馬MC1R基因多態(tài)位點(diǎn)與毛色相關(guān)性分析

趙珊珊，肖 寧，李志鵬，潘慶杰，李 楨，石德順，劉慶友*

(1.廣西大學(xué),亞熱帶生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530004；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島 266109)

馬的毛色是根據(jù)覆蓋馬全身的短毛以及鬃毛、鬣毛、尾毛和距毛的顏色來綜合評定[1]。馬的毛色是馬品種鑒定的重要參考之一，如荷蘭的弗里斯蘭馬，其純種馬極少具有除黑毛以外的其他雜色毛，在進(jìn)行血統(tǒng)登記時(shí)僅允許前額有小星。另外馬的毛色還與馬的用途、營養(yǎng)健康狀況、性格及行為有關(guān)[2]。在現(xiàn)代馬場馬術(shù)用馬交易中，毛色較好的馬匹其價(jià)格也相應(yīng)會(huì)高不少。當(dāng)馬作為寵物和游樂場用馬，特殊的毛色更能夠得到消費(fèi)者的喜愛，從而給馬主帶來更好的效益。馬的毛色形成主要與酪氨酸源性色素有關(guān)，其代表是黑色素及其衍生物[3]。黑色素主要包括真黑色素和褐黑色素兩大類，黑色素的種類和含量不同，動(dòng)物毛發(fā)的顏色也會(huì)不同，真黑色素和褐黑色素比例決定了毛色的深淺程度[4]。多種基因調(diào)控黑色素的產(chǎn)生，外界環(huán)境對黑色素的產(chǎn)生也具有明顯影響[5]。黑色素皮質(zhì)素受體1(melanocortin 1 receptor，MC1R)基因是控制黑色素形成的主要基因之一[6]。MC1R在哺乳動(dòng)物中由E位點(diǎn)(extension locus)編碼，是黑色素皮質(zhì)受體(melanocortin receptors，MCRs)家族成員之一。MC1R只有一個(gè)編碼區(qū)，是編碼G蛋白耦合受體中最小的，是具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)[7]。馬MC1R基因位于3號(hào)染色體，全長1 721 bp，外顯子長954 bp，編碼317個(gè)氨基酸。

本研究采用DNA測序和PCR-RFLP方法對馬的MC1R基因多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行檢測，并進(jìn)行毛色相關(guān)性分析，為馬毛色育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究從山東青島、廣西柳州和南寧共6個(gè)馬場，隨機(jī)采集10種毛色(分別為黑毛、騮毛、栗毛、白毛、青毛、黑毛白花、騮毛白花、栗毛白花、斑毛、沙毛)涉及15個(gè)品種共132匹馬頸靜脈血，血樣于-80 ℃ 條件下保存。

所采集樣本中單色毛共有88匹馬，復(fù)色共有44匹馬，比例較大的4種毛色依次是騮毛(48匹)、栗毛(28匹)、青毛(24匹)和騮白花毛(13匹)(表1)。

1.2 主要器材及試劑

醫(yī)用一次性真空抗凝(EDTA)采血管購于江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司；ExTaqI購于NEB(北京)有限公司；金牌Mix(green)PCR預(yù)混液購于北京擎科生物科技有限公司；全血基因組DNA提取試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 全血基因組DNA的提取 按照全血基因組DNA提取試劑盒試驗(yàn)說明提取馬全血基因組DNA，并溶于DNA溶解液中，用紫外分光光度儀檢測全部樣本DNA溶液純度(OD260 nm/OD280 nm=1.8～2.0)和濃度，測得樣本均能夠滿足試驗(yàn)要求，-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的家馬MC1R基因序列(GenBank登錄號(hào)：AF288357.1)，設(shè)計(jì)兩對引物擴(kuò)增MC1R序列，Primer 1引物擴(kuò)增片段包含現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的c.C248T 和c.G250A突變位點(diǎn)，Primer 2引物擴(kuò)增片段包含MC1R的完整外顯子。引物Primer 1和Primer 2均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表2。

表2 MC1R引物序列

1.3.3 PCR擴(kuò)增、PCR-RFLP及測序 Primer 1 PCR 反應(yīng)體系(50 μL)：45 μL金牌Mix，Primer 1上、下游引物各2 μL，DNA模板1 μL。反應(yīng)條件：98 ℃ 預(yù)變性2 min；98 ℃變性15 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸3 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓120 V，時(shí)間為30 min，凝膠成像儀拍照。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至昆明擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。采用DNASTAR.Laser-gene v7.1軟件的SeqMan工具對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，BLAST比對，并分析其多態(tài)性。

