槲皮素-丙酮醛加合產(chǎn)物抗氧化性及抗蛋白糖基化活性

盧永翎，劉貴梅，李 普，侯 玉，呂麗爽*

丙酮醛（methyglyoxal，MGO）、乙二醛（glyoxal，GO）等1,2-二羰基化合物是美拉德反應(yīng)過程中產(chǎn)生的高活性中間產(chǎn)物，能進一步與氨基酸、肽以及蛋白質(zhì)的游離氨基酸形成一系列不可逆轉(zhuǎn)、穩(wěn)定的晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）。1,2-二羰基化合物和AGEs均具有一定毒性，會導(dǎo)致線粒體功能紊亂[1]、抑制DNA的合成[2]、改變內(nèi)皮細胞形態(tài)[3]，引發(fā)糖尿病以及糖尿病并發(fā)癥[4-5]、阿茲海默癥和白內(nèi)障等疾病[6-8]。食品加工過程（如加熱[9]、烘烤[10]、油炸[11]）及室溫貯藏[12]過程中美拉德反應(yīng)是外源性1,2-二羰基化合物的主要來源，其反應(yīng)活性與氨基酸、蛋白質(zhì)種類相關(guān)。油脂氧化過程也會產(chǎn)生包括MGO和GO的醛、酮、酸等小分子物質(zhì)[13]。在人體內(nèi)部，蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)、磷酸丙糖的降解[14]、細胞的糖降解[15]、蘇氨酸降解的酮糖代謝[16]等途徑均能產(chǎn)生MGO和GO。研究天然產(chǎn)物抑制體內(nèi)、外MGO、GO的形成及作用機制是食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域共同關(guān)注的熱點。槲皮素是黃酮醇類化合物的典型代表，廣泛分布于不同的水果和蔬菜中，具有抗氧化等多種藥理活性[17]。

前期研究證明，生理條件下槲皮素通過捕獲MGO、GO在A環(huán)的C-6或（和）C-8上形成相應(yīng)的單加合或二加合產(chǎn)物，從而抑制AGEs的形成[17-18]。而在美拉德反應(yīng)的不同階段，槲皮素的作用機制有待進一步論證。槲皮素捕獲MGO形成的加合物發(fā)生在A環(huán)，而B環(huán)的鄰位羥基沒有變化，據(jù)文獻[19]報道槲皮素B環(huán)羥基的抗氧化活性最強，推測加合產(chǎn)物可能依然具有抗氧化活性，從而在美拉德反應(yīng)后期持續(xù)發(fā)揮抗氧化和抗AGEs功效。為驗證此功效，本研究采用槲皮素與MGO反應(yīng)制備得到單加合和二加合產(chǎn)物（圖1），進而對加合產(chǎn)物的總還原能力、油脂抗氧化能力進行檢測；并運用氣相色譜法及熒光光譜法考察了加合產(chǎn)物在高溫油脂體系，加工條件下卵白蛋白-葡萄糖體系，以及生理條件下牛血清白蛋白-葡萄糖體系中，抑制MGO、GO和AGEs的活性。為研究槲皮素及其加合產(chǎn)物在美拉德反應(yīng)中抑制蛋白糖基化的作用機制和途徑提供理論基礎(chǔ)。

圖1 MM-1（A）和DM-2（B）的結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Structures of mono-MGO (MM-1) (A) and di-MGO (DM-2) (B)quercetin adducts

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬油為新鮮豬板油熬制。

槲皮素與MGO形成的單加合產(chǎn)物MM-1（HPLC，純度≥90%）及二加合產(chǎn)物DM-2（HPLC，純度≥90%）由實驗室自制；槲皮素（HPLC，純度≥98%）、MGO（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%水溶液）、GO（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%水溶液）、鄰苯二胺、卵白蛋白 美國Sigma-Aldrich公司；牛血清白蛋白（BR級） 上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；丁基羥基茴香醚（butyl hydroxylanisole，BHA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、無水乙醇、二氯甲烷、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙醛、2,3-丁二酮、VC均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7820A氣相色譜儀 美國Agilent公司；Infinite 200 Pro酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；743 Rancimat油脂氧化儀 瑞士Metrohm公司；UV-6100A紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；Biofuge Stratos離心機 美國賽默飛世爾公司；CentriVap離心濃縮儀美國Labconco公司；AUY220分析天平 日本島津公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；HH-S恒溫油浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；PHS-3C數(shù)字式pH計 上海三信儀表廠；KH-300DE超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 槲皮素主要加合產(chǎn)物制備

