Toll樣受體4重組質(zhì)粒及穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞株的構(gòu)建

黃萃園，張洪，白瑞丹

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060)

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是一種能夠識(shí)別病原相關(guān)模式分子和危險(xiǎn)相關(guān)模式分子的受體[1]，分布于各個(gè)細(xì)胞的表面，參與生物體內(nèi)的各種炎癥調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答以及腫瘤發(fā)生的進(jìn)程。而在體內(nèi)經(jīng)配體刺激后，TLR4主要通過(guò)2條信號(hào)通路參與調(diào)控疾病的發(fā)生和發(fā)展，一條是髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴(lài)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可進(jìn)一步激活核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，從而導(dǎo)致前炎性細(xì)胞因子的表達(dá)；另一條是為非MyD88依賴(lài)性通路，可激活轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)和NF-κB，調(diào)節(jié)干擾素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明TLR4信號(hào)通路與肝癌[2]、結(jié)直腸癌[3]、胃癌[4]、宮頸癌[5]以及心血管疾病[6]等密切相關(guān)。TLR4基因位于9號(hào)染色體，其單核苷酸的多態(tài)性(SNP)可能會(huì)對(duì)某些疾病的易感性及發(fā)展程度產(chǎn)生影響。而研究較多的是2個(gè)位于外顯子區(qū)的單個(gè)核苷酸的變異：896 A>G(rs4986790)、1196 C>T(rs4986791)；該區(qū)域的變異會(huì)導(dǎo)致TLR4蛋白表面性質(zhì)的改變，從而影響TLR4與配體的結(jié)合[7]。臨床研究[8-9]發(fā)現(xiàn)896 A>G、1196 C>T位點(diǎn)多態(tài)性與丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)易感性有關(guān)，同時(shí)與肝硬化患者的發(fā)展程度以及肝癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但相關(guān)機(jī)制尚未闡明。因此，本課題擬通過(guò)構(gòu)建含有TLR4 1196C/T、896A/G野生型、突變型基因的真核表達(dá)系統(tǒng)載體，并將其轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后加入嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)TLR4的細(xì)胞株，為體外研究TLR4基因多態(tài)性對(duì)HepG2細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及肝癌發(fā)展影響的分子機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究起止時(shí)間為2016年10月至2017年2月。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒及菌株pIRES2-ZsGreen1載體，感受態(tài)大腸桿菌DH5α購(gòu)自武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2試劑及儀器Taq DNA Polymerase(TIANGEN,批號(hào):ET105-02-01)，dNTP (TIANGEN,批號(hào):CD117)，pfu DNA(PolymeraseFermentas,批號(hào):EP0572)DpnI (Fermentas,批號(hào):ER1702)，DL15000(TIANGEN,批號(hào):MD110)，DL2000(TIANGEN,貨號(hào):MD114)，金牌超量無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(康為世紀(jì),批號(hào):CW2104)，PCR擴(kuò)增儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)，水平電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，Western blot試劑盒(武漢谷歌生物有限公司)，TLR4一抗(Affinity Biosciences，批號(hào):AF7017)，羊抗兔二抗(cell signaling technology，批號(hào):5151)。

1.3方法

1.3.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 在NCBI基因庫(kù)中查找的人類(lèi)TLR4基因序列并依照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增合成cDNA。雙酶切連接至pIRES2-ZsGreen1 載體的 Xho I 和 BamH I 之間，獲得重組質(zhì)粒pIRES2-TLR4。

1.3.2單突變質(zhì)粒的構(gòu)建 質(zhì)粒pIRES2-TLR4，896位點(diǎn)由A突變?yōu)镚，突變后質(zhì)粒命名為pIRES2-TLR4(A-G)；質(zhì)粒pIRES2-TLR4，1196位點(diǎn)由C突變?yōu)門(mén)，突變后質(zhì)粒命名為pIRES2-TLR4(C-T)。引物設(shè)計(jì):TLR4-F(A-G):CTACCTCGATGGTATTATTGACTTATTTAATTGTTTGACA；TLR4-R(A-G):AAT-AAGTCAATAATACCATCGAGGTAGTAGTCTAAGTA-TG；TLR4-F(C-T):GATTTTGGGACAATCAGCCTAAAGTATTTAGATCTGAG；TLR4-R(C-T):TA-CTTTAGGCTGATTGTCCCAAAATCACTTTGAGAAC。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，68 ℃ 12 min，18個(gè)循環(huán)；72 ℃ 30 min，4 ℃ 10 min，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將PCR產(chǎn)物用Dpn I酶切并將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入卡那霉素進(jìn)行篩選。以載體pIRES2-ZsGreen1的通用引物CMV-F和IRES-R進(jìn)行PCR鑒定。擴(kuò)增片段約為2 600 bp。引物序列如下：CMV-F：CGCAAATGGGCGG-TAGGCGTG；IRES-R：CCTCACATTGCCAAAAGACG。

