基于LC-Q/TOF-MS代謝組學(xué)方法篩選奶牛妊娠識(shí)別階段乳樣生物標(biāo)志物的研究

郭延生，陶金忠

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，銀川 750021)

在妊娠初期，孕體發(fā)出信號(hào)(類固醇激素或蛋白質(zhì))傳遞給母體后，母體隨即產(chǎn)生反應(yīng)以識(shí)別孕體的存在。由此母體與孕體建立密切聯(lián)系，促進(jìn)孕體進(jìn)一步發(fā)育，這一生理過(guò)程叫妊娠識(shí)別[1]。奶牛妊娠識(shí)別大約發(fā)生在授精后第15天，并且接納孕體的最晚時(shí)間必須早于第17天[2]，干擾素τ(interferon tau，INF-τ)是反芻動(dòng)物妊娠識(shí)別的關(guān)鍵信號(hào)[3]。孕體發(fā)育到囊胚期，滋養(yǎng)外胚層開(kāi)始分泌INF-τ，隨著囊胚的延伸，分泌量也不斷增加，孕體附著于子宮上皮即著床之前INF-τ含量達(dá)到峰值，著床之后其分泌量減退。它作為一種旁分泌因子，可以與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的相關(guān)受體結(jié)合，下調(diào)催產(chǎn)素受體表達(dá)，破壞 PGF2α脈沖釋放，使得黃體不被溶解，進(jìn)而維持孕酮分泌以維持妊娠[4]。但由于該細(xì)胞因子在血液中含量極低，因此很難作為早期妊娠診斷的指標(biāo)[5]。早期妊娠診斷對(duì)減少空懷率，提高繁殖效率具有十分重要的意義。目前常用血清或牛奶中孕酮、妊娠相關(guān)蛋白和直腸檢查進(jìn)行診斷[6-8]，但這些手段均在人工授精后35 d左右才能進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。因此探索在一個(gè)情期內(nèi)實(shí)現(xiàn)妊娠診斷已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。

除了INF-τ引起孕酮持續(xù)分泌是保障早期胚胎存活的重要原因外，國(guó)內(nèi)外研究還發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)也是調(diào)節(jié)子宮生理功能、促進(jìn)胚胎發(fā)展和提高妊娠率的重要因素之一[9-10]。在胚胎著床前，胚胎與母體之間已經(jīng)建立了營(yíng)養(yǎng)關(guān)系，即母血營(yíng)養(yǎng)，子宮滋養(yǎng)層可為胚胎提供大量葡萄糖以供其發(fā)展[11]。另外在著床前，由母體提供的氨基酸對(duì)胚胎的存活也至關(guān)重要[12]。研究還發(fā)現(xiàn)母體磷脂代謝也與早期妊娠相關(guān)[13]。母體代謝通路因妊娠時(shí)營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)而發(fā)生改變。但目前關(guān)于母體對(duì)妊娠早期的系統(tǒng)代謝應(yīng)答機(jī)制研究較少。因此，探索妊娠早期母體體內(nèi)代謝物或代謝組的變化情況，對(duì)回答母體對(duì)早期妊娠的應(yīng)答機(jī)制具有重要的科學(xué)意義，也可為建立新的早期妊娠診斷方法提供依據(jù)。

代謝組學(xué)(metabolomics) 是一種利用高通量、高靈敏度的現(xiàn)代分析技術(shù)研究生物體在被擾動(dòng)后，生物體液中的小分子代謝物的動(dòng)態(tài)變化，了解機(jī)體整體的生理狀態(tài)的一門(mén)新興學(xué)科。目前代謝組學(xué)常用的檢測(cè)技術(shù)有GC-MS、LC-MS和NMR，由于LC-MS具有高分辨率和靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)研究。近年來(lái)，代謝組學(xué)方法已成功應(yīng)用于奶牛疾病診斷和生理機(jī)制研究[14-15]。本試驗(yàn)采用高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC-Q/TOF-MS)代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)人工授精當(dāng)天和第17天奶牛乳樣代謝輪廓進(jìn)行模式識(shí)別，并篩選其差異代謝物。旨在尋找妊娠識(shí)別階段生物標(biāo)志物，為早期妊娠診斷方法提供新的思路和方法，也可為解答妊娠識(shí)別期奶牛應(yīng)答的機(jī)制提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-Q/TOF-MS儀 (Agilent,1290 Infinity LC, 6530 UHD and Accurate-Mass Q-TOF /MS)，分離色譜柱為C18色譜柱(Agilent, 100 mm×2.1 mm，1.8 μm)。乙睛(LC/MS級(jí)，Merck，Dannstadt，Gennany)，甲醇(HPLC級(jí)，Merck，Dannstadt，Gennany)，甲酸(CNW，Gennany)。其它試劑均為市售分析純。試驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

