃的HAc-NaAc溶液(20 mL，0.2 mol·L-1，pH=4.7)緩慢加入到20 mL的40 ℃牛奶中。然后將溶液pH調(diào)到4.7，溶液變成白色懸濁液。冷卻至室溫后，離心，棄去上清液，得酪蛋白粗產(chǎn)物。最后依次用水、乙醇、乙醚和乙醇的混合溶液各洗滌3遍。

酪蛋白水解：將15 mL 6 mol·L-1的HCl慢慢倒入加入了酪蛋白粗產(chǎn)物的三口瓶中，加熱回流過夜。將酪蛋白水解液用濃NaOH溶液調(diào)pH至中性，然后用0.22 μm濾膜過濾后，定容至20 mL，稀釋10倍后按1.2節(jié)所述衍生方法進(jìn)行衍生。

1.4 毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離-激光誘導(dǎo)熒光檢測

毛細(xì)管總長為55 cm，有效長度45 cm，內(nèi)徑75 μm(河北永年光纖廠)在使用前依次用甲醇、水、1 mol·L-1NaOH溶液、水、1 mol·L-1HCl、水沖洗30 min。每天使用前，毛細(xì)管依次用水、0.1 mol·L-1NaOH溶液、水、0.1 mol·L-1HCl、水各沖洗3 min，然后用電泳緩沖溶液平衡毛細(xì)管5 min。衍生物用背景電解質(zhì)稀釋10倍后進(jìn)行分離測定。工作條件：壓力進(jìn)樣：0.5 psi、5.0 s;分離電壓：20.0 kV；溫度：室溫。激光誘導(dǎo)熒光檢測器：激發(fā)/發(fā)射波長為617/625 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離條件優(yōu)化

圖2 DMDSPABOSu-磷酸化氨基酸衍生物的電泳圖Fig.2 Electropherogram of DMDSPABOSu-phosphorylated amino acids derivativesRunning buffer:13.5 mmol·L-1 pH=8.5 H3Cit-Na3Cit buffer,55%(V/V) acetonitrile. Separation voltage:20 kV;Injection:5 s,0.5 psi.

CZE是CE中最簡便的分離模式，利用分析物在毛細(xì)管中遷移速率的不同而實(shí)現(xiàn)分離。遷移速率是電泳和電滲兩種速率的矢量和，而背景電解質(zhì)的組成是影響遷移速率的主要因素。通常背景電解質(zhì)由一定組成的緩沖溶液構(gòu)成，但考慮到DMDSPAB-OSu的溶解性，因此，需要在背景電解質(zhì)中添加一定比例的有機(jī)溶劑。我們研究了乙腈含量、檸檬酸鹽緩沖溶液pH和濃度對遷移時間的影響。結(jié)果表明，3種磷酸化氨基酸衍生產(chǎn)物的遷移時間隨乙腈含量(40%～70%)和緩沖溶液濃度(9～18 mmol·L-1)升高而增加，隨pH升高而減少，且在50%～60%乙腈含量時分離效果最好。綜合考慮分離速度和分離效果，最終選擇含有55%乙腈的13.5 mmol·L-1檸檬酸鹽緩沖溶液(pH=8.5)作為背景電解質(zhì)，3種磷酸化氨基酸標(biāo)樣分離圖如圖2所示。

2.2 衍生條件優(yōu)化

N-羥基琥珀酰亞胺酯是常用的氨基化合物衍生基團(tuán)，其與氨基化合物反應(yīng)的同時，自身也會發(fā)生水解反應(yīng)[16 - 17]。因此，通常需要使用過量的衍生試劑以保證衍生效率。如圖3(a)所示，當(dāng)DMDSPAB-OSu濃度高于6.0×10-4mol·L-1時，各衍生物的峰面積達(dá)到最大并保持不變。因此，我們選擇6.0×10-4mol·L-1作為DMDSPAB-OSu最佳衍生濃度。DMDSPAB-OSu與氨基化合物的衍生過程與衍生介質(zhì)pH密切相關(guān)。因此，我們研究了H3BO3-Na2B4O7緩沖溶液在pH=8.25～9.0內(nèi)對峰面積的影響。根據(jù)結(jié)果(圖3(b))所示，衍生物的峰面積在pH=8.5時達(dá)到最大，所以選擇pH=8.5作為最佳衍生pH。加熱可以加速DMDSPAB-OSu衍生反應(yīng)，同時也會加速DMDSPAB-OSu中N-羥基琥珀酰亞胺酯基團(tuán)的水解。如圖3(c)，5 min內(nèi)3種磷酸化氨基酸衍生物的峰面積在25 ℃時達(dá)到最大，繼續(xù)增加反應(yīng)溫度峰面積有所降低，可能是水解速率加快所致，所以選擇室溫(25 ℃)作為最優(yōu)衍生溫度。隨后，在25 ℃下，5～25 min范圍內(nèi)研究衍生化時間的影響。如圖3(d)所示，5 min內(nèi)衍生已基本完成，選擇最佳衍生時間5 min。

圖3 衍生試劑濃度(a)、pH(b)、反應(yīng)溫度(c)及反應(yīng)時間(d)對DMDSPAB-磷酸化氨基酸衍生物峰面積的影響Fig.3 Effect of cDMDSPAB-OSu (a),pH(b),reaction temperature(c) and reaction time(d) on the peak area of DMDSPABOSu-phosphorylated amino acids derivatives1.Tyr;2.P-Ser;3.P-Thr.