Primer 2 PCR 反應(yīng)體系B(25 μL)：22 μL金牌Mix，Primer 2上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃ 變性15 s，68 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓為120 V，時(shí)間為30 min，凝膠成像儀拍照。

RFLP:利用限制性內(nèi)切酶TaqⅠ消化Primer 2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，酶切體系：PCR產(chǎn)物5 μL，內(nèi)切酶TaqⅠ 0.5 μL，buffer 2 μL，ddH2O 12.5 μL，65 ℃ 30 min。酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓140 V，時(shí)間20 min，凝膠成像儀拍照。

從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中得到公開數(shù)據(jù)，登錄號(hào)為驢KJ126713，斑馬JF718957，普氏野馬JF718951，家馬AF288357，亞洲貘JF718949，蘇門答臘犀牛JF718943，牛BTU39469，印度水牛KR869113，駱駝KU179868，羊駝EU220010，山羊FM212940，綿羊KF198511，野豬AY916521，家豬KF242528，家兔FN658679，大猩猩AY205088，智人AY225228。應(yīng)用軟件MEGA 5用相鄰連接方法(NJ，neighbor joining)建立MC1R系統(tǒng)發(fā)育樹。

本研究所用主要分析軟件和網(wǎng)站：PCR引物設(shè)計(jì)軟件為Oligo 6；同源性分析軟件為DNAstar；凝膠成像圖像處理軟件為Image Lab；預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)三維圖像網(wǎng)站為https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/；蛋白結(jié)構(gòu)三維圖像分析處理軟件為PyMOL；蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測網(wǎng)站為https://swissmodel.expasy.org/,http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/，https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html，https://web.expasy.org/protscale/。

乍一聽“平地一聲雷”這個(gè)菜名，我滿頭霧水，同時(shí)也感到非常好奇：什么樣的菜肴，會(huì)在餐桌上爆出雷一般的響動(dòng)呢？而且還是“平地一聲雷”——瞬間，便發(fā)生了奇異的變化！帶著這個(gè)疑問，我和朋友進(jìn)了南京一家知名的飯店，專門點(diǎn)了這道“平地一聲雷”！

2 結(jié) 果

2.1 馬MC1R基因CDS擴(kuò)增與測序分析

使用Primer1引物擴(kuò)增試驗(yàn)樣本的MC1R基因序列，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物(圖1)，結(jié)果顯示，1 200～2 000 bp之間有一條清晰的特異性條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段長度(1 247 bp)一致，符合后續(xù)試驗(yàn)的要求。

1～15. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M.DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；C.對照組1-15.PCR products；M.DNA marker III；C.Control group圖1 馬MC1R基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification of MC1R of horse

對132匹馬MC1R基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序分析發(fā)現(xiàn)，馬MC1R基因CDS存在兩處錯(cuò)義突變c.C248T和c.G250A，一處同義突變c.G102A。其中c.C248T由TCC突變?yōu)門TC，造成第83位氨基酸由極性親水絲氨酸變?yōu)榉菢O性疏水苯丙氨酸，該突變導(dǎo)致MC1R基因出現(xiàn)EE、Ee和ee 3種基因型(圖2 A、2B和2C)。錯(cuò)義突變c.G250A由GAC突變?yōu)锳AC，其位點(diǎn)由天冬氨酸變?yōu)樘於０?，該突變?dǎo)致出現(xiàn)MC1R基因型eea，測序峰圖結(jié)果見圖2D。圖2E為c.102野生型測序峰圖，圖2F為同義突變c.G102A的測序峰圖。

2.2 MC1R基因c.C248T位點(diǎn)的 PCR-RFLP分型驗(yàn)證

測序分析發(fā)現(xiàn)，MC1R基因在外顯子發(fā)生的c.C248T 突變產(chǎn)生了TaqⅠ酶切位點(diǎn)，因此可依據(jù)酶切試驗(yàn)對馬MC1R基因的c.C248T位點(diǎn)的基因分型進(jìn)行驗(yàn)證。設(shè)計(jì)特異性引物Primer 2擴(kuò)增獲得試驗(yàn)樣本的MC1R基因片段，通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示，700～900 bp之間有一條清晰的特異性條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段(740 bp) 長度一致。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行TaqⅠ酶切，通過2%瓊脂糖凝膠電泳得到3種基因型(圖3)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，樣本中EE基因型有31個(gè)，Ee基因型有66個(gè)，ee基因型有35個(gè)，與CDS測序結(jié)果不一致，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，在出現(xiàn)c.G250A后，不再構(gòu)成TaqⅠ酶切位點(diǎn)，因此17、82和102號(hào)3匹馬樣本DNA的PCR擴(kuò)增片段在PCR-RFLP試驗(yàn)中不能全部被TaqⅠ酶切開(圖4)。

