AMPK調(diào)控綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的研究

李 戡，劉文忠，張瑞鑫，李 倩，張 婷，秦旭澤，張建新，趙俊星

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801)

生活水平的提高和消費(fèi)觀念的改變使高品質(zhì)的羊肉受到了更多的青睞。肌內(nèi)脂肪含量(intramuscular fat，IMF)是決定羊肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，其高低直接影響肉的嫩度、多汁性和風(fēng)味[1]。由于生長(zhǎng)速度與肉質(zhì)間存在一定的負(fù)相關(guān)，肉羊生產(chǎn)中常用的提高瘦肉率及飼料轉(zhuǎn)化率的方法，例如營(yíng)養(yǎng)調(diào)控、遺傳選擇等手段均可能導(dǎo)致IMF 含量下降。IMF含量受到了遺傳、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等多種因素的共同影響[2-3]。如何在不影響生長(zhǎng)速度的前提下，提高羊肉的 IMF 含量已成為肉羊生產(chǎn)中亟待解決的問題之一。

肌內(nèi)脂肪細(xì)胞由肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化而來，研究肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的分化對(duì)理解肉羊成熟肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的生成及IMF的沉積有重要意義。相對(duì)于豬、牛等家畜，國(guó)內(nèi)外關(guān)于綿、山羊肌內(nèi)脂肪發(fā)育調(diào)控的研究起步較晚。劉建華和師濤等[4-5]克隆了UCP2 cDNA全長(zhǎng)序列，就其時(shí)空表達(dá)特異性進(jìn)行了研究，并證明了miR-132-3p與UCP2 3′-UTR特異結(jié)合抑制其表達(dá)，促進(jìn)綿羊前體脂肪細(xì)胞的分化。杜琛等[6-7]以絨山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞為試驗(yàn)材料，探討了絨山羊PPARγ基因在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖和分化過程中的功能。同時(shí)，該課題組還進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序，篩選出與脂肪沉積相關(guān)的基因。鄭竹清等[8]對(duì)涉及山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的lncRNA進(jìn)行了序列、結(jié)構(gòu)與功能的分析。欒兆進(jìn)等[9]研究了FAM134B、PPARγ、FAS和HSL等基因在發(fā)育過程中的組織表達(dá)規(guī)律及其與IMF含量的關(guān)系。

AMPK(AMP-activated protein kinase)是細(xì)胞調(diào)節(jié)能量代謝最重要的酶之一，參與了糖、脂肪及蛋白質(zhì)的代謝過程。研究表明，敲除小鼠骨骼肌中的AMPK會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的脂肪沉積和對(duì)胰島素的抵抗(insulin resistance)[10-11]，而激活3T3-L1細(xì)胞中AMPK可抑制成脂關(guān)鍵基因C/EBPβ、PPARγ和C/EBPα等的表達(dá)[12-13]。Wnt屬于分泌型糖蛋白，在胚胎的早期發(fā)育、成體的組織穩(wěn)態(tài)維持、干細(xì)胞自我更新、細(xì)胞命運(yùn)決定、細(xì)胞分裂以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中起關(guān)鍵作用[14]。模式動(dòng)物中的研究已證明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可通過抑制PPARγ和C/EBPα表達(dá)抑制脂肪細(xì)胞的形成[15-16]，而其是否參與了羔羊肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞的分化尚不清楚。

