日本乙型腦炎病毒強(qiáng)、弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2A和NS1-NS2A誘導(dǎo)小鼠CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的研究

楊 偉，韋冠東,2，湯德元*，曾智勇，黃 濤，王 彬，胡玲玲，龍冬梅，黃秋涵，廖曉糠，田紅宇

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)明德學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

日本乙型腦炎(Japanese encephalitis, JE)是由黃病毒科(Flaviridae)黃病毒屬(Flavivitus)日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的一種危害嚴(yán)重的自然疫源性、蟲媒性人獸共患病[1]。豬是JEV重要的儲(chǔ)存宿主與擴(kuò)增宿主，感染JEV的豬群，大多不會(huì)死亡，多表現(xiàn)為生殖障礙。病豬多出現(xiàn)高熱，精神沉郁或有神經(jīng)癥狀，食欲減退，有的出現(xiàn)后肢麻痹、視力減退、擺頭、亂沖撞等[2]。豬JE是引起豬繁殖障礙的主要原因之一[3]，該病雖對(duì)母豬的致死率不高，但可引起懷孕母豬突然發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎或木乃伊胎，公豬感染后睪丸出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)，多為單側(cè)性，初期腫脹，有熱痛感，數(shù)日后炎癥消退，睪丸萎縮變硬，性欲減退，精液帶毒，失去配種能力[4-5]，造成公豬不育，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損害[6]。JE還嚴(yán)重威脅人類健康[7]。

JEV的基因組由10 976個(gè)核苷酸組成，長(zhǎng)約10.9 kb的單股正鏈RNA，其基因結(jié)構(gòu)為5′端有帽狀結(jié)構(gòu)，3′端無(wú)PolyA結(jié)構(gòu)[8]，5′端和3′端是病毒的非編碼區(qū)，兩個(gè)非編碼區(qū)之間組成一個(gè)開放閱讀框(ORF)為RNA編碼區(qū)，編碼一條由3 432個(gè)氨基酸組成的多蛋白前體，編碼順序?yàn)椋?′-C-PrM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′。該多蛋白前體經(jīng)蛋白酶(NS3)切割加工成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[核衣殼蛋白(C)、膜蛋白(PrM/M)、包膜糖蛋白(E)]和7個(gè) 非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)[9]。NS1蛋白可能參與病毒復(fù)制的早期階段以及病毒組裝和釋放，是主要的抗原成分之一，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性體液免疫反應(yīng)[9]。NS1蛋白的單克隆抗體可產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫，相關(guān)的動(dòng)物試驗(yàn)表明，NS1蛋白能夠在致死性JEV的攻擊下保護(hù)動(dòng)物，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較好的保護(hù)力[10]，有報(bào)道稱同時(shí)分別注射含NS1基因質(zhì)粒和E基因質(zhì)粒的免疫效果明顯高于僅免疫E蛋白基因質(zhì)粒[11]，NS1基因和E基因聯(lián)合表達(dá)質(zhì)粒免疫效果明顯優(yōu)于僅免疫E蛋白基因質(zhì)粒[9]。NS2A相對(duì)分子質(zhì)量約為17 ku，是參與RNA復(fù)制的小分子疏水膜蛋白，它順勢(shì)切割NS1-NS2A連接處，并參與病毒復(fù)制復(fù)合物的形成，同時(shí)在病毒的組裝和釋放上也起到至關(guān)重要的作用，它能通過(guò)抑制IFN信號(hào)通路和抑制宿主PKR途徑從而調(diào)節(jié)宿主的抗病毒反應(yīng)[12]。

JEV不同毒株免疫原性有所不同[13]，本研究通過(guò)JEV強(qiáng)、弱毒株接種BHK-21細(xì)胞分析其細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的差異，并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)免疫健康小鼠，通過(guò)JEV抗體檢測(cè)和小鼠外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞含量檢測(cè)，比較強(qiáng)、弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白的免疫增強(qiáng)效果，分析強(qiáng)、弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2A和NS1-2A真核表達(dá)差異，尋找JEV的非結(jié)構(gòu)蛋白與其致病機(jī)制的關(guān)系，以期為JE疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 引物