A.EE; B.Ee; C.ee; D.eea; E.c.102野生型; F.c.G102A同義突變A.EE; B.Ee; C.ee; D.eea; E. c.102 wild type; F.c.G102A synonymous mutation圖2 MC1R基因多態(tài)位點(diǎn)測序峰圖Fig.2 Gene sequencing of polymorphic sites in MC1R

C.對照組；M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。EE型. 1,5,7,13,16；Ee型. 2,3,6,8,9,12,14,15,17,19；ee型. 4,10,11,18C. Control group; M.DNA Marker II. EE. 1,5,7,13,16; Ee. 2,3,6,8,9,12,14,15,17,19; ee. 4,10,11,18圖3 MC1R基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR-RFLP結(jié)果Fig.3 PCR-RFLP results of PCR amplification products of MC1R

2.3 馬MC1R基因多態(tài)性與毛色相關(guān)性分析

根據(jù)測序統(tǒng)計(jì)132匹樣本基因型與毛色比例，Ee基因型的樣本數(shù)量最多，有63匹，基因型EE和ee的樣本數(shù)量相差不大，分別為31和35匹。騮毛馬、黑毛馬和騮白花毛馬的基因型為EE和Ee兩種。青毛馬、白毛馬在EE、Ee和ee 3種基因型中都有分布。栗毛馬和栗白花毛馬只有ee基因型；黑白花毛馬只有EE基因型；沙毛馬只有Ee基因型。另外，基因型eea包括2匹栗毛馬和1匹青毛馬。由此可知，在生產(chǎn)中若想獲得栗毛馬，其父母必須均攜帶MC1R等位基因e；如果其父母均不是栗毛且從未生產(chǎn)過栗毛后代，則需要對其基因型進(jìn)行鑒定，而兩匹栗毛馬的后代在不發(fā)生基因突變的情況下一定是栗毛馬。為進(jìn)一步比較分析，我們下載增加了Rieder等[8]和Wagner和Reissmann[9]、李蓓和芒來[10]等研究者公開發(fā)表的與本研究相關(guān)的數(shù)據(jù)后進(jìn)行整合統(tǒng)計(jì)分析(表3)。通過對MC1R基因外顯子c.C248T 位點(diǎn)產(chǎn)生的基因型和等位基因頻率的分析，X2適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，黑毛和騮毛馬的基因型分布差異極顯著(P<0.01)，在遺傳上出現(xiàn)了Hardy-Weinberg不平衡，E為優(yōu)勢等位基因；在栗色馬中未檢測到E等位基因，e為優(yōu)勢等位基因；青毛馬的該位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡；其他毛色數(shù)據(jù)量較小，未做進(jìn)一步分析；各毛色合計(jì)分析，在遺傳上處于Hardy-Weinberg平衡，且等位基因頻率相當(dāng)。

17、82、102號(hào)基因型為eea;16、90號(hào)基因型為ee；M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)17，82，102.eea；16，90.ee；M. DNA marker Ⅱ圖4 17、82、102號(hào)樣本Taq I酶切電泳Fig.4 The Taq I enzyme digestion electrophoresis of No.17,82,102 samples

2.4 馬MC1R基因蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

2.4.1 馬MC1R基因蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過在線網(wǎng)站預(yù)測馬MC1R基因編碼蛋白的氨基酸親、疏水性和二級結(jié)構(gòu)等蛋白基本信息，根據(jù)預(yù)測結(jié)果繪制得到馬MC1R蛋白二維結(jié)構(gòu)圖，發(fā)現(xiàn)馬的MC1R基因編碼蛋白突變位點(diǎn)主要位于第2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，靠近細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)(圖5)。