本試驗(yàn)以羔羊背最長(zhǎng)肌中分離的前體細(xì)胞為研究對(duì)象，研究了AMPK活性對(duì)其成脂分化的影響，并初步探討了潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 3日齡小尾寒羊羔羊來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)肉羊養(yǎng)殖基地。本次試驗(yàn)所涉及的動(dòng)物飼養(yǎng)管理及取樣過程嚴(yán)格遵循《山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)章程》中的相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要試劑 DMEM 低糖培養(yǎng)液(SH30021.01)購(gòu)自于 Hyclone 公司；雙抗(青鏈霉素)(10378016)與胎牛血清(10091155)購(gòu)自于Gibco公司；Ⅱ型膠原酶(C6885)、胰島素(I5500)、地塞米松(D4902)和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)(I7018)購(gòu)自于美國(guó) Sigma 公司；AICAR(AB120358)和Compound C(AB120843)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；胰蛋白酶(S01412)和油紅O染液(S01058)購(gòu)自于中國(guó)索萊寶公司。PrimeScript?RT Master Mix(R047A)與SYBR?Premix Ex TaqTMII65(R820A) 購(gòu)于日本 TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 羔羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的分離 3日齡羔羊經(jīng) 75%酒精消毒后放血處死。取倒數(shù)第二、三肋骨間背最長(zhǎng)肌，經(jīng)含100 U雙抗的PBS清洗3次后移入超凈工作臺(tái)。使用滅菌的剪刀和鑷子剔除可見的血塊及結(jié)締組織，小心分離肌束膜，置于 50 mL 離心管中，加入含Ⅱ型膠原酶(2 mg·mL-1)的消化緩存溶液，37 ℃水浴搖床(250 r·min-1)振蕩消化1 h。消化結(jié)束后，加入等體積的消化終止液(DMEM +10%FBS)，700×g離心10 min，棄上清。用2 mL完全培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS+100 U·mL-1青鏈霉素)重懸細(xì)胞，依次通過100 和40 μm 細(xì)胞篩，進(jìn)行過濾。濾液500×g 離心5 min，棄上清并在沉淀中加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)后(2.5×105) 接種于培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和成脂分化 細(xì)胞培養(yǎng)1.5 h后，棄培養(yǎng)液，并用新鮮培養(yǎng)液清洗貼壁細(xì)胞2 次，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)至 80%～90%豐度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代培養(yǎng)。傳代過程中，每2 d換 1 次完全培養(yǎng)液，直至細(xì)胞豐度達(dá)到 80%后，重復(fù)上述操作。為減小試驗(yàn)誤差，分化試驗(yàn)均使用2～4代的細(xì)胞完成。成脂分化時(shí)，細(xì)胞按3×103個(gè)·cm-2密度接種于12 孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后進(jìn)行誘導(dǎo)分化。分化培養(yǎng)液：DMEM/低糖+10%FBS+1%雙抗+ 5 μg·mL-1胰島素+1 μmol·L-1地塞米松+0.5 mmol·L-1IBMX，2 d 換液1次。4 d后，分化培養(yǎng)液換為DMEM/低糖+10% FBS+1% 雙抗+5 μg·mL-1的胰島素，每2 d換液1次，分化至第12天。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè) 總RNA的提取參照Trizol?Reagent試劑盒說明進(jìn)行。提取后的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用Nanodrop ND-1000進(jìn)行濃度與完整性檢測(cè)，OD260nm/OD280nm=1.9～2.0者用于后續(xù)試驗(yàn)。RNA經(jīng)DNA酶處理后，取1 μg進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行qRT-PCR分析。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性20 s；95 ℃變性20 s，60℃退火及延伸20 s，36個(gè)循環(huán)。結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算，18S為內(nèi)參基因。引物信息見表1。

1.2.4 Western blot檢測(cè) Western blot分析采用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法完成[17]。具體操作：吸出培養(yǎng)液，并用預(yù)冷PBS洗1次，加入100 μL預(yù)冷裂解液(20 mmol·L-1Tris-HCl，2% SDS，1% Triton X-100，5.0 mmol·L-1EDTA，5.0 mmol·L-1EGTA，1 mmol·L-1DTT，100 mmol·L-1NaF，2 mmol·L-1釩酸鈉，0.5 mmol·L-1苯基甲基磺酰氟)，勻漿后離心(12 000 r·min-1，4 ℃，15 min)。取上清液，并加入等體積的2倍上樣緩沖液(150 mmol·L-1Tris-HCl，20% 甘油，2 mmol·L-1巰基乙醇，0.004%溴酚藍(lán))，經(jīng)煮沸后備用。蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后(Bio-Rad Mini-RPOTEAN，美國(guó))轉(zhuǎn)膜于硝基纖維素膜(NC，100 V，1 h)。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗(1∶1 000)，4℃過夜。NC膜經(jīng)PBST洗膜 3 次后，加入熒光二抗(1∶10 000)，室溫孵育 60 min，用Odyssey 遠(yuǎn)紅外掃描系統(tǒng)進(jìn)行分析。β-actin 作為內(nèi)參，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白含量/β-actin蛋白含量。

