三種基因檢測分型方法在耐碳青霉烯抗生素肺炎克雷伯菌基因分型中的應(yīng)用對比觀察

王鳳平，朱梓年，張霆，張拔山

(東莞市人民醫(yī)院，廣東東莞523000)

目前，碳青霉烯類藥物是治療腸桿菌科細菌感染最強效的β-內(nèi)酰胺類藥物[1,2]。一旦細菌發(fā)生碳青霉烯類藥物耐藥，嚴重影響臨床治療效果[3,4]。全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)顯示，2015年我國耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細菌(CRE)發(fā)生率約為7.6%，且呈逐年上升趨勢。肺炎克雷伯菌是引起醫(yī)院感染的臨床分離率最高的細菌之一。了解耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的同源性，掌握其流行病學(xué)特點，可以有效的防止CRE在我國的播散。當(dāng)前，常用的分子流行病學(xué)分析的方法包括限制性內(nèi)切酶聯(lián)合脈沖場凝膠電泳(PFGE)、隨機多態(tài)核苷酸序列(RAPD)、腸桿菌基因間重復(fù)序列PCR(ERIC-PCR)、基因外重復(fù)回文序列PCR(REP-PCR)、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)和多位點核酸序列測定(MLST)等。其中PFGE和MLST的分型結(jié)果準確，被譽為分子流行學(xué)分析細菌的“金標(biāo)準”[5]，但這兩種方法對技術(shù)設(shè)備要求高、檢測周期長、費用高，限制了其在基層醫(yī)院中的開展和大規(guī)模應(yīng)用。目前關(guān)于PFGE、MLVA和ERIC-PCR在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的應(yīng)用情況相關(guān)報道較少。2013年1月～2015年12月，本研究比較了PFGE、MLVA和ERIC-PCR對耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的分型效果，旨在尋求一種或兩種可以應(yīng)用于基層醫(yī)院的同源性分析的方法。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 選擇東莞市人民醫(yī)院2013年～2015年間臨床分離的20株耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌，菌株均保存于脫脂牛奶，-70 ℃低溫。實驗前把菌株從脫脂牛奶復(fù)蘇到血平板，再從血平板中挑取純菌株的單個菌落于250 μL的無菌蒸餾水中配成細菌懸液，備用。全部20株復(fù)蘇菌株在培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)后生長狀態(tài)良好。

1.2 耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的分型方法

1.2.1 PFGE分型方法 參照國際實驗室分子分型監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)PulseNet中肺炎克雷伯菌PFGE分型標(biāo)準化方案進行實驗[5,6]。用bioMérieux DENSIMAT比濁儀調(diào)整細菌懸液濃度，使?jié)岫葹?.8～4.0。加入1% Seakem Gold:1% SDS膠，混勻制備膠塊。使用含蛋白酶K的細胞裂解液(CLB)消化2 h。純水清洗膠塊2次；TE(10 mmol/L Tris:1 mmol/L EDTA，pH值8.0)清洗膠塊4次。使用45U XbaⅠ(TAKARA公司)內(nèi)切酶進行酶切，37 ℃孵育2 h。在CHEF-DR Ⅲ(Bio-Rad Laboratories公司)電泳儀中進行脈沖場電泳。電泳參數(shù)為6～36 s，18.5 h。電泳結(jié)束后，使用GelRed核酸染料染色。在讀膠儀中成像，并轉(zhuǎn)換成TIFF圖像格式保存。PFGE圖像錄入BioNumerics軟件包進行處理，識別圖像條帶，經(jīng)統(tǒng)一的分子質(zhì)量標(biāo)準，進行聚類，構(gòu)建聚類樹。分子量標(biāo)準用H9812經(jīng)過XbaI酶切后的片段。

1.2.2 MLVA分型方法 使用Quigen細菌核酸提取試劑盒提取20株細菌的DNA。使用參考文獻中的8對引物[7]，引物見表1。分別對20株菌的DNA進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：總體積20 μL，其中10×PCR緩沖液2 μL, MgCl21.25 μL,dNTP1.6 μL,引物0.5 μL, DNA模板0.5 μL, TaqDNA聚合酶1 U，滅菌雙蒸水14 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中(含0.5 μg/mL溴化乙錠)，電壓為5 V/cm,電泳60 min。凝膠成像儀觀察結(jié)果。將片段大小作為字符，導(dǎo)入BioNumerics軟件包進行處理，構(gòu)建最小生成樹。

表1 MLVA分型所用的引物序列

1.2.3 ERIC-PCR分型方法 使用Quigen細菌核酸提取試劑盒提取DNA。引物：ERIC-2序列：aagtaagtgactggggtgagcg[8]。PCR反應(yīng)體系：總體積20 μL，其中10×PCR緩沖液2 μL, MgCl2 1.25 μL,dNTP1.6 μL,引物0.5 μL, DNA模板0.5 μL, TaqDNA聚合酶1 U，滅菌雙蒸水14 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s, 52 ℃退火45 s, 72 ℃延伸4 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中(含0.5 μg/mL溴化乙錠)，電壓為5 V/cm，電泳90 min，凝膠成像儀觀察結(jié)果。圖譜錄入BioNumerics軟件包進行處理，識別圖像條帶，進行聚類，構(gòu)建聚類樹。