2.3 干擾實(shí)驗(yàn)

DMDSPAB-OSu可與氨基化合物反應(yīng)，用于磷酸化氨基酸的分離，其可能的干擾主要源自生物樣品基質(zhì)中普遍存在的脂肪胺、生物胺、氨基酸等各種氨基化合物。CZE中遷移時間主要由質(zhì)荷比決定，而在上述弱堿性背景電解質(zhì)中，脂肪胺和生物胺的衍生產(chǎn)物在該條件下不帶電荷，磷酸化氨基酸的磷酸基團(tuán)發(fā)生解離，其所帶負(fù)電荷較基本氨基酸更多，質(zhì)荷比有較大的差別，理論上脂肪胺、生物胺和基本氨基酸對磷酸化氨基酸的分離應(yīng)無干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，脂肪胺(甲胺至正十二胺共十二種)、生物胺(組胺，酪胺，苯乙胺，色胺，5-羥色胺，胍基丁胺，乙醇胺，腐胺，尸胺，亞精胺，精胺共十一種)以及常見氨基酸的DMDSPAB-OSu衍生產(chǎn)物遷移時間與3種磷酸化氨基酸差別顯著，對分離不產(chǎn)生干擾。

2.4 分析性能

在上述優(yōu)化的衍生和分離條件下，獲得了3種磷酸化氨基酸的濃度與峰面積的線性方程、線性范圍、日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，其檢出限(S/N=3)為1.5～3.2 nmol·L-1，如表1所示。與其它用于磷酸化氨基酸檢測的熒光試劑相比，DMDSPAB-OSu衍生條件更溫和、反應(yīng)速度更快，采用紅色LIF檢測以避免生物樣品內(nèi)源性熒光干擾的同時，可獲得不輸于綠色LIF檢測方法的靈敏度，見表2。

表1 磷酸化氨基酸的線性范圍，線性方程和檢出限

aS/N=3;X:concentration of amine(μmol·L-1);Y:peak area of DMDSPAB-phosphorylated amino acids.

表2 DMDSPAB-OSu與已報道的磷酸化氨基酸衍生試劑對比

2.5 樣品分析

牛奶中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白[18]，其中含有較為豐富的磷酸化絲氨酸殘基[19]。圖4是牛奶中酪蛋白水解樣品及其加標(biāo)回收的電泳圖譜，其檢測結(jié)果如表3所示?？梢钥闯?，牛奶中酪蛋白的磷酸化絲氨酸殘基濃度為5.17×10-4mol·L-1。

圖4 牛奶中酪蛋白水解樣品加入5.0×10-4 mol·L-1標(biāo)準(zhǔn)磷酸氨基酸前(a)后(b)的電泳圖譜Fig.4 Electropherograms obtained from (a) hydrolyzed casein of milk and (b) hydrolyzed casein of milk spiked with 5.0×10-4 mol·L-1 of standard phosphoamino acidsRunning buffer:13.5 mmol·L-1 pH=8.5 H3Cit-Na3Cit buffer,55%(V/V) acetonitrile.Separation voltage:20 kV;Injection 5 s at 0.5 psi.

AnalyteAdded(10-5 mol·L-1)Found(10-5 mol·L-1)RSD(%,n=5)Recovery(%)AnalyteAdded(10-5 mol·L-1)Found(10-5 mol·L-1)RSD(%,n=5)Recovery(%)P-Thr00P-Tyr0050.051.95.5103.850.045.85.891.6150.0149.65.199.7150.0136.76.391.1P-Ser051.750.098.26.293.0150.0197.25.297.0

3 結(jié)論

本文基于DMDSPAB-OSu的優(yōu)異熒光特性，建立了CZE-LIF分離檢測實(shí)際樣品中磷酸化氨基酸的新方法。室溫下，在70 mmol·L-1pH=8.5 H3BO3-Na2B4O7緩沖液中，DMDSPAB-OSu與3種磷酸化氨基酸的衍生反應(yīng)僅需5 min。在含有13.5 mmol·L-1pH=8.5的檸檬酸鹽緩沖溶液和55%(V/V)乙腈的背景電解質(zhì)中，磷酸化氨基酸衍生物分離用時17.5 min。較之已報道的CE-LIF相關(guān)檢測方法，DMDSPAB-OSu衍生條件溫和、反應(yīng)迅速、靈敏度較高，且采用紅色LIF檢測能夠避免生物樣品內(nèi)源性熒光干擾。