F.上游引物；R. 下游引物

F.Forward primer; R. Reverse primer

相關(guān)抗體信息：PPARγ多克隆抗體(sc-7196)、ap2多克隆抗體(sc-18661)、C/EBPα 多克隆抗體(sc-9314)購(gòu)于美國(guó) Santa Cruz公司；ACC多克隆抗體(3662)、p-ACC多克隆抗體(3661)、AMPK多克隆抗體(2532)、p-AMPK單克隆抗體(2535)、β-catenin(8480)單克隆抗體、β-actin 抗體(4970)購(gòu)于美國(guó) Cell signaling technology公司；GSK3β多克隆抗體(bs-0023M)、p-GSK3β多克隆抗體(bs-2066R)購(gòu)于中國(guó)博奧森公司。Goat anti-Rabbit IgG(926-32211)熒光二抗、Donkey anti-Goat IgG(926-32214)熒光二抗和Goat anti-Mouse IgG(926-68070)熒光二抗購(gòu)于美國(guó)LICOR公司。

1.2.5 油紅O染色 細(xì)胞分化第12天移去上層培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS漂洗3次，并用 10%的甲醛室溫固定10 min。隨后，細(xì)胞用自來水充分漂洗3次，加入60%的異丙醇浸洗。待培養(yǎng)皿完全干燥后，用油紅O染液室溫染色10 min，自來水沖洗，光學(xué)倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并采用Graphpad Prism 7.0 進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 羔羊骨骼肌肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

如圖1所示，分離的羔羊背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)的第4天開始出現(xiàn)脂滴，但數(shù)量較少(圖1A)。誘導(dǎo)第8天，脂滴明顯增多(圖1B)，誘導(dǎo)第12天，細(xì)胞幾乎完全分化，成熟脂滴充滿整個(gè)細(xì)胞(圖1C)。

A.分化4天；B. 分化8天；C. 分化12天The morphology of preadipocytes at different induction times: A. 4 d; B. 8 d; C. 12 d圖1 羔羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化(200×)Fig.1 Adipogenic differentiation of sheep intramuscular preadipocytes (200×)

2.2 AMPK激活劑與抑制劑最佳濃度的篩選

分別使用不同濃度的AMPK激活劑AICAR(0.1、0.25、0.5 mmol·L-1)與抑制劑Compound C(0.5、1、2 μmol·L-1)對(duì)羔羊前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行處理，24 h后取樣進(jìn)行Western blot和灰度值分析。如圖2所示，0.1 mmol·L-1的AICAR可極顯著增加p-AMPK(P=0.004)與p-ACC(P=0.007)的含量(圖2A)，激活A(yù)MPK。其中，0.25 mmol·L-1的激活效果最好。同時(shí)，0.5 μmol·L-1的Compound C也極顯著降低p-AMPK(P=0.002)與p-ACC(P=0.003)的含量(圖2B)。AMPK的活性受特定位點(diǎn)磷酸化的修飾，其活性形式是p-AMPK。此外，p-ACC是AMPK的唯一下游靶點(diǎn)，p-ACC與p-AMPK的增加均說明了AMPK被激活。本試驗(yàn)采用的AICAR與Compound C的濃度分別為0.25 mmol·L-1與0.5 μmol·L-1。

2.3 AMPK活性對(duì)綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞成脂分化的影響

細(xì)胞接受處理(AICAR或Compound C)48 h后取樣進(jìn)行成脂關(guān)鍵基因mRNA及蛋白表達(dá)分析。如圖3B所示，與對(duì)照組相比，AICAR處理可極顯著降低PPARγ、C/EBPα和aP2(P<0.01)等關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)，而Compound C處理組中的相應(yīng)mRNA水平均極顯著升高(P<0.01，圖3B)。上述關(guān)鍵基因的蛋白水平的變化與mRNA的變化趨勢(shì)一致(圖3A，P<0.01)。細(xì)胞處理12 d后采用油紅O染色衡量最終分化效果。結(jié)果顯示(圖3C)，AICAR處理組的油紅著色明顯少于對(duì)照組，而Compound C處理后的油滴明顯多于對(duì)照組。

2.4 Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性對(duì)綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的影響

2.4.1 Wnt/β-catenin激活劑LiCl和抑制劑IWR-1最佳濃度的篩選 本試驗(yàn)采用LiCl和IWR-1分別激活和抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。如圖4A所示，細(xì)胞接受LiCl處理12 h后明顯增加了β-catenin的蛋白含量，其中濃度為25 mmol·L-1時(shí)的效果最好。添加25 mmol·L-1的LiCl后，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游基因C-MYC的mRNA表達(dá)極顯著上升(圖4B，P<0.01)，CyclinD1的mRNA表達(dá)顯著上升(圖4B，P<0.05)。IWR-1劑量依賴性的抑制了β-catenin 蛋白含量(圖4C)，0.5 μmol·L-1的添加量明顯地減少β-catenin 的表達(dá)。如圖4D所示，添加0.5 μmol·L-1的IWR-1可顯著降低C-MYC(P<0.05) 與CyclinD1(P<0.05)的mRNA水平。