參見本實驗室方法[20]制備槲皮素的加合產(chǎn)物，將槲皮素與MGO按物質(zhì)的量濃度比1∶10在pH 7.4、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）中40 ℃反應(yīng)48 h，再通過Sephadex LH-20凝膠層析柱分離得到槲皮素與MGO的加合產(chǎn)物MM-1和DM-2。

1.3.2 槲皮素加合產(chǎn)物總還原能力的測定

參考文獻[21]的方法，分別取不同濃度的MM-1（或DM-2、槲皮素）的甲醇溶液1 mL與0.2 mol/L、pH 6.6的PBS 2.5 mL和1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液2.5 mL混合均勻，50 ℃水浴保溫20 min，加入10 g/100 mL三氯乙酸2.5 mL終止反應(yīng)，搖勻，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液5.0 mL，加入蒸餾水5.0 mL和0.1 g/100 mL的三氯化鐵溶液1 mL，混勻靜置10 min，以甲醇為空白于700 nm波長處測定吸光度。以吸光度表示還原能力，用對應(yīng)濃度的VC為陽性對照。

1.3.3 槲皮素加合產(chǎn)物油脂抗氧化能力的測定

參考文獻[22]的方法，分別準(zhǔn)確稱取5 份新鮮的自制豬油5.0 g置于5 個反應(yīng)池中，再分別添加MM-1、DM-2、槲皮素、BHA（對照）使其最終濃度均為1.0 mmol/L，一份作為空白對照，超聲溶解10 min。設(shè)置空氣流速20 L/h，溫度120 ℃，使用油脂氧化儀測定豬油的誘導(dǎo)時間。

1.3.4 槲皮素加合產(chǎn)物對油脂中MGO、GO形成的影響

稱取5.0 g玉米油于反應(yīng)管中，添加MM-1（或DM-2、槲皮素），使其終濃度分別為0.1、0.5、1.0 mmol/L，超聲溶解10 min；量取50 mL純凈水于測量池中。設(shè)定油脂氧化儀在170 ℃，空氣流速20 L/h條件下進行加熱反應(yīng)，收集1 h測量池反應(yīng)液30 mL置于－80 ℃冷凍備用。樣品液解凍混勻后，取1 mL參照本實驗室方法[17]，以鄰苯二胺為衍生化試劑，2,3-丁二酮為內(nèi)標(biāo)，氣相色譜法檢測樣品中MGO、GO并計算抑制率。

1.3.5 槲皮素加合產(chǎn)物對高溫條件下卵白蛋白-葡萄糖體系中MGO、GO和AGEs形成的影響

取6 支樣品管分別加入8 mg/mL卵白蛋白溶液（50 mmol/L，pH 8.0的PBS配制）2.5 mL和80 mg/mL葡萄糖溶液（50 mmol/L，pH 8.0的PBS配制）1.25 mL，再加入PBS使其最終體積為5 mL，旋渦混勻，置于110 ℃油浴加熱0、10、20、30、45、60 min，冷卻后于－80 ℃冷凍備用。樣品液解凍后加入2 倍體積甲醇除蛋白，13 000 r/min離心30 min，取上清液3 mL參照本實驗室方法[17]，測定MGO、GO的含量。樣品液解凍后混勻離心（15 000 r/min，20 min），取上清液用酶標(biāo)儀測定Ex/Em為340 nm/465 nm處相對熒光值。

按上述方法制備卵白蛋白-葡萄糖溶液體系，再分別加入MM-1（或DM-2、槲皮素）溶液，使其最終體積為5 mL，MM-1（或DM-2、槲皮素）最終濃度為0.05、0.1、0.5、1.0 mmol/L。旋渦混勻，置于110 ℃油浴加熱30 min，冷卻后于－80 ℃冷凍備用。按上述方法測定MGO、GO及熒光性AGEs，以PBS代替槲皮素及其加合產(chǎn)物作為對照計算抑制率。