2.4.2 馬MC1R基因c.C248T突變結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 通過軟件處理預(yù)測同源模型后得到MC1R蛋白α螺旋細(xì)節(jié)圖(圖6)，因MC1R基因外顯子發(fā)生c.C248T錯(cuò)義突變導(dǎo)致MC1R第83位氨基酸由極性親水氨基酸變?yōu)榉菢O性疏水氨基酸(pro.S83F)，疏水作用力發(fā)生改變；發(fā)生突變后，與第83位氨基酸有氫鍵作用的氨基酸數(shù)量和位置發(fā)生變化，其與周邊氨基酸之間作用的氫鍵減少一個(gè)，即該處突變導(dǎo)致其與第三跨膜區(qū)的第127位氨基酸絲氨酸之間的氫鍵消失，致使與其作用的氫鍵只分布在本跨膜區(qū)。由此可以推測，該處突變可能導(dǎo)致第一跨膜區(qū)與第三跨膜區(qū)距離發(fā)生變化，影響MC1R蛋白整體結(jié)構(gòu)，從而使MC1R蛋白功能受到影響；另外，該處蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)維持力量的減弱，可能致使α螺旋結(jié)構(gòu)較之前松散，處于該突變之前的α螺旋結(jié)構(gòu)位置改變，有可能部分突出細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而引起MC1R蛋白功能發(fā)生變化。

2.4.3 馬MC1R基因c.G250A突變結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 在馬MC1R的CDS測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，有3個(gè)樣本在c.C248T的基礎(chǔ)上，在第250 bp處發(fā)生錯(cuò)義突變，由GAC變?yōu)锳AC，該突變導(dǎo)致MC1R第84位氨基酸由極性帶負(fù)電荷的天冬氨酸變?yōu)闃O性不帶電荷的天冬酰胺(pro.D84N)。通過PyMOL處理預(yù)測同源模型后得到MC1R蛋白α螺旋細(xì)節(jié)圖(圖7)，在第84位氨基酸發(fā)生突變后，與其相作用的氨基酸位置發(fā)生變化，新增了3個(gè)氫鍵分別作用在第一跨膜區(qū)的第56位氨基酸和第7跨膜區(qū)的第294位氨基酸；另外，在發(fā)生突變后，離子鍵作用力也發(fā)生了改變，側(cè)鏈由原來傾向于排列在蛋白質(zhì)表層與水發(fā)生反應(yīng)變?yōu)橹行园被?，不帶電荷?/p>

2.4.4 馬MC1R蛋白pro.S83F、pro.D84N突變結(jié)構(gòu)綜合預(yù)測分析 將MC1R蛋白野生型和pro.S83F、pro.D84N一起對比后發(fā)現(xiàn)，在出現(xiàn)pro.D84N后，第83、84位氨基酸與周圍氨基酸作用的氫鍵數(shù)量增加，氨基酸之間作用力復(fù)雜，與只出現(xiàn)pro.S83F相比較，與第三跨膜區(qū)的第127位氨基酸絲氨酸之間的氫鍵又出現(xiàn)，并且還增加了與第一跨膜區(qū)和第7跨膜區(qū)之間的作用(圖8)?？梢酝茰y，該處突變在新增的3個(gè)氫鍵的作用力下，有可能會(huì)縮小pro.S83F對MC1R蛋白整體結(jié)構(gòu)的影響。

2.5 MC1R基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析

3 討 論

本試驗(yàn)采用PCR-RFLP和DNA克隆技術(shù)研究了馬MC1R基因與毛色表型性狀的相關(guān)性，結(jié)果顯示，馬MC1R基因CDS 248和250 bp兩處發(fā)生非同義突變。在PCR-RFLP試驗(yàn)中，由于MC1R基因CDS 250 bp處發(fā)生非同義突變，造成該c.C248T酶切試驗(yàn)呈現(xiàn)假陰性結(jié)果，與Wagner和Reissmann[9]的報(bào)道相符。對馬MC1R多態(tài)性與馬毛色表型做統(tǒng)計(jì)分析得出，黑毛和騮毛馬具有EE和Ee兩種基因型，栗毛馬有ee和eea兩種基因型，青毛馬有EE、Ee、ee和eea4種基因型?；R是在原有底色上出現(xiàn)了白色斑塊[11-12]，因而MC1R基因型與其底色相同。該結(jié)果對馬的毛色分子育種提供了理論依據(jù)，對現(xiàn)代馬的毛色定向繁育具有重要指導(dǎo)意義。