JEV貴州分離株(JEV Guizhou株，KC915016)，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存；JEV疫苗(成都生物制品研究所生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：201606A081-2)，由貴州大學(xué)校醫(yī)院贈(zèng)送；BHK-21細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室傳代保存；Top10感受態(tài)細(xì)胞，由貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)試驗(yàn)中心保存；RNA抽提試劑盒、內(nèi)切酶BamHⅠ、內(nèi)切酶XhoⅠ及PfuDNA聚合酶，均購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；X-gal、IPTG，購(gòu)自Solarbio公司；豬日本乙型腦炎病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自武漢科前生物工程有限公司；JEV多克隆抗體，為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所惠贈(zèng)；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的JEV SA14株(登錄號(hào)：U14163)、SA14-14-2(登錄號(hào)：AF315119) 和JEV GZ株(登錄號(hào)：KC915016)的NS1、NS2A和NS1-2A基因序列，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)6對(duì)特異性引物(表1)，并分別在引物的5′端設(shè)計(jì)BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，PAGE級(jí)，OD值為2.0，預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)分別為1 245、492、1 737 bp。

表1 JEV 強(qiáng)弱毒株的NS1、NS2A和NS1-2A基因引物核苷酸序列

r.弱毒株；q.強(qiáng)毒株

r. Attenuated strain; q. Virulent strain

1.3 細(xì)胞接毒及總RNA的提取

待BHK-21細(xì)胞貼壁形成單層時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，分別取0.5 mL處理好的本實(shí)驗(yàn)室保存的JEV GZ株的病毒上清和JEV疫苗懸液分別接種BHK-21細(xì)胞，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每間隔20 min輕輕振搖1 次，接毒1 h后輕輕吸去接種液體后，加入5 mL細(xì)胞維持液，待細(xì)胞出現(xiàn)75%細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)時(shí)，收集病毒于-80 ℃反復(fù)凍融3次 ，按Invitrogen公司的TRIzol LS?Reagent試劑盒操作說(shuō)明書提取總RNA。

1.4 目的基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

采用高保真酶(Pfu)以提取的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，參照OMEGA公司膠回收試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行目的基因的回收純化后，再克隆入pMD19-T Simple載體，陽(yáng)性重組質(zhì)粒菌液送Invitrogen公司測(cè)序。將測(cè)序正確的pMD19-T Simple-NS1r、pMD19-T Simple-NS2Ar、pMD19-T Simple-NS1-2Ar和pMD19-T Simple-NS1q、pMD19-T Simple-NS2Aq、pMD19-T Simple-NS1-2Aq陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別與pcDNA3.1(+)線性片段加入T4 DNA Ligase 16 ℃連接至少12 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選出白色陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定及雙酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒菌液送Invitrogen公司測(cè)序。

1.5 動(dòng)物免疫試驗(yàn)

1.5.1 小鼠的分組及免疫程序 選取90只4～5周 齡BALB/c小鼠，隨機(jī)分成9組，每組10只，按照指定的免疫方法和免疫程序進(jìn)行免疫(質(zhì)粒含量為1 μg·μL-1)：第一組注射pcDNA3.1(+)-NS1r 100 μL·只-1，第二組注射pcDNA3.1(+)-NS2Ar 100 μL·只-1，第三組注射pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar 100 μL·只-1，第四組注射pcDNA3.1(+)-NS1q 100 μL·只-1，第五組注射pcDNA3.1(+)-NS2Aq 100 μL·只-1，第六組注射pcDNA3.1(+)-NS1-2Aq 100 μL·只-1，第七組注射JEV減毒活疫苗 100 μL·只-1，第八組注射pcDNA3.1(+)空載體100 μL·只-1，第九組注射生理鹽水100 μL·只-1，每次免疫間隔兩周，在一免前、二免前、三免前及三免后三周，分離血清，-20 ℃保存。

1.5.2 免疫小鼠血常規(guī)和T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè) 小鼠末次免疫三周后，每組隨機(jī)挑選5只小鼠采集抗凝血，送貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院測(cè)血常規(guī)，進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)。于5 mL流式管中，先加入10 μL Rat Anti-Mouse CD3-SPRD，10 μL Rat Anti-Mouse CD4/L3T4-FITC，10 μL Rat Anti-Mouse CD8a/Ly-2-PE，再取50 μL抗凝血，旋渦振蕩混勻，室溫避光15 min后加入1.0 mL紅細(xì)胞溶解液，輕彈管壁并上下顛倒離心管3次后避光5 min ，再加入1 mL PBS，1 000 r·min-1離心5 min， 吸取PBS和紅細(xì)胞的混合液至流式管劃線處；旋渦振蕩混勻后，用FACS檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞，根據(jù)血常規(guī)檢測(cè)的結(jié)果計(jì)算出CD4+、CD8+細(xì)胞在每立方毫米血液中的相對(duì)數(shù)，所得數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件和Microsoft Excel 2000軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)酶切鑒定