選擇寧夏某大型集約化奶牛場(chǎng)10頭2～3胎次體況相近的健康荷斯坦高產(chǎn)奶牛為試驗(yàn)對(duì)象，采用PGF2α同期發(fā)情后(注射兩次，間隔14 d)，采集發(fā)情當(dāng)天乳樣(A組)和人工授精后第17天乳樣(B組)，每組每份乳樣按組別+阿拉伯?dāng)?shù)字編號(hào)，即A組乳樣編號(hào)為A1～A10，B組乳樣編號(hào)為B1～B10。10頭 奶牛在授精45 d左右均被確診為成功妊娠，且在此期間無(wú)疾病發(fā)生。乳樣于-80 ℃保存，以備后續(xù)分析。

1.3 乳樣的預(yù)處理

乳樣常溫下解凍后，移液槍精準(zhǔn)移取100 μL樣本，移至1.5 mL的離心管，采用甲醇沉淀蛋白，其比例為樣本∶甲醇=1∶3，充分渦旋30 s，4 ℃，1 200 r·min-1離心15 min；小心取出離心管，移取200 μL上清液，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶。

1.4 LC-Q/TOF-MS分析

1.4.1 色譜分離條件 柱溫40 ℃；流速0.35 mL·min-1；流動(dòng)相組成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。進(jìn)樣量為4 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃，壓力范圍800 bar。

1.4.2 質(zhì)譜條件

1.4.2.1 正離子模式：以氮?dú)庾鳛殪F化、錐孔氣；飛行管檢測(cè)模式V型。正離子模式條件：毛細(xì)管電壓(capillary voltage)4 kV、錐孔電壓(sampling cone)35 kV、離子源溫度(source temperature)100 ℃；脫溶劑氣溫度(desolvation temperature)350 ℃、反向錐孔氣流(cone gas flow)50 L·h-1、脫溶劑氣(desolvation gas flow)600 L·h-1、萃取錐孔(extraction cone)電壓4 V。

1.4.2.2 負(fù)離子模式：毛細(xì)管電壓(capillary voltage)3.5 kV、錐孔電壓(sampling cone)50 kV、離子源溫度(source temperature)100 ℃；脫溶劑氣溫度(desolvation temperature)300 ℃、反向錐孔氣流(cone gas flow)50 L·h-1、脫溶劑氣(desolvation gas flow)700 L·h-1、萃取錐孔(extraction cone)電壓4 V。離子掃描時(shí)間(scan time)0.03 s、掃描時(shí)間間隔(inter scan time)0.02 s、數(shù)據(jù)采集：50～1 000 m·z-1。為確保質(zhì)量的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，應(yīng)用亮氨酸-腦啡肽作為鎖定質(zhì)量(lock mass)，正離子模式下產(chǎn)生[M+H]+離子556.277 1 u。負(fù)離子模式下產(chǎn)生[M-H]-離子554.261 5 u。

將所得數(shù)據(jù)用Mass Profiler軟件(Agilent公司)對(duì)LC-Q/TOF-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，并在EXCEL2007軟件中進(jìn)行后期編輯，將最終結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量(rt_mz，即保留時(shí)間_質(zhì)荷比)、觀察量(樣本)和峰強(qiáng)度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