圖中標(biāo)示的兩處為測序結(jié)果中出現(xiàn)突變的第83、84位氨基酸位置The pointed out spheres in the picture are the 83rd, 84th amino acids in the sequencing results圖5 馬MC1R 蛋白跨膜示意圖Fig.5 The MC1R transmembrane regions of horse

A.第83位氨基酸為色氨酸；B. 第83位氨基酸突變?yōu)楸奖彼酇.The 83rd amino acid is tryptophan; B. The 83rd amino acid is mutated to phenylalanine圖6 MC1R蛋白第83位氨基酸氫鍵圖Fig.6 Hydrogen bond diagrams of MC1R protein at the 83rd amino acid

A.第84位氨基酸為天冬氨酸；B. 第84位氨基酸突變?yōu)樘於０稟 .The 84th amino acid is aspartic acid; B.The 84th amino acid is mutated to asparagine圖7 MC1R蛋白第84位氨基酸氫鍵圖Fig.7 Hydrogen bond diagrams of MC1R protein at the 84th amino acid

A.野生型第83、84位氨基酸氫鍵圖；B. 第83位氨基酸突變?yōu)楸奖彼岷蟮?3、84位氨基酸氫鍵圖；C. 第83位氨基酸突變?yōu)楸奖彼?、?4位氨基酸突變?yōu)樘於０泛髿滏I圖A .Wild type 83rd, 84th amino acids hydrogen bond diagram; B. The 83rd, 84th amino acid hydrogen bond diagram when the 83rd amino acid is mutated to phenylalanine; C.The hydrogen bond diagram when the 83rd amino acid is mutated to phenylalanine, the 84th amino acid is mutated to asparagine圖8 MC1R蛋白第83、84位氨基酸氫鍵圖Fig.8 Hydrogen bond diagrams of MC1R protein at the 83rd and 84th amino acids

維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的非共價(jià)作用力主要有氨基酸的疏水作用、離子鍵、氫鍵、范得華力[13]。疏水作用力是蛋白與蛋白之間的主要作用力，影響蛋白之間的距離，在蛋白質(zhì)分子的表面還往往有凹槽，這種地方多是配體或酶的底物結(jié)合的部位，通常就是疏水區(qū)。離子鍵是氨基酸側(cè)鏈在生理pH條件下解離成帶電荷的基團(tuán)，與介質(zhì)水分子發(fā)生電荷-偶極之間的相互作用，形成排列有序的水化層，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象。蛋白質(zhì)α螺旋則主要靠鏈內(nèi)氫鍵作用力維持。在離子鍵與疏水作用力存在的情況下，范德華力作用相對較弱[14]。因此，氫鍵和疏水作用對蛋白結(jié)構(gòu)的影響較大。MC1R基因外顯子248 bp處突變位點(diǎn)位于 MC1R 蛋白第二轉(zhuǎn)運(yùn)膜的功能區(qū)域，推測可能導(dǎo)致α螺旋結(jié)構(gòu)和各跨膜區(qū)相對位置發(fā)生變化。從而影響到受體配對和轉(zhuǎn)移等功能，使受體細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度降低，而cAMP 能夠激活酪氨酸激酶促成絡(luò)氨酸酶的合成，該突變能夠?qū)е吕野彼崦傅暮铣蓽p少，從而使更多的酪氨酸產(chǎn)物多巴醌(DQ)變?yōu)镃ys-DOPA，即褐黑色素合成增多，真黑色素合成減少，從而形成栗色毛色表型[15-18]。

250 bp處突變位點(diǎn)使MC1R蛋白第83、84位氨基酸與周圍氨基酸的作用力加強(qiáng)，增加了因248 bp處突變而消失的氫鍵，因此可能縮小了248 bp突變對MC1R蛋白結(jié)構(gòu)的影響，因此推測，該基因型的馬毛色可能比基因型ee的馬毛色加深，這也同Wagner和Reissmann[9]的推測一致。在本試驗(yàn)中，未對發(fā)生G250A突變樣本個(gè)體的MC1R產(chǎn)生真黑素、褐黑素通路中相關(guān)產(chǎn)物表達(dá)量進(jìn)行研究，無法證明此推測。但是樣本中含有數(shù)個(gè)深栗色馬基因樣本，測序結(jié)果顯示并無c.G250A突變。另外，本研究中的一例栗毛西南馬基因型為ee，與黨珍等[19]研究發(fā)現(xiàn)的中國馬品種中栗毛馬基因型的試驗(yàn)結(jié)果不同。