將構(gòu)建的6種真核表達(dá)重組質(zhì)粒用BamHⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，6種真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-NS1r、pcDNA3.1(+)-NS1q、pcDNA3.1(+)-NS2Ar、pcDNA3.1(+)-NS2Aq、pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1-2Aq的雙酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期目的DNA片段的大小相符(圖1A～F)。

將雙酶切鑒定符合預(yù)期結(jié)果的重組質(zhì)粒送Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果序列與pMD19-T Simple載體的測(cè)序結(jié)果相同，表明乙型腦炎強(qiáng)、弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2A和NS1-2A真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒在BHK-21細(xì)胞中的表達(dá)

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將成功構(gòu)建的6個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后24、48和72 h用間接免疫熒光染色法檢測(cè)真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)情況，結(jié)果在24 h即可檢測(cè)到特異熒光，可維持到72 h(圖2)。

M1. DL15000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2. DL2000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.對(duì)照；2.質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；A. pcDNA3.1(+)-NS1r；B. pcDNA3.1(+)-NS1q；C. pcDNA3.1(+)-NS2Ar；D. pcDNA3.1(+)-NS2Aq；E. pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar；F. pcDNA3.1(+)-NS1-2AqM1. DL15000 marker； M2. DL2000 marker；1.Control；2.The result of double digestion of plasmid；A. pcDNA3.1(+)-NS1r；B. pcDNA3.1(+)-NS1q；C. pcDNA3.1(+)-NS2Ar；D. pcDNA3.1(+)-NS2Aq；E. pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar；F. pcDNA3.1(+)-NS1-2Aq圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果Fig.1 The double digestion results of recombinant plasmids

A．陰性對(duì)照(24 h)；B.pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；C.pcDNA3.1(+)-NS1r轉(zhuǎn)染(24 h)；D.pcDNA3.1(+)-NS1q轉(zhuǎn)染(24 h)；E. pcDNA3.1(+)-NS2Ar轉(zhuǎn)染(24 h)；F. pcDNA3.1(+)-NS2Aq轉(zhuǎn)染(24 h)；G. pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar轉(zhuǎn)染(24 h)；H. pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar轉(zhuǎn)染(24 h)A. Control group (24 h); B.pcDNA3.1 (+)-null plasmid transfection; C.pcDNA3.1 (+)-NS1r transfection (24 h); D.pcDNA3.1 (+)-NS1q transfection (24 h); E. pcDNA3.1 (+)-NS2Ar transfection (24 h); F. pcDNA3.1 (+)-NS2Aq transfection (24 h); G. pcDNA3.1 (+)-NS1-2Ar transfection (24 h); H. pcDNA3.1 (+)-NS1-2Ar transfection (24 h)圖2 間接免疫熒光染色檢測(cè)構(gòu)建的6種真核表達(dá)質(zhì)粒在BHK-21細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.2 Expression of six constructed eukaryotic expression plasmids in BHK-21 cells by indirect immunofluorescence staining

轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞后24 h，收集細(xì)胞抽提總RNA，進(jìn)行RT-PCR，電泳檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)果(圖3、圖4)顯示擴(kuò)增出目的條帶，且pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的RT-PCR結(jié)果均為陰性，證實(shí)了真核表達(dá)質(zhì)粒在BHK-21細(xì)胞中得到表達(dá)。

1.陰性對(duì)照；2.pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；3.pcDNA3.1(+)-NS1-NS2Ar轉(zhuǎn)染細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4.pcDNA3.1(+)-NS2Ar轉(zhuǎn)染細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5. pcDNA3.1(+)-NS1r轉(zhuǎn)染細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M. DL2000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.Control group；2. pcDNA3.1(+)tranfected cells RT-PCR product；3. pcDNA3.1(+)-NS1-NS2Ar tranfected cells RT-PCR product；4. pcDNA3.1(+)-NS2Ar tranfected cells RT-PCR product；5. pcDNA3.1(+)-NS1r tranfected cells RT-PCR product；M. DL2000 marker圖3 弱毒株轉(zhuǎn)染細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 SA14-14-2 strain RT-PCR results of tranfect cells