經(jīng)過(guò)預(yù)處理后數(shù)據(jù)導(dǎo)入到 SIMCA-P+軟件(V13.0，Umetrics AB，Umea，Sweden)中進(jìn)行模式識(shí)別多變量統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析(principal component analysis，PCA))和正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)，PCA和OPLS-DA用來(lái)揭示兩組乳樣代謝輪廓的變化，相應(yīng)的變量重要性(variable importance in the projection，VIP)通過(guò)OPLS-DA模型計(jì)算出來(lái)。對(duì)VIP>1的代謝物數(shù)據(jù)導(dǎo)入OriginPro 8.0軟件，選擇非參數(shù)檢驗(yàn)中的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析，分析結(jié)果用P值表示，P<0.05表示差異顯著。聚類分析采用Heatmap Illustrator 1.0.3.7軟件分析。差異代謝物對(duì)分類的識(shí)別能力采用SPSS 13.0中的ROC 曲線進(jìn)行分析。

1.6 差異代謝物的鑒定

差異代謝物鑒定根據(jù)其MS值和在線數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB (http://www.hmdb.ca/)，KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)，METLIN (http://metlin.scripps.edu/)進(jìn)行；然后在牛代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù) (Bovine Metabolome Database, DMDB, http://www.cowmetdb.ca/)中進(jìn)行比對(duì)和校正。

2 結(jié) 果

2.1 妊娠奶牛乳樣代謝輪廓的模式識(shí)別

兩組奶牛乳樣代表性正負(fù)離子LC-Q/TOF-MS色譜見(jiàn)圖1，包含799個(gè)色譜峰，其中正離子模式下有380個(gè)色譜峰，負(fù)離子模式下有419個(gè)色譜峰。首先對(duì)色譜峰所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，其結(jié)果用得分散點(diǎn)圖(score plot)來(lái)表示，見(jiàn)圖2。得分散點(diǎn)圖中每個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)乳樣的所有代謝物(包含正離子和負(fù)離子色譜峰)，從圖2中可以看出，兩組之間有所重疊，但表現(xiàn)出明顯的分離趨勢(shì)。然后采用OPLS-DA對(duì)LC-Q/TOF-MS X變量(峰強(qiáng)度)和Y變量(分組信息)之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析。OPLS-DA模型的質(zhì)量采用交叉驗(yàn)證法進(jìn)行檢驗(yàn)，并用交叉驗(yàn)證后得到的R2X、R2Y和Q2(分別代表LC-Q/TOF-MS數(shù)據(jù)可解釋的變量、分組信息可解釋的變量和模型的可預(yù)測(cè)度)對(duì)模型有效性進(jìn)行評(píng)判。兩組奶牛乳樣OPLS-DA得分散點(diǎn)圖見(jiàn)圖3，其中R2X為0.49，R2Y為0.828，說(shuō)明用 49% LC-Q/TOF-MS數(shù)據(jù)能完全反映兩組之間的變量差異，而Q2為0.558，高于0.4，說(shuō)明模型的可預(yù)測(cè)度較高。因此，由 PCA和OPL-DA得分散點(diǎn)圖結(jié)果可以看出，兩組奶牛乳樣代謝輪廓存在明顯差異。

+ESI.正離子，-ESI.負(fù)離子+ESI. Positive ion,-ESI. Negative ion圖1 奶牛乳樣代表性正離子(左)和負(fù)離子(右)LC-Q/TOF-MS 色譜峰Fig.1 Typical positive ion peak(left)and negative ion peak of LC-Q/TOF-MS from dairy cow milk

A組.綠色圓圈;B組.藍(lán)色正方形，圖3同Group A.Green circle; Group B.Blue square.The same as Figure 3圖2 兩組奶牛乳樣PCA得分散點(diǎn)圖Fig.2 PCA score scatter plot of milk from 2 groups of dairy cows

圖3 兩組奶牛乳樣OPLS-DA得分散點(diǎn)圖Fig.3 OPLS-DA score scatter plot of milk from 2 groups of dairy cows