1.3.6 槲皮素加合產(chǎn)物對生理條件下牛血清白蛋白-葡萄糖體系中MGO、GO和AGEs形成的影響

參照文獻[23]方法，取11 支樣品管依次加入0.2 mL青霉素和鏈霉素的混合液，4.5 mg/mL牛血清白蛋白溶液（0.2 mol/L，pH 7.4的PBS配制）2 mL和10 mmol/L葡萄糖溶液（0.2 mol/L，pH 7.4的PBS配制）1.25 mL，再加入PBS使其最終體積為6 mL，旋渦混勻，置于37 ℃水浴加熱0、2、6、12、24、72、144、192、288、432、720 h，冷卻后于－80 ℃冷凍備用。樣品液解凍后加入2 倍體積甲醇除蛋白，離心（13 000 r/min，30 min）取上清液3 mL參照本實驗室方法[17]，測定MGO、GO的含量。樣品液解凍后混勻，15 000 r/min離心20 min，取上清液用酶標(biāo)儀測定Ex/Em為340 nm/465 nm處相對熒光值。

按上述方法制備牛血清白蛋白-葡萄糖溶液體系，再分別加入MM-1（或DM-2、槲皮素）溶液，使其最終體積為6 mL，MM-1（或DM-2、槲皮素）最終濃度為0.05、0.1、0.5、1.0 mmol/L。旋渦混勻，置于37 ℃水浴加熱288 h，冷卻后于-80 ℃冷凍備用。按上述方法測定MGO、GO及熒光性AGEs，以PBS代替槲皮素及其加合產(chǎn)物作為對照計算抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均進行3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)以 ±s表示；采用Excel 2010、SPSS 17.0分析實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素及加合產(chǎn)物的總還原能力

圖2 MM-1、DM-2和槲皮素還原能力的測定Fig. 2 Concentration dependence of reducing power of mono-MGO(MM-1) and di-MGO (DM-2) quercetin adducts and quercetin

由圖2可知，MM-1、DM-2、槲皮素的還原能力隨其濃度的升高呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，且差異性顯著（P＜0.05）。在低濃度0.005 mmol/L時，DM-2、MM-1的活性要高于槲皮素。當(dāng)添加濃度為0.05 mmol/L時，槲皮素的還原性要遠高于VC，MM-1的還原性略高于VC，而DM-2低于VC?？梢婇纹に氐募雍袭a(chǎn)物有較好的還原性，3 種物質(zhì)的還原性在高濃度（0.05 mmol/L）存在明顯差異性（P＜0.05），分析原因可能是槲皮素的A環(huán)捕獲MGO分子后供電子效應(yīng)及空間位阻的共同影響，其作用機制有待進一步研究。

2.2 槲皮素及加合產(chǎn)物的抗油脂氧化能力

圖3 MM-1、DM-2和槲皮素對豬油誘導(dǎo)時間的影響（1.0 mmol/L）Fig. 3 Effect of mono-MGO (MM-1) and di-MGO (DM-2) quercetin adducts and quercetin on the oxidation induction time of lard (1.0 mmol/L)

表1 豬油添加不同抑制劑誘導(dǎo)時間的變化Table 1 Change in oxidation induction time of lard with different antioxidants added

由圖3及表1可知，當(dāng)MM-1、DM-2、槲皮素添加濃度為1.0 mmol/L時，均能顯著提高豬油的氧化穩(wěn)定性，且三者的誘導(dǎo)時間存在顯著性差異（P＜0.05）。槲皮素對豬油抗氧化性能最好，其誘導(dǎo)時間是空白組的7.8 倍，優(yōu)于對照品BHA；MM-1和DM-2的誘導(dǎo)時間分別是空白組的3.8 倍和2.3 倍。可見槲皮素與MGO形成加合產(chǎn)物后依然具有一定的油脂抗氧化活性。