A.添加不同濃度AICAR后p-AMPK、AMPK、p-ACC及ACC表達(dá)的Western blot檢測(cè)；B. 添加不同濃度Compound C后p-AMPK、AMPK、p-ACC及ACC 表達(dá)的Western blot檢測(cè)A.p-AMPK，AMPK，p-ACC and ACC expressions after adding different concentrations of AICAR; B. p-AMPK，AMPK，p-ACC and ACC expressions after adding different concentrations of Compound C圖2 不同濃度AICAR與Compound C對(duì)AMPK活性的影響Fig.2 The effects of different concentrations of AICAR and Compound C on AMPK activity

A. 不同處理組中PPARγ、C/EBPα和aP2蛋白的相對(duì)表達(dá)量；B.不同處理組中PPARγ、C/EBPα和aP2關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)量；C. 分化12天后不同處理組油紅O染色結(jié)果(100×)。不同字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同A. Relative protein contents of PPARγ, C/EBPα and aP2 in different groups; B.Relative mRNA expressions of PPARγ, C/EBPα and aP2 in different groups; C. Oil-red-O staining of sheep intramuscular preadipocytes in different groups after 12 d differentiation(100×). The different letters indicate extremely significant difference(P<0.01). The same as below圖3 AMPK活性對(duì)綿羊肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞成脂分化的影響Fig.3 The effect of AMPK activity on sheep intramuscular preadipocytes differentiation

A.不同濃度的LiCl處理后細(xì)胞中β-catenin蛋白水平；B. 25 mmol·L-1 LiCl處理細(xì)胞后，C-MYC與Cyclin D1的mRNA表達(dá)；C. 不同IWR-1濃度處理后細(xì)胞中β-catenin的蛋白相對(duì)表達(dá)量；D. 0.5 μmol·L-1 IWR-1處理細(xì)胞后，C-MYC與Cyclin D1的mRNA表達(dá)。*. P<0.05；**. P<0.01，下同A.β-catenin protein contents after cells were treated with different concentrations of LiCl；B. The mRNA expressions of C-MYC and Cyclin D1 after cells were treated with 25 mmol·L-1 LiCl；C. β-catenin protein contents after cells were treated with different concentrations of IWR-1；D. The mRNA expressions of C-MYC and Cyclin D1 after cells were treated with 0.5 μmol·L-1 IWR-1.*. P<0.05；**. P<0.01，the same as below圖4 LiCl與IWR-1對(duì)Wnt/β-catenin通路的影響Fig.4 The effect of LiCl and IWR-1 addition on Wnt/β-catenin signaling pathway activity

2.4.2 Wnt/β-catenin影響綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化 前體脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化的同時(shí)，加入LiCl或IWR-1，48 h后提取mRNA及蛋白進(jìn)行熒光定量和Western blot分析。如圖5A和5B顯示，與對(duì)照組相比，LiCl可極顯著降低PPARγ和C/EBPαmRNA表達(dá)(P<0.01)，同時(shí)顯著減少aP2的mRNA表達(dá)(P<0.05)。添加IWR-1后，上述關(guān)鍵基因的mRNA水平呈顯著上升(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，LiCl(圖5C)極顯著降低PPARγ、C/EBPα和aP2的蛋白水平(P<0.01)，而IWR-1(圖5D)極顯著提高上述蛋白的含量(P<0.01)。此外，油紅O染色結(jié)果顯示，LiCl處理組脂滴明顯少于對(duì)照組，而IWR-1添加后明顯增加了脂滴的數(shù)量。

2.5 AMPK對(duì)β-catenin的含量的影響

如圖6A所示，AICAR與Compound C處理細(xì)胞后(48 h)，并未顯著影響β-catenin的mRNA表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，AICAR處理細(xì)胞后極顯著增加了β-catenin的蛋白含量(P<0.01)，而Compound C極顯著降低了β-catenin蛋白表達(dá)(圖6B，P<0.01)。