2.2 差異代謝物的篩選與鑒定

根據(jù)OPLS-DA的VIP值，12個(gè)代謝物作為候選差異代謝物(VIP>1)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，這12個(gè)代謝物并不能將兩組乳樣完全分開(kāi)(圖4)。因此采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)12個(gè)差異代謝物的差異性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示僅有10個(gè)代謝物的峰強(qiáng)度在兩組乳樣中有明顯差異(P<0.05)，并且在B組乳樣中均有不同程度的降低。這10個(gè)差異代謝物MS值、VIP值、P值、牛代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)(BMDB ID)見(jiàn)表2。采用ROC曲線進(jìn)一步考察了這10個(gè)差異指標(biāo)對(duì)分類的識(shí)別能力，ROC曲線下的面積(AUC)>0.5時(shí)，說(shuō)明具有較好的識(shí)別能力，AUC越接近于1，即ROC曲線越靠近左上角，識(shí)別效果越好。本試驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示，在這10個(gè)差異代謝物中，6個(gè)代謝物AUC面積在0.80以上，P<0.05，說(shuō)明這6個(gè)代謝物是識(shí)別兩組奶牛乳樣的主要指標(biāo)。6個(gè)代謝物為四氫1-苯甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉(1BnTIQ)、N-乙?；?L-酪氨酸(N-Acetyl-L-tyrosine)、L-酪氨酸(L-Tyrosine)、鳥(niǎo)苷(guanosine)、L-脯氨酸(L-proline)和十七烷基肉堿(heptadecanoyl carnitine)。兩分類邏輯回歸(binary logistic regression analysis，BLR)結(jié)果顯示，這6個(gè)代謝物能準(zhǔn)確識(shí)別兩組奶牛乳樣，識(shí)別率為100%。從6個(gè)差異代謝物峰強(qiáng)度(含量)的位置與分散情況(圖6)可以看出，6個(gè)代謝物含量在兩組乳樣中均發(fā)生了明顯變化。而且在10個(gè)差異代謝物中，這6個(gè)差異代謝物的差異倍數(shù)均>其它4個(gè)差異代謝物(表2)。

表2 差異代謝物VIP及Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果

P<0.05表示差異顯著。+ESI .正離子模式；-ESI .負(fù)離子模式。↓.代謝物在B組中的變化趨勢(shì)

P<0.05 means significant differences. +ESI .Positive ion mode; -ESI.Negtive ion mode. ↓.Change trends of metabolites in group B

顏色由紅變藍(lán)表示代謝物的峰值由高變低，黑色表示峰值為0The color changes from red to blue indicate the peak of the metabolites from high to low, and black indicate the peak value of 0圖4 兩組乳樣代謝物(VIP>1)聚類分析熱圖Fig.4 Heat map of cluster analysis for metabolites with VIP>1 between 2 groups

AUC.Area under curve圖5 6個(gè)差異代謝物的ROC曲線Fig.5 ROC curves of 6 differentiated metabolites between 2 groups

a. L-酪氨酸；b. N-乙?；?L-酪氨酸；c. L-脯氨酸；d.四氫1-苯甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉；e.鳥(niǎo)苷；f.十七烷基肉堿a. L-tyrosine; b. N-Acetyl-L-tyrosine; c. L-proline; d.1BnTIQ; e. Guanosine; f. Heptadecanoyl carnitine圖6 兩組乳樣中6個(gè)差異代謝物 LC-Q/TOF-MS 峰強(qiáng)度箱式圖Fig.6 BOX-charts of LC-Q/TOF-MS peak intensity of 6 differentiated metabolites between 2 groups

3 討 論

L-酪氨酸(L-tyrosine)是必須氨基酸，可以通過(guò)血腦屏障而進(jìn)入腦組織，它既是神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素的前體，也是兒茶酚雌激素類、色素和褪黑素的前體[16]。而N-乙?；?L-酪氨酸(N-Acetyl-L-tyrosine)是生成L-酪氨酸的前體[17-18]。有研究表明，酪氨酸可通過(guò)抑制大鼠血清孕酮的生成而終止早期妊娠[17]。本研究結(jié)果顯示，奶牛乳樣中L-酪氨酸和N-乙酰基-L-酪氨酸含量在妊娠識(shí)別階段均顯著降低，這一變化可能是由于機(jī)體為了保障妊娠的成功建立，應(yīng)答性的降低了體內(nèi)酪氨酸的含量。另外酪氨酸在體內(nèi)可被迅速代謝，葉酸、維生素C和微量元素銅可促進(jìn)酪氨酸的代謝[19-20]。因此，奶牛在妊娠前飼料中適當(dāng)降低酪氨酸或N-乙酰基-L-酪氨酸含量，增加葉酸、維生素和銅的含量可能有助于妊娠的成功建立。