2.3 槲皮素加合產(chǎn)物對高溫條件下對玉米油中MGO、GO形成的影響

圖4 MM-1、DM-2和槲皮素對玉米油（170 ℃、1 h）中MGO（A）、GO（B）抑制率的影響Fig. 4 Mono-MGO (MM-1) and di-MGO (DM-2) quercetin adducts and quercetin inhibited the formation of MGO (A) and GO (B) in a dosedependent manner during heat treatment of corn oil (170 ℃, 1 h)

由圖4可知，在170 ℃條件下將MM-1、DM-2、槲皮素添加入玉米油中加熱1 h，3 種物質(zhì)對MGO和GO的抑制率均隨添加量的增大而提高（除MM-1添加量為1.0 mmol/L時對MGO的抑制率略低于0.5 mmol/L）。在低濃度（0.1 mmol/L）時，MM-1對MGO的抑制率略高于槲皮素；當(dāng)大于等于0.5 mmol/L時，對MGO和GO的抑制率均為槲皮素＞MM-1＞DM-2。油脂中對GO的抑制作用優(yōu)于MGO，當(dāng)添加濃度達到1.0 mmol/L時，MM-1、DM-2、槲皮素對MGO的抑制率分別為27.5%、21.2%、39.3%，對GO的抑制率為40.5%、28.8%、56.0%。

2.4 槲皮素加合產(chǎn)物對高溫條件下卵白蛋白-葡萄糖體系中MGO、GO和AGEs形成的影響

模擬食品加工條件，構(gòu)建卵白蛋白-葡萄糖反應(yīng)體系。選擇反應(yīng)溫度110 ℃[24]（烘焙蛋糕中心溫度），新鮮雞蛋的pH 8.0（新鮮雞蛋）。如圖5所示，反應(yīng)時間為30 min時，MGO、GO和AGEs均達到峰值而后維持穩(wěn)定。MGO（179.5 μg/g）含量的最大值是GO（51.4 μg/g）的3.5 倍，推測卵白蛋白在糖基化過程中形成的主要產(chǎn)物是MGO。鑒于30 min 3 個指標(biāo)均達到最大值，后續(xù)選擇30 min作為反應(yīng)時間。

圖6 MM-1、DM-2和槲皮素在卵白蛋白-葡萄糖體系（110 ℃、pH 8.0、濃度比1:1 250、30 min）中對MGO（A）、GO（B）和AGEs（C）抑制率的影響Fig. 6 Inhibition of Mono-MGO (MM-1) and di-MGO (DM-2)quercetin adducts and quercetin on the formation of MGO (A) , GO (B)and AGEs (C) in a dose-dependent manner in OVA-glucose system

由圖6可知，MM-1、DM-2、槲皮素在110 ℃高溫條件下，對MGO、GO和AGEs均有一定的抑制效果，抑制率隨著抑制劑濃度（0.05～1 mmol/L）的增加而增大，呈現(xiàn)很好的量效關(guān)系，且同種抑制劑不同濃度間抑制率差異顯著（P＜0.05）。

相同濃度時槲皮素及其加合產(chǎn)物對MGO、GO和AGEs的抑制率由高到低依次是槲皮素＞MM-1＞DM-2。當(dāng)樣品濃度達到1 mmol/L時，MM-1、DM-2、槲皮素對MGO的抑制率為28.8%、24.9%、36.0%，對GO的抑制率為48.8%、45.8%、51.8%，對AGEs的抑制率為78.4%、75.3%、83.0%。

槲皮素加合產(chǎn)物在卵白蛋白-葡萄糖體系中抑制MGO、GO和AGEs的變化趨勢與文獻[21]報道中賴氨酸-葡萄糖體系相一致，進一步驗證了槲皮素捕獲MGO后的產(chǎn)物在美拉德反應(yīng)過程中依然具有活性，并參與抑制反應(yīng)。槲皮素加合產(chǎn)物對AGEs和GO的抑制效果，卵白蛋白體系與氨基酸體系相似；但對MGO的抑制率低15%左右。其原因可能是卵白蛋白-葡萄糖體系中MGO生成量過高，該含量是GO的3.5 倍，而在賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中的MGO和GO生成的量相近。