2.6 AMPK通過影響GSK3β活性調(diào)控β-catenin的含量

如圖7所示，不同處理組間GSK3β蛋白含量未見顯著差異。與對(duì)照組相比，AICAR處理組的p-GSK3β蛋白含量極顯著增加(P<0.01)，而Compound C處理組的p-GSK3β含量極顯著降低(P<0.01)。p-GSK3β/GSK3β的變化趨勢(shì)與p-GSK3β一致。

A、B. 添加LiCl與IWR-1后成脂關(guān)鍵基因(包括PPARγ、C/EBPα和aP2)的mRNA相對(duì)表達(dá)量；C、D. 不同處理組PPARγ、C/EBPα和aP2的蛋白表達(dá)量； E. 細(xì)胞分化12天后油紅O染色結(jié)果(100×)A, B. PPARγ, C/EBPα and aP2 gene expressions after cells were treated with LiCl and IWR-1； C, D. PPARγ, C/EBPα and aP2 protein contents after cells were treated with LiCl and IWR-1. E. Oil-red-O staining in different groups when cells were differentiated for 12 d (100×)圖5 Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的影響Fig.5 The effect of Wnt/β-catenin signaling pathway on sheep intramuscular preadipocytes differentiation

A.β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量；B. β-catenin蛋白含量A. β-catenin mRNA abundance in different groups; B. β-catenin protein contents in different groups圖6 AMPK對(duì)β-catenin含量的影響Fig.6 The effect of AMPK on β-catenin protein contents

3 討 論

IMF含量的高低影響了包括羊肉在內(nèi)的肉類多汁性、嫩度、風(fēng)味和適口性，其含量的高低受脂肪的合成能力與脂肪細(xì)胞數(shù)量的影響。動(dòng)物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來[18]，其分化過程受一系列關(guān)鍵基因及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)決定[19-20]，數(shù)量一般在動(dòng)物出生前或是生長(zhǎng)早期就已確定。在家畜發(fā)育過程中，間充質(zhì)干細(xì)胞首先定向決定成脂肪前體細(xì)胞，進(jìn)而在特定基因及信號(hào)通路的共同決定下分化成脂肪細(xì)胞。破譯脂肪前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的機(jī)制將為提高羊肉IMF含量提供參考。

根據(jù)來源，家畜脂肪組織可分為皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、肌內(nèi)脂肪及肌間脂肪4類[21]。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)家畜脂肪前體細(xì)胞分化研究中使用的原代細(xì)胞(ADSCs)大多來源于皮下與內(nèi)臟脂肪組織中[22]，由于不同來源的脂肪前體細(xì)胞分化調(diào)節(jié)機(jī)制可能存在差異[23]，肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞無疑是研究IMF分化的最好模型。肌內(nèi)脂肪細(xì)胞主要分布于骨骼肌肌束膜上[24]，本試驗(yàn)直接分離了3日齡羔羊背最長(zhǎng)肌肌束膜的原代細(xì)胞，成脂誘導(dǎo)結(jié)果表明，分離的細(xì)胞可以形成成熟的脂肪油滴，是肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞。結(jié)果可為理解綿羊IMF形成提供更直接的證據(jù)。

AMPK是保守的異源三聚體蛋白質(zhì)激酶，包括α、β和γ 3種亞基。AMPK通過感受細(xì)胞能量水平變化來維持細(xì)胞ATP生成和消耗的平衡，其活性主要受細(xì)胞AMP/ATP比例的調(diào)節(jié)。AMPK激活將引起代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶活性與表達(dá)水平發(fā)生改變，影響細(xì)胞能量代謝。AMPK在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、建立和穩(wěn)定細(xì)胞極性、調(diào)節(jié)動(dòng)物壽命、調(diào)控生理節(jié)律等方面也起著重要作用[25-28]，這些研究大多集中于AMPK 和能量代謝方面的關(guān)系，而AMPK在脂肪細(xì)胞分化過程中的作用及機(jī)制研究較少。