現(xiàn)已證明L-脯氨酸(L-proline)對(duì)豬和羊孕體的代謝、成長(zhǎng)和發(fā)展具有非常重要的作用，脯氨酸是合成多胺(腐胺、亞精胺和精胺)的一種重要氨基酸，多胺是胎盤(pán)成長(zhǎng)和血管生成必不可少的物質(zhì)，胎盤(pán)通過(guò)脯氨酸氧化酶、鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶將脯氨酸轉(zhuǎn)化為多胺[21]。有研究報(bào)道，豬在妊娠20～40 d，脯氨酸氧化酶、鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性、脯氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、多巴胺的合成和多胺的濃度在胎盤(pán)組織顯著增加[22]。本研究結(jié)果顯示，人工授精后第17天奶牛乳汁中脯氨酸含量顯著下降，可能是由于母體大量脯氨酸通過(guò)血液被轉(zhuǎn)運(yùn)到子宮組織合成多胺，以備胎盤(pán)的形成和發(fā)展之需，以致乳中脯氨酸的含量明顯下降。但上述物質(zhì)在妊娠奶牛子宮和胎盤(pán)組織中是否升高，還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

四氫1-苯甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉(1BnTIQ)是內(nèi)源性胺類物質(zhì)，它可以降低腦組織中多巴胺的含量[23]。大鼠在妊娠期，大量多巴胺被分泌進(jìn)入垂體門(mén)脈，在妊娠20 d時(shí)，垂體門(mén)脈血漿多巴胺的含量高達(dá)20 ng·mL-1[24]。妊娠婦女在懷孕后期羊水多巴胺的含量會(huì)顯著升高[25]，另外伴有妊高癥的孕婦血漿中多巴胺的濃度明顯高于正常血壓的孕婦[26]。但目前關(guān)于多巴胺對(duì)妊娠的生理機(jī)制尚不清楚。本結(jié)果顯示，人工授精后第17天奶牛乳樣中四氫1-苯甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉含量明顯低于人工授精當(dāng)天奶牛乳樣，推測(cè)可能與母體血液和胎盤(pán)組織中多巴胺含量升高有關(guān)。

鳥(niǎo)苷(guanosine)磷酸化后可生成鳥(niǎo)苷一磷酸(GMP)、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(CGM)和鳥(niǎo)苷二磷酸(GDP)。母體在妊娠初期會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激[27]，NO-CGMP 信號(hào)通路上調(diào)子宮組織中NO和CGMP含量，雌激素能顯著降低子宮組織中NO和CGMP的含量，相反孕酮能顯著增加NO和CGMP的含量[28]。在懷孕初期奶牛必須持續(xù)分泌孕酮以維持正常妊娠，必然會(huì)導(dǎo)致子宮中NO和CGMP的含量較未懷孕前顯著升高。本研究結(jié)果顯示，奶牛乳汁鳥(niǎo)苷含量在妊娠識(shí)別階段顯著下降，可能與血液中大量鳥(niǎo)苷被轉(zhuǎn)運(yùn)到子宮組織生成CGMP有關(guān)。

十七烷基肉堿(heptadecanoyl carnitine)是一種?；鈮A(acylcarnitine)，目前研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)酰基肉堿升高可能與脂肪酸β氧化和酮體生成異常有關(guān)[29]，但另有研究發(fā)現(xiàn)健康妊娠婦女血液中總?cè)鈮A(包括自由肉堿和酰基肉堿)含量明顯低于未懷孕婦女，且從懷孕12周～分娩持續(xù)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)[30]，但其機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，人工授精第17天奶牛乳樣中十七烷基肉堿含量明顯低于人工授精前當(dāng)天奶牛乳樣，這可能與血液中總?cè)鈮A含量下降有關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用具有較高分辨率和靈敏度的LC-Q/TOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)妊娠識(shí)別期奶牛乳樣代謝物的變化趨勢(shì)進(jìn)行了研究，結(jié)合Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和ROC曲線篩選了6個(gè)生物標(biāo)志物(L-酪氨酸、N-乙酰基-L-酪氨酸、L-脯氨酸、四氫1-苯甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉、鳥(niǎo)苷和十七烷基肉堿)，這6個(gè)生物標(biāo)志物均與妊娠存在著直接或間接的聯(lián)系，有望成為奶牛妊娠識(shí)別期妊娠診斷的重要生化指標(biāo)。

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