2.5 槲皮素加合產(chǎn)物對生理條件下牛血清白蛋白-葡萄糖體系中MGO、GO和AGEs形成的影響

牛血清白蛋白與人血清白蛋白有80%的同源性，且結(jié)構(gòu)組成相似[25]，因此牛血清白蛋白可以替代人血清白蛋白應(yīng)用于蛋白質(zhì)的糖基化研究。如圖7A所示，隨著時間的延長（0～30 d），MGO和GO的含量不斷增加；在0～3 d內(nèi)MGO和GO的含量增加緩慢，這是因為在低溫（37 ℃）條件下，美拉德反應(yīng)進行得非常緩慢[26]，在3～6 d內(nèi)，MGO和GO的含量均快速增加，且GO含量遠高于MGO；6 d后MGO的含量高于GO的含量，在8 d時MGO和GO含量均達到最大值，分別為35.2 μg/g和32.1 μg/g，在8～30 d變化趨勢不明顯。據(jù)文獻報道，體內(nèi)細胞中MGO和GO的濃度為1～2 μmol/L，細胞半數(shù)致死濃度為0.3～1 mmol/L[27]，1,2-二羰基化合物濃度過高會引起機體蛋白質(zhì)交聯(lián)[28]、組織損傷[29]、破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能[30]等。因此，有效抑制體內(nèi)MGO和GO的生成有重要的意義。

由圖7B可知，從3 d開始隨時間延長，形成的AGEs快速增多，在12 d達到最大值，產(chǎn)生熒光性AGEs的量是空白對照組的6.2 倍。AGEs的產(chǎn)生量變化趨勢與MGO和GO的趨勢基本一致。由此選擇反應(yīng)時間12 d，研究在牛血清白蛋白-葡萄糖體系中槲皮素加合產(chǎn)物的抑制效果。

圖7 時間對牛血清白蛋白-葡萄糖體系（37 ℃、pH 7.4）中MGO、GO（A）和AGEs（B）產(chǎn)生量的影響Fig. 7 Effect of reaction time on the production of MGO/GO (A) and AGEs (B) in BSA-glucose system (37 ℃, pH 7.4)

如圖8所示，MM-1、DM-2、槲皮素在生理條件下對MGO、GO和AGEs的抑制率與添加量呈現(xiàn)量效關(guān)系，同種抑制劑不同濃度間的抑制率差異性顯著（P＜0.05）；濃度相同時，槲皮素及其加合產(chǎn)物對3 個指標(biāo)的抑制率均為槲皮素＞MM-1＞DM-2，且差異性顯著（P＜0.05），這與加工條件下的變化趨勢相一致。

圖8 MM-1、DM-2和槲皮素在牛血清白蛋白-葡萄糖體系（37 ℃、pH 7.4、12 d）中對MGO（A）、GO（B）和AGEs（C）抑制率的影響Fig. 8 Mono-MGO (MM-1) and di-MGO (DM-2) quercetin adducts and quercetin inhibited the formation of MGO (A), GO (B) and AGEs (C)in a dose-dependent manner in BSA-glucose system (37 ℃, pH 7.4, 12 d)

當(dāng)樣品的濃度為1.0 mmol/L時，MM-1、DM-2、槲皮素對MGO的抑制率分別為14.6%、11.6%、19.7%；對GO的抑制率分別為16.9%、12.6%、21.3%；對AGEs的抑制率為58.0%、46.7%、71.3%。以上實驗結(jié)果與加工條件下的抑制效果相比偏低，推測主要是由于在生理條件下，蛋白糖基化反應(yīng)緩慢，形成的MGO、GO和AGEs的量較低。該實驗結(jié)果驗證在體內(nèi)環(huán)境中，槲皮素與MGO形成的加合產(chǎn)物依然可以起到抑制MGO、GO和AGEs生成的功效。

3 結(jié) 論

槲皮素與MGO形成的MM-1和DM-2均具有較好的還原性和油脂抗氧化活性。在高溫油脂體系、卵白蛋白體系和生理條件實驗中，MM-1和DM-2對MGO及GO的抑制率均隨添加量的增大而提高，對GO的抑制效果優(yōu)于MGO，活性依次為DM-2＜MM-1＜槲皮素。由此可知，槲皮素的A環(huán)在捕獲MGO形成加合產(chǎn)物后，依然具有一定的抗氧化及抗蛋白糖基化的后續(xù)活性。