AICAR與Compound C是常用的AMPK激活劑和抑制劑，其中AICAR已通過FDA應(yīng)用于臨床。本研究首先篩選了羔羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞AICAR與Compound C的最佳濃度，發(fā)現(xiàn)，0.25 mmol·L-1的AICAR可有效激活A(yù)MPK，而0.5 μmol·L-1的Compound C足以抑制AMPK活性。在改變羔羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞AMPK活性的基礎(chǔ)上，筆者分析成脂關(guān)鍵基因的表達(dá)，Real-time PCR 和Western blot結(jié)果均證明，AMPK的活性與PPARγ、C/EBPα和aP2等基因的mRNA及蛋白表達(dá)均相關(guān)。油紅O染色的結(jié)果進(jìn)一步揭示了AMPK活性與羔羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的相關(guān)性。Yang等[29]以小鼠3T3-L1細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過激活A(yù)MPK抑制其成脂能力。Figarola和Rahbar[30]的研究發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤藥物COH-SR4 亦可通過活化AMPK抑制3T3-L1 的分化。LKB1(liver kinase B1)是AMPK的上游激酶。對(duì)LKB1基因敲除的小鼠研究表明，AMPK活性降低的同時(shí)導(dǎo)致了白色脂肪細(xì)胞分化的增加[31]。以上研究結(jié)果均以小鼠極其鼠源的細(xì)胞系展開，本研究結(jié)果可為理解羔羊肉中AMPK活性與肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的關(guān)系提供必要的研究基礎(chǔ)。

LiCl是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活劑。經(jīng)LiCl處理的豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)穩(wěn)定了細(xì)胞質(zhì)的β-catenin，進(jìn)而抑制了豬AMSCs 的成脂分化[32]。IWR-1是一種新的抑制Wnt信號(hào)通路的小分子復(fù)合物，主要通過穩(wěn)定Axin而降解β-catenin。本試驗(yàn)中，經(jīng)LiCl(25 mmol·L-1)與IWR-1(0.5 μmol·L-1)處理的羔羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中Wnt信號(hào)重要的靶基因CyclinD1和C-MYC的表達(dá)顯著降低，表明二者可顯著改變羔羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羔羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性與PPARγ、C/EBPα和aP2等基因的mRNA及蛋白表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，揭示了其與細(xì)胞成脂分化的關(guān)系。

β-catenin是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。當(dāng)細(xì)胞外無Wnt 蛋白時(shí)，胞質(zhì)中的β-catenin會(huì)被由Axin、APC、GSK3β和CK1等蛋白組成的降解復(fù)合體磷酸化并降解，從而保持胞內(nèi)較低的β-catenin，關(guān)閉基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞外有Wnt 蛋白時(shí)，降解復(fù)合體的活性降低，從而抑制β-catenin的降解，提高胞內(nèi)游離β-catenin 蛋白水平，啟動(dòng)靶基因的表達(dá)[33]。本研究結(jié)果表明，羔羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中AMPK活性的變化未改變?chǔ)?catenin的mRNA表達(dá)，但卻改變了其蛋白的含量，表明AMPK對(duì)β-catenin調(diào)控不是通過影響轉(zhuǎn)錄，而可能是通過改變?chǔ)?catenin的胞內(nèi)穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)的。Horike等[34]的研究表明，小鼠中AMPK活性的激活導(dǎo)致了GSK3β的磷酸化增加，從而抑制了GSK3β的活性。GSK3β的活性受磷酸化話水平的調(diào)控，p-GSK3β含量多，則代表GSK3β的活性強(qiáng)。同時(shí)，p-GSK3β是β-catenin穩(wěn)定性公認(rèn)的調(diào)控因子。鑒于GSK3β對(duì)細(xì)胞內(nèi)β-catenin穩(wěn)定性的作用，我們分析了羔羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞在AMPK活性改變時(shí)的GSK3β活性變化。結(jié)果表明，AMPK的活性與p-GSK3β含量呈正相關(guān)，說明AMPK可通過GSK3β的活性影響胞內(nèi)β-catenin穩(wěn)定性，進(jìn)而影響細(xì)胞的成脂分化。

本研究建立的AMPK與肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的關(guān)系可為肉羊生產(chǎn)中調(diào)控IMF含量提供理論依據(jù)。AMPK的活性受攝入能量水平的影響，而一些生物活性物質(zhì)亦可以改變AMPK的活性[35]。如能在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞形成的過程中有效的改變羔羊體內(nèi)AMPK活性，將為實(shí)現(xiàn)IMF含量的提高及肉品質(zhì)的提升提供新的途徑。

4 結(jié) 論

羔羊背最長(zhǎng)肌中AMPK的活性與成脂分化能力呈負(fù)相關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活會(huì)抑制脂肪細(xì)胞形成，而其活性被抑制則起促進(jìn)作用。AMPK通過改變GSK3β活性影響細(xì)胞內(nèi)β-catenin穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)對(duì)羔羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控。