根據(jù)GenBank公布的MC1R基因的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在現(xiàn)公布的2 257個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中人類所占比例最多，其次是牛、羊和小鼠，馬的則具有高度的保守性，只有2處多態(tài)位點(diǎn)。MC1R第二轉(zhuǎn)運(yùn)膜區(qū)為受體的關(guān)鍵區(qū)域，人、牛、小鼠、貓等哺乳動(dòng)物的毛色擴(kuò)展位點(diǎn)也位于此處[20-23]。KIT、ASIP基因?qū)γ硇鸵灿袥Q定性作用[24]，青毛馬的毛色與STX17和KIT有關(guān)[25-26]，PAX3、MITF與馬的白色及白色面積、分布有關(guān)[27]，TBX3對馬褐毛和非褐毛的形成具有影響[28]。另外，不同毛色馬個(gè)體之間的遺傳背景不同，馬所處的生活環(huán)境也會(huì)影響基因型的表型度和外顯率，可能導(dǎo)致相同的基因型可以產(chǎn)生不同的毛色表型。因此，馬的品種、體重、性別、生活環(huán)境以及樣本采集范圍的局限性差異增加了相關(guān)分析的復(fù)雜性。

近年來，關(guān)于馬的毛色與馬其他性狀相關(guān)性的研究不斷深入，Hauswirth等[29]發(fā)現(xiàn)，有飛濺白毛的馬在聽力、視覺上有缺陷。Stachurska等[30]對多種毛色的純血馬及阿拉伯馬進(jìn)行了 QTL研究，發(fā)現(xiàn)馬的亮毛色與E位點(diǎn)有相關(guān)性，他還發(fā)現(xiàn)，在毛色與運(yùn)動(dòng)能力無顯著關(guān)聯(lián)的情況下，人們更喜歡繁育騮毛與栗毛馬[31]。2016年Jacobs等[32]最新研究發(fā)現(xiàn)，毛色影響馬的行為與性格。在馬術(shù)運(yùn)動(dòng)日益發(fā)展的形勢下，馬的毛色與其性能及性格的相關(guān)性影響著馬的育種觀念，這方面的研究將越來越得到人們的重視并成為馬毛色研究的新方向。

本研究中，基因型EE樣本與家馬、普氏野馬相似性最高，而樣本基因型為ee和eea則與之相似性低一些。

在進(jìn)化過程中，馬在第四紀(jì)更新世時(shí)期最先出現(xiàn)的毛色主要是騮色，到公元前5000年以后出現(xiàn)黑毛馬，直到公元前2000年左右才出現(xiàn)了毛色更絢麗的栗毛、Tobiano和Sabino毛色的馬，因此在進(jìn)化史上，栗毛的112號(hào)和82馬比基因型為EE的騮毛馬在基因進(jìn)化樹上與家馬、普氏野馬都同源性低些。其次與樣本同源性較高的是斑馬和驢，在經(jīng)典分類學(xué)上，馬與斑馬、驢組成馬屬動(dòng)物，而驢與斑馬關(guān)系更近些。馬屬動(dòng)物與亞洲貘、蘇門答臘犀牛共同組成奇蹄目，與系統(tǒng)發(fā)育樹顯示內(nèi)容相吻合。

4 結(jié) 論

本研究采用PCR-RFLP和DNA克隆技術(shù)研究了馬MC1R基因與毛色表型性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)馬MC1R基因外顯子存在3個(gè)SNPs，c.G102A為同義突變，錯(cuò)義突變c.C248T產(chǎn)生等位基因e，錯(cuò)義突變c.G250A產(chǎn)生等位基因ea。騮毛馬、黑毛馬和騮毛白花毛馬均有基因型EE、Ee。青毛馬、白毛馬均有基因型EE、Ee、ee。栗毛馬和栗毛白花馬只有ee基因型；黑白花毛馬只有EE基因型；沙毛馬只有Ee基因型。黑毛和騮毛馬中，E為優(yōu)勢等位基因；在栗色馬中無E基因，e為優(yōu)勢等位基因基因。本研究結(jié)果表明，馬MC1R多態(tài)位點(diǎn)產(chǎn)生的不同基因型與馬的毛色存在相關(guān)性。本研究結(jié)果為應(yīng)用基因型對馬的毛色進(jìn)行定向選擇育種奠定了基礎(chǔ)。