商陸離體再生體系的構建

鄧雯韜，田 宇，謝 琴，肖英粟，蘇 益，藺萬煌

(湖南農(nóng)業(yè)大學植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

商陸(PhytolaccaacinosaRoxb) 為商陸科商陸屬多年生宿根草本植物，是一種傳統(tǒng)的藥用植物[1-3]，也被用于環(huán)境修復[4-7]、病蟲害防治[8]和印染業(yè)[9]等多個領域。我國野生商陸資源豐富，分布廣泛，具有很高的利用和開發(fā)價值。商陸具有富集土壤中多種金屬離子的作用[10-16]，利用商陸礦質(zhì)營養(yǎng)遺傳資源對改善作物營養(yǎng)特性和土壤修復具有重要意義。開展商陸離體再生體系研究，為商陸礦質(zhì)營養(yǎng)相關基因功能分析及其遺傳轉化體系的構建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

商陸種子的采集，于2016年秋季在湖南農(nóng)業(yè)大學校園周邊荒地采集成熟的商陸漿果，置于水盆中用紗布將漿果中的種子擠出，棄果皮和上浮的種子，收集下沉飽滿的種子于自然條件下風干，存放4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 離體培養(yǎng)條件

試驗以 MS 為基本培養(yǎng)基，根據(jù)試驗目的分別添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑組合。培養(yǎng)基中瓊脂濃度為0.7%-0.8%,蔗糖濃度為3%,pH為5.8。經(jīng)121 ℃高壓濕熱滅菌25 min，培養(yǎng)瓶為100 mL三角玻璃瓶，培養(yǎng)溫度為(23±2)℃，光照強度為2 000 Lx，每天光暗周期為14 h/10 h。

1.2.2 外植體的獲取

參考吳豪杰等的方法[17]，取成熟飽滿的商陸種子，用濃硫酸浸泡處理15 min后，以無菌水沖洗4～6次以除去殘留的硫酸，再將種子接種于含MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中發(fā)芽。首先在黑暗條件下培養(yǎng)3 d，種子萌發(fā)后再置于光照下培養(yǎng)2～3周，獲得六葉期的無菌苗作為商陸離體培養(yǎng)的外植體。

1.2.3 愈傷組織的誘導

分別切取商陸無菌苗的葉片(大小約5 mm×5 mm)、葉柄(長約3～5 mm)、幼莖(長約3～5 mm)、莖節(jié)(帶腋芽的莖段，長約3～5 mm)和頂芽(長約5～8 mm)，接種到含有不同濃度組合的植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中(表1)進行愈傷組織誘導培養(yǎng)。觀測20 d后愈傷組織生長情況，統(tǒng)計出愈率。

出愈率(%)=長出愈傷組織的個數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

表1 愈傷組織誘導培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑組成Tab.1 The composition of plant growth regulators in callus induction medium

1.2.4 叢生芽的誘導

分別挑選以幼莖、莖節(jié)、葉片、葉柄和頂芽為外植體誘導出來且生長狀況良好的愈傷組織，接種于芽分化培養(yǎng)基中(如表 2)。觀測20 d后叢生芽的生長情況，統(tǒng)計能誘導叢生芽的愈傷組織個數(shù)。

叢生芽誘導率(%)=芽分化的外植體個數(shù)/接種愈傷組織總數(shù)×100%

1.2.5 生根誘導

當叢生芽長至1.5 cm以上時，切下不定芽，分別接種于表3 所示的培養(yǎng)基中進行生根誘導，觀測15 d后試管苗的不定根生長情況，統(tǒng)計生根率。

生根率(%)=生根的試管苗個數(shù)/接種的不定芽總數(shù)×100%

2 結果與分析

2.1 商陸外植體的選擇和愈傷組織的誘導

選取不同的外植體分別接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中(見表1)。在培養(yǎng)5 d后可觀察到葉柄、幼莖、莖節(jié)和頂芽的切口處有愈傷組織長出，培養(yǎng)8 d后在葉片切口邊緣有愈傷組織長出。愈傷組織生長狀況表明，商陸外植體以幼莖和頂芽出愈時間早，愈傷組織生長良好，而莖節(jié)和葉柄誘導的愈傷組織容易褐化變質(zhì)，以葉片誘導愈傷組織則出愈時間較遲，愈傷組織生長緩慢。

觀測統(tǒng)計培養(yǎng)20 d的愈傷組織生長情況，如表4所示。試驗結果表明，在植物生長調(diào)節(jié)劑一定濃度范圍內(nèi)，在同一培養(yǎng)基中誘導的幼莖和頂芽的愈傷組織生長基本一致，愈傷組織生長質(zhì)量較好，并以培養(yǎng)基②和③的出愈率最高，達到100%。培養(yǎng)基⑤和⑦產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)地較硬，顏色為綠色。綜合考慮出愈時間、出愈率、愈傷組織生長質(zhì)量和植物生長調(diào)節(jié)劑用量，筆者認為培養(yǎng)基③，即MS+6-BA 0.5 mg/L+2.4-D 0.5 mg/L為本試驗中誘導愈傷組織最適宜培養(yǎng)基。