2.3 免疫小鼠血常規(guī)和T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)

圖5的檢測(cè)結(jié)果顯示3個(gè)對(duì)照組與6個(gè)免疫組CD4+細(xì)胞的變化情況：與生理鹽水組和空載體組相比較，6個(gè)免疫組均可以極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)增加CD4+細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量；與JEV疫苗組相比，6個(gè)免疫組除弱毒組NS2A蛋白增加CD4+細(xì)胞的數(shù)量略高于疫苗組外，其余各組均略低于疫苗組。強(qiáng)、弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白重組真核質(zhì)粒同組間比較對(duì)細(xì)胞免疫CD4+細(xì)胞的影響：強(qiáng)、弱毒株NS1免疫組和NS1-2A免疫組，均是強(qiáng)毒株非結(jié)構(gòu)蛋白免疫組略高于弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白免疫組，其中強(qiáng)、弱毒株NS1免疫組差異顯著(P<0.05)；強(qiáng)、弱毒株NS2A免疫組，弱毒株免疫組增加CD4+細(xì)胞的數(shù)量極顯著(P<0.01)高于強(qiáng)毒株免疫組。

大寫上標(biāo)表示與相應(yīng)組比較差異極顯著(P<0.01)；小寫上標(biāo)表示與相應(yīng)組比較差異顯著(P<0.05)Marked with capital letter superscript means P<0.01；Marked with lowercase means P<0.05圖5 免疫BALB/c小鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD3+CD4+的變化Fig.5 The change of CD3+CD4+ cells in immunized BALB/c mice

圖6的檢測(cè)結(jié)果顯示3個(gè)對(duì)照組與6個(gè)免疫組CD8+細(xì)胞的變化情況：與生理鹽水組和空載體組相比，6個(gè)免疫組均可增加CD8+細(xì)胞的數(shù)量(顯著性見(jiàn)圖6)；與JEV疫苗組相比6個(gè)免疫組均略低于疫苗組增加CD8+細(xì)胞的數(shù)量(顯著性見(jiàn)圖6)。強(qiáng)、弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白重組真核質(zhì)粒同組間比較對(duì)細(xì)胞免疫CD8+的影響：強(qiáng)、弱毒株NS1免疫組、NS2A免疫組和強(qiáng)、弱毒株NS1-2A免疫組，均是強(qiáng)毒株非結(jié)構(gòu)蛋白免疫組略高于弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白免疫組(P>0.05)。

3 討 論

為檢測(cè)外源基因的表達(dá)情況，本試驗(yàn)分別采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的6種真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于BHK-21細(xì)胞中，并分別提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的總RNA，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在24 h分別檢測(cè)到NS1、NS2A和NS1-2A的特征條帶，表明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，通過(guò)間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)真核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)情況，在轉(zhuǎn)染后36 h 構(gòu)建的6種乙型腦炎病毒強(qiáng)、弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒呈現(xiàn)出特異熒光，pcDNA3.1(+)空載體組合對(duì)照組沒(méi)有檢測(cè)到特異性熒光，證明了pcDNA3.1(+)-NS1r、pcDNA3.1(+)-NS2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1q、pcDNA3.1(+)-NS2Aq和pcDNA3.1(+)-NS1-2Aq基因在BHK-21細(xì)胞中能夠表達(dá)。

大寫上標(biāo)表示與相應(yīng)組比較差異極顯著(P<0.01)；小寫上標(biāo)表示與相應(yīng)組比較差異顯著(P<0.05)Marked with capital letter superscript means P<0.01；Marked with lowercase means P<0.05圖6 免疫BALB/c小鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD3+CD8+的變化Fig.6 The change of CD3+CD8+ cells in immunized BALB/c mice

本試驗(yàn)采用間接ELISA方法檢測(cè)體液免疫水平，結(jié)果構(gòu)建的重組真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠后未能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的體液免疫。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，重組病毒中NS1蛋白的有效表達(dá)、外泌及其誘生的保護(hù)性免疫，依賴于NS1上有疏水信號(hào)序列及下游至少70%NS2A蛋白的協(xié)同[14]，在沒(méi)有NS2A蛋白的存在下，NS1蛋白可能不能誘生其保護(hù)性免疫機(jī)制；NS2A蛋白參與病毒復(fù)制復(fù)合物的形成，同時(shí)在病毒的組裝和釋放上也起到至關(guān)重要的作用[12]，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道證明其可以單獨(dú)誘生機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫；在無(wú)NS2A蛋白存在的情況下，NS1-NS2A連接處無(wú)法被切割，則在NS2A蛋白協(xié)同下使NS1蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的機(jī)制可能無(wú)法激活，故聯(lián)合蛋白無(wú)法誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的體液免疫。構(gòu)建的重組真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠后未能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的體液免疫，其原因可能是表達(dá)的蛋白不能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，或者是蛋白表達(dá)量過(guò)低而與抗原結(jié)合量不足，導(dǎo)致間接ELISA無(wú)法檢測(cè)出，具體原因還需進(jìn)一步研究。