1.3.3雙突變質(zhì)粒的構(gòu)建 以pIRES2-TLR4(A-G)為模板，以TLR4-F(C-T)，TLR4-R(C-T)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增構(gòu)建雙突變質(zhì)粒，質(zhì)粒命名為pIRES2-TLR4(A-G，C-T)。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，68 ℃ 12 min，18個(gè)循環(huán)；72 ℃ 30 min，4 ℃ 10 min。 用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將PCR產(chǎn)物用Dpn I酶切并將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入卡那霉素進(jìn)行篩選。以載體pIRES2-ZsGreen1的通用引物CMV-F和IRES-R進(jìn)行PCR鑒定。擴(kuò)增片段約為2 600 bp。

1.3.4載體亞克隆 載體質(zhì)粒pLVX-IRES-Puro和目的基因質(zhì)粒pIRES2-TLR4的XhoI和BamHI 雙酶切，酶切反應(yīng)在37 ℃水浴反應(yīng)3 h。分別回收載體pLVX-IRES-Puro酶切大片段和目的基因質(zhì)粒pIRES2-TLR4酶切小片段。質(zhì)粒pLVX-IRES-Puro XhoI+BamHI回收大片段與目的基因TLR4的連接，連接反應(yīng)在22 ℃反應(yīng)3 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌，用氨芐西林進(jìn)行篩選后，用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。得到質(zhì)粒pLVX-TLR4-Puro、pLVX-TLR4(A-G)-Puro、pLVX-TLR4(C-T)-Puro、pLVX-TLR4(A-G，C-T)-Puro。

1.3.5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 病毒感染前1 d 鋪HepG2細(xì)胞于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，感染當(dāng)日細(xì)胞匯合度30%～60%為宜；取10 μL病毒液加入24孔板之細(xì)胞表面，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育至少2 h后換液(也可不換液)；感染48 h后可檢測(cè)到空載對(duì)照組GFP的表達(dá)(熒光顯微鏡鏡檢)；病毒感染后24 h，可以換用含最優(yōu)濃度(本次篩選的最佳濃度為0.2 mg·L-1)嘌呤霉素的培養(yǎng)基。以后每隔1 d換用新鮮含嘌呤霉素的無(wú)抗生素3%～5%血清培養(yǎng)基，以替換含大量死細(xì)胞的培養(yǎng)基。直到抗性群落能被識(shí)別出。待抗性細(xì)胞長(zhǎng)滿以后，進(jìn)行傳代，用含0.02% EDTA的胰酶消化約2 min，用含血清的完全培養(yǎng)液終止消化，離心后棄上清，加入含10%的胎牛血清、100 μ·mL-1青霉素和100 μ·mL-1鏈霉素RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，按適當(dāng)比例接種6孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.6Western blot檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)水平 分別在6孔板中接種HepG2正常細(xì)胞、轉(zhuǎn)染TLR4野生型及突變型基因的HepG2細(xì)胞，每孔約3×105個(gè)細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白含量。將5×上樣緩沖液與提取的蛋白樣品按照1 ∶4的比例進(jìn)行混合，煮沸10 min使蛋白變性。在8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。電轉(zhuǎn)后用BSA封閉2 h，分別用一抗TLR4和GAPDH于4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌緩沖液(TBST)洗膜3次，再于羊抗兔二抗中避光孵育2 h，在奧德賽雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。