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對叢生芽誘導的影響

將各外植體誘導出的愈傷組織接種于不同的芽分化培養(yǎng)基中，觀察在不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合培養(yǎng)基中芽分化情況。如圖1所示，在本試驗所用各種培養(yǎng)基方案中，以幼莖、莖節(jié)、葉片和葉柄為外植體誘導的愈傷組織均無不定芽的產(chǎn)生，盡管幼莖和葉片誘導的愈傷組織生長良好，但仍未觀察到叢生芽的產(chǎn)生。只有以頂芽誘導的愈傷組織才出現(xiàn)芽的分化(圖1a)，并以培養(yǎng)基⑩(MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.25 mg/L)中最易分化出叢生芽，出芽率高達98%。進一步試驗觀察發(fā)現(xiàn)，在以頂芽誘導的愈傷組織生長過程中，原外植體頂芽也會繼續(xù)生長。只有帶頂芽的愈傷組織轉接到芽分化培養(yǎng)基后才有叢生芽的分化，而不帶頂芽的愈傷組織未發(fā)現(xiàn)有芽的分化，即使該愈傷組織由頂芽誘導產(chǎn)生。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對試管苗生根的影響

待叢生芽生長至1.5 cm高以上時，從芽基部切下，接種于到生根培養(yǎng)基中進行生根誘導。 結果如表5所示，應用NAA或IBA分別添加到MS、1/2 MS基本培養(yǎng)基中，都能誘導試管苗生根。除培養(yǎng)基生根率較低外，其他各處理的生根率均達到70%以上，且以培養(yǎng)基、和的生根率最高，達到100%。在NAA 0.3～0.8 mg/L濃度范圍內(nèi)誘導的根生長健壯，氣生根較少，當NAA濃度為1.5 mg/L時，可在培養(yǎng)基表面生長較多的氣生根，且誘導生根時間提前。在相同的濃度條件下，與IBA相比，NAA誘導產(chǎn)生的根更健壯，IBA誘導產(chǎn)生的氣生根多且根生長緩慢。綜合分析表明，以培養(yǎng)基(1/2 MS+NAA 0.3 mg/L)對商陸試管苗生根較為適宜，其試管苗生根情況如圖2。

表4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合對愈傷組織誘導的影響Tab.4 Effects of different plant growth regulators ratios on callus induction

注：培養(yǎng)基編號①～⑦參見表1;小寫字母表示α= 0.05水平不同基本培養(yǎng)基處理間差異性顯著。

圖1 叢生芽的分化Fig.1 Differentiation of cluster buds a.頂芽誘導的愈傷組織分化出叢生芽;b.幼莖誘導的愈傷組織;c.莖節(jié)誘導的愈傷組織;d.葉片誘導的愈傷組織;e.葉柄誘導的愈傷組織a.Cluster buds induced from apical buds callus;b.Callus from young stem;c.Callus from stem node;d.Callus from lamina;e.Callus from petiole

表5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對誘導生根的影響Tab.5 Effects of different plant growth regulators ratios on induced rooting

注：培養(yǎng)基編號～參見表3;小寫字母表示α=0.05水平不同基本培養(yǎng)基處理間差異性顯著。

圖2 商陸試管苗生根誘導Fig.2 Plantlets rooting induction of Phytolacca acinosa Roxba.培養(yǎng)基誘導生根的正面培養(yǎng)照片；b.表示培養(yǎng)基誘導生根的底部照片a.A positive photo of rooting induction in medium No.17； b.A bottom photo of rooting induction in medium No.17

3 討論

本試驗進行了商陸外植體的篩選、愈傷組織誘導、叢生芽分化和生根誘導等。試驗結果表明，以頂芽和幼莖作為外植體誘導產(chǎn)生愈傷組織質(zhì)量最佳，其出愈時間早，誘導愈傷組織的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2.4-D 0.5 mg/L，誘導率達到100%；叢生芽只能從以頂芽產(chǎn)生的愈傷組織中分化出來，叢生芽分化培養(yǎng)基為 MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.25 mg/L，誘導率達98%；生根培養(yǎng)基以1/2 MS+NAA 0.3 mg/L為宜，誘導率是100%。

本試驗在誘導愈傷組織的培養(yǎng)基中添加6-BA和2.4-D，在適宜的濃度范圍內(nèi)可以誘導產(chǎn)生良好的愈傷組織，而2.4-D與KT、6-BA組合也能誘導愈傷組織，與吳豪杰等人[17]所用6-BA 2.0 mg/L+IBA0.4 mg/L不同，而高利臣等[18]主要以6-BA、GA3和 LH的組合以及6-BA、IBA和 LH的組合，張麗珍等[19]得出的最佳葉片誘導愈傷組織培養(yǎng)基是IBA2 mg/L+2,4-D 3 mg/L，鄒利娟等[20]誘導愈傷組織培養(yǎng)基為MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 1.0 mg/L；叢生芽的分化與高利臣等[21]選用的外植體莖尖有相似之處，但適宜芽分化培養(yǎng)基存在差異。

在研究中我們還發(fā)現(xiàn)，誘導愈傷組織分化時，培養(yǎng)溫度不宜高于25 ℃，或低于20 ℃。溫度過高誘導出來的愈傷組織容易玻璃化，溫度過低出愈時間推遲。此外，由于商陸外植體本身含有較多的酚類物質(zhì)，在愈傷組織誘導過程中易發(fā)生褐化現(xiàn)象，特別是幼莖、莖節(jié)和葉柄作為外植體時更易產(chǎn)生褐化現(xiàn)象，所以在接入到芽分化培養(yǎng)基時需要將褐化部分切除。

此外，幼莖、葉柄均可誘導出生長狀況良好的愈傷組織，但是筆者在本試驗中發(fā)現(xiàn)只有頂芽誘導的愈傷組織才能有叢生芽的分化，推測可能是頂芽產(chǎn)生了特定的植物激素促進了愈傷組織叢生芽的分化，這一推測有待進一步驗證。