T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量和比例的動(dòng)態(tài)平衡是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其調(diào)節(jié)機(jī)制并不十分清楚，而CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞的失調(diào)是許多疾病的主要表現(xiàn)特征。CD4+是輔助性T細(xì)胞表面的標(biāo)志分子，一般認(rèn)為CD4+Th細(xì)胞可以分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ等細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)和增強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答；CD8+T細(xì)胞是殺傷性T細(xì)胞表面的標(biāo)志分子，包括抑制性T淋巴細(xì)胞和殺傷性T淋巴細(xì)胞，可以分泌抑制因子，抑制CTL細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。兩種作用迥異的T淋巴細(xì)胞借其相互拮抗作用調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過(guò)程，以保持免疫功能的平衡。CD3分子能表達(dá)于全部T細(xì)胞上，是T細(xì)胞共同的表面標(biāo)志。根據(jù) CD4和CD8可將T細(xì)胞分成兩個(gè)重要亞群。CD4存在于輔助性T細(xì)胞(TH)表面，而 CD8主要存在于細(xì)胞毒性 T細(xì)胞(CTL)表面。CD4+/CD8+比例高則機(jī)體自身免疫功能相對(duì)強(qiáng)，低則相反。本試驗(yàn)結(jié)果表明：pcDNA3.1(+)-NS1r、pcDNA3.1(+)-NS2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar和pcDNA3.1(+)-NS1q、pcDNA3.1(+)-NS2Aq、pcDNA3.1(+)-NS1-2Aq免疫小鼠可以極顯著或顯著增加CD4+細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量；同時(shí)CD8+細(xì)胞相對(duì)數(shù)量也有所增加，說(shuō)明構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒誘發(fā)了機(jī)體的細(xì)胞免疫。用pcDNA3.1(+)免疫小鼠對(duì)其CD4+、CD8+細(xì)胞的數(shù)量(與空白對(duì)照組相比較)有增強(qiáng)作用，這可能是因?yàn)閜cDNA3.1(+)含有以非甲基化的CpG為核心的免疫刺激序列可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。強(qiáng)、弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白重組真核質(zhì)粒同組間比較對(duì)細(xì)胞免疫CD4+的影響為：NS1免疫組和NS1-2A免疫組均是強(qiáng)毒株非結(jié)構(gòu)蛋白免疫組略高于弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白免疫組，其中強(qiáng)、弱毒株NS1免疫組差異顯著(P<0.05)。NS2A免疫組弱毒株免疫組增加CD4+細(xì)胞的數(shù)量略高于強(qiáng)毒株免疫組。強(qiáng)、弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白重組真核質(zhì)粒同組間比較對(duì)細(xì)胞免疫CD8+的影響為：NS1免疫組、NS2A免疫組和強(qiáng)、弱毒株NS1-2A免疫組，均是強(qiáng)毒株非結(jié)構(gòu)蛋白免疫組略高于弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白免疫組。關(guān)于JEV的結(jié)構(gòu)蛋白原核表達(dá)和真核表達(dá)的相關(guān)研究較多，非結(jié)構(gòu)蛋白中NS1基因的研究已有很多的成果，但除NS1非結(jié)構(gòu)蛋白基因外，其他的非結(jié)構(gòu)蛋白基因研究較少[7, 15-21]，這些非結(jié)構(gòu)蛋白的功能對(duì)機(jī)體的作用有許多機(jī)制不清楚，深入了解乙腦病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的作用對(duì)于乙腦疫苗的研制和乙腦的治療有重要意義。

4 結(jié) 論

綜合分析數(shù)據(jù)顯示，JEV強(qiáng)毒株非結(jié)構(gòu)蛋白所產(chǎn)生的細(xì)胞免疫略優(yōu)于弱毒株非結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生的細(xì)胞免疫，但差異不明顯。