2 結(jié)果

2.1TLR4單突變及雙突變型重組質(zhì)粒構(gòu)建設(shè)計(jì)引物構(gòu)建單突變質(zhì)粒，PCR反應(yīng)后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落，接種于液體培養(yǎng)基中，以載體pIRES2-ZsGreen1的通用引物CMV-F和IRES-R進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增片段約為2 600 bp，結(jié)果如圖1(分別挑取了2個(gè)菌落)。PCR結(jié)果正確，進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果比對(duì)后正確，pIRES2-TLR4(A-G)，pIRES2-TLR4(C-T)構(gòu)建成功。 以pIRES2-TLR4(A-G)為模板，以TLR4-F(C-T)，TLR4-R(C-T)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增構(gòu)建雙突變質(zhì)粒后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。同樣，以通用引物CMV-F和IRES-R進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增片段約為2 600 bp，結(jié)果如圖2(挑取了2個(gè)菌落)。PCR結(jié)果正確，送pIRES2-TLR4(A-G，C-T)-1測(cè)序，測(cè)序結(jié)果比對(duì)后正確，pIRES2-TLR4(A-G，C-T)構(gòu)建成功。

注：M為DL2000;1為pIRES2-TLR4(A-G)-1；2為pIRES2-TLR4(A-G)-2；3為pIRES2-TLR4(C-T)-1；4為pIRES2-TLR4(C-T)-2

圖1單突變質(zhì)粒PCR鑒定圖

注：M為DL2000; 1為pIRES2-TLR4(A-G，C-T)-1；2為pIRES2-TLR4(A-G，C-T)-2

圖2雙突變質(zhì)粒PCR鑒定圖

2.2pLVX-TLR4-Puro質(zhì)粒構(gòu)建載體質(zhì)粒pLVX-IRES-Puro和目的基因質(zhì)粒pIRES2-TLR4用XhoI和BamHI 雙酶切，回收片段進(jìn)行連接反應(yīng)、轉(zhuǎn)化后，各挑取4個(gè)單菌落抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果表明，5#、8#、11#、10#克隆為陽(yáng)性克隆。進(jìn)行測(cè)序后，經(jīng)BLAST比對(duì)結(jié)果表明質(zhì)粒pLVX-TLR4-Puro-5#、pLVX-TLR4(A-G)-Puro-8#、pLVX-TLR4 (C-T) -Puro-11#、pLVX-TLR4(A-G，C-T)-Puro-10#測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列一致。

注：Lane M為T(mén)rans2K plus marker

圖3pLVX-TLR4-Puro質(zhì)粒酶切鑒定

2.3單克隆細(xì)胞篩選結(jié)果HepG2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pLVX-TLR4-Puro、pLVX-TLR4(A-G)-Puro、pLVX-TLR4(C-T)-Puro、pLVX-TLR4(A-G，C-T)-Puro，經(jīng)細(xì)胞克隆后，用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，分別在加藥48 h后于倒置顯微鏡下觀察，4組細(xì)胞均生長(zhǎng)較好、形態(tài)正常，如圖4。

2.4Westernblot檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)水平以GAPDH蛋白為內(nèi)參，檢測(cè)HepG2正常細(xì)胞(對(duì)照組)及4組重組TLR4過(guò)表達(dá)細(xì)胞(WT野生型；1196位點(diǎn)單突變型；896位點(diǎn)單突變型；1196、896位點(diǎn)雙突變型)中TLR4蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果表明4組轉(zhuǎn)染了TLR4基因的HepG2細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)量顯著高于正常HepG2細(xì)胞(圖5)。

注：1為T(mén)LR4-WT；2為T(mén)LR4-1196T；3為T(mén)LR4-896G；4為T(mén)LR4-1196T，896G；5為對(duì)照組；與正常HepG2細(xì)胞相比，aP<0.01

圖5Westernblot檢測(cè)各組細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)水平(n=3)

3 討論

肝癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤，死亡率極高且發(fā)病率逐年上升[10]。TLR4對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲等生物學(xué)功能有重要的影響[11-12]。TLR4信號(hào)通路參與肝癌發(fā)生發(fā)展主要通過(guò)MyD88依賴(lài)以及非MyD88依賴(lài)信號(hào)途徑激活NF-κB和活化激活蛋白1(AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子，從而促進(jìn)炎癥因子釋放，刺激肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞，引起細(xì)胞突變以及活化相關(guān)免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生[13-14]。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多因素過(guò)程，其復(fù)發(fā)率高使得治療效果難以令人滿意。

隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展，基因多態(tài)性和開(kāi)展個(gè)體化治療已成為當(dāng)代的熱點(diǎn)，研究肝癌發(fā)展影響的分子機(jī)制對(duì)評(píng)價(jià)環(huán)境危險(xiǎn)因素以及設(shè)計(jì)個(gè)體化治療方案具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。肝炎病毒是肝硬化和肝癌形成的重要原因，而臨床研究[15]表明896A及1196C在HCV 患者組的基因頻率分布要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組，896G及1196T可以作為防止HCV感染的保護(hù)因素。同時(shí)，Guarner-Argente 等[9]發(fā)現(xiàn)TLR4基因多態(tài)性不僅與HCV 易感性有關(guān)，還與肝硬化患者的發(fā)展程度有關(guān)，可用來(lái)預(yù)測(cè)HCV 引起的慢性肝病臨床進(jìn)展以及患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)性。因此，研究TLR4基因多態(tài)性對(duì)肝癌發(fā)展影響的分子機(jī)制具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建TLR4-WT(野生型)、896A/G、1196C/T單突變及雙突變重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，使TLR4蛋白在4組HepG2細(xì)胞中穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)。由于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒不同(野生或突變型)，可能會(huì)導(dǎo)致TLR4表達(dá)的含量或蛋白的結(jié)構(gòu)功能發(fā)生變化，從而影響HepG2細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲等生物學(xué)功能的變化。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法，用嘌呤霉素篩選掉沒(méi)有被成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，使4組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率為100%，排除由于轉(zhuǎn)染率的不同而導(dǎo)致導(dǎo)致TLR4表達(dá)含量或功能的變化。由于4組HepG2細(xì)胞除了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒不同，其他生理、各種環(huán)境條件均相同，若進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明4組HepG2細(xì)胞的生物學(xué)功能不同，而影響因素極有可能是轉(zhuǎn)染不同的質(zhì)粒后，過(guò)表達(dá)的TLR4的含量或結(jié)構(gòu)功能改變，因此可初步研究TLR4基因的多態(tài)性對(duì)肝癌發(fā)展的影響。雖然HepG2細(xì)胞本身表達(dá)少量TLR4蛋白，但進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)的4組細(xì)胞原本TLR4含量及功能一致，研究的是4組細(xì)胞過(guò)表達(dá)后產(chǎn)生的不同，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞作為對(duì)照。若要完全排除遺傳背景可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的產(chǎn)生干擾，需要將細(xì)胞中TLR4基因敲低或敲除。對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行TLR4基因敲低或敲除的方法主要是micro RNA和siRNA，但microRNA 和 siRNA轉(zhuǎn)染率很難在4組細(xì)胞中完全保持一致，同時(shí)可能會(huì)影響后轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒的表達(dá)，因此這種方法的可行性較低。若對(duì)動(dòng)物如小鼠進(jìn)行TLR4基因敲除，進(jìn)行造模后取其肝癌細(xì)胞，再將這4種質(zhì)粒(TLR4-WT；TLR4-1196T；TLR4-896G；TLR4-1196T，896G)轉(zhuǎn)染進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，研究TLR4基因多態(tài)性對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞生物功能的影響，并與TLR4基因多態(tài)性對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2生物學(xué)功能的影響進(jìn)行比較，若結(jié)果一致則更加嚴(yán)謹(jǐn)。因此，這也是本實(shí)驗(yàn)室今后需要深入研究的方向。

最后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖及基因測(cè)序結(jié)果表明成功合成了2種單突變及雙突變的質(zhì)粒；pLVX-TLR4-Puro質(zhì)粒酶切鑒定圖表明亞克隆成功，可進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；嘌呤霉素篩選出含有抗性基因的細(xì)胞及Westernblot結(jié)果表明TLR4重組質(zhì)粒已經(jīng)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，TLR4在HepG2細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞將為進(jìn)一步開(kāi)展肝癌的臨床個(gè)體化治療奠定基因。

(本文圖4見(jiàn)插圖9-2)