1.3 Simpson差異指數(shù)測算 采用BioNumerics軟件進行同源性分析，測算各方法Simpson差異指數(shù)(D值)，計算公式為D=1-{∑[nj (nj-1)]}/ [N (N-1)]，其中nj為屬于第j個型別的菌株數(shù)，N為特定群體中的總菌株數(shù)。D值介于0～1之間，D值越趨于1表示該方法分辨力越好。

2 結(jié)果

2.1 PFGE分型結(jié)果 20株耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌最終分為18個PFGE型，其中2個帶型包含2株菌，其余16個帶型分別只包含1株菌。其中1號和12號、2號和7號兩組菌分別具有相同的PFGE型別，提示1號和12號、2號和7號之間可能存在流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。

2.2 MLVA分型結(jié)果 20株菌的MLVA分型結(jié)果顯示20株耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌最終分為17個MLVA型，其中3個型別分別包含2株菌，其余16個型別只包含1株菌。以差異位點為小于等于2個位點作為構(gòu)建MLVA群的標(biāo)準，20株菌中構(gòu)建出4個MLVA克隆群。

2.3 ERIC的分型結(jié)果 20株菌分為14個ERIC型，其中優(yōu)勢型別包含5株菌(6、11、12、13、18)，次優(yōu)勢型別包含3株菌(7、8、14)，其余12個型別分別只包含1株菌。

2.4 PFGE、MLVA、ERIC-PCR三種分型方法的比較 PFGE、MLVA和ERIC-PCR法對耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的D值分別為0.989 5、0.984 2、0.931 6。

3 討論

PFGE是一種分型能力較高的分子流行病學(xué)調(diào)查工具[5,6]。它用限制性位點相對少的酶消化細菌的基因組，得到數(shù)量相當(dāng)少但更大的限制性片段，采用了兩個交變電場電泳，穿過瓊脂糖的電場作周期性的改變，使得DNA分子的電泳方向隨著電場的變化而變化，大分子DNA得以分離，最后可以產(chǎn)生一個有5～20條清晰的分辨較好的圖譜。PFGE方法的分辨力和可重復(fù)性都很高，是腸球菌、腸桿菌和葡萄球菌基因分型的“金標(biāo)準”。從本研究的研究結(jié)果看到，20株肺炎克雷伯菌被分為18個PFGE型，D值為0.989 5，說明PFGE具有較好的分型能力。但PFGE操作中必須使所有酶與緩沖液浸透凝膠塊，完成鑒定時間較長，且不適合沒有標(biāo)準化的實驗室。同時PFGE專業(yè)設(shè)備昂貴，試劑價格高，嚴重影響了PFGE在基層醫(yī)院的應(yīng)用。

MLVA是依據(jù)基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)的特征來達到菌株基因分型的目的。VNTR是指由一段核苷酸序列(核心序列)多次串聯(lián)重復(fù)所形成的高度可變區(qū)域[9,10]，其結(jié)構(gòu)主要由兩部分組成，中間的核心區(qū)和外圍的側(cè)翼區(qū)，中間的核心區(qū)為串聯(lián)重復(fù)單位，每個重復(fù)單位在兩個到幾十個堿基之間，重復(fù)2～20次。MLVA分型技術(shù)采用了多重PCR擴增技術(shù)，能對多個VNTR位點同時進行分析，結(jié)果以數(shù)字方式輸出，通過相關(guān)電腦軟件進行聚類分析，分析所用的儀器也較簡單，易獲得，幾乎整個過程都可以由計算機自動化處理。且與PFGE相比，MLVA分型結(jié)果采用較簡便數(shù)字形式，有助于細菌的分子流行病學(xué)研究。在本研究中20株肺炎克雷伯菌被分為17個MLVA型，D值0.984 2。與“金標(biāo)準”PFGE相比，D值只差了0.005 3，說明MLVA分型能力與PFGE十分相近。本實驗的MLVA以差異位點為小于等于2個位點作為構(gòu)建MLVA群的標(biāo)準，20株菌中構(gòu)建出4個MLVA克隆群?？梢酝ㄟ^菌株的流行病學(xué)信息和其他生物學(xué)信息進一步尋找各克隆群的特征。相對PFGE來說，MLVA相對客觀，易于操作，并且可在短時間內(nèi)就可以獲得較好的結(jié)果。另外，MLVA一次可以處理大量的樣品，可以將PFGE有時不能區(qū)分的具有不可分辨電泳模式的菌株精確區(qū)分。同時，MLVA分型只需要普通的PCR儀和電泳儀等簡單的設(shè)備，價格也相對便宜，這十分適用于普通的醫(yī)院。

ERIC-PCR分型技術(shù)是以腸桿菌科基因間重復(fù)序為引物進行PCR，能擴增出多態(tài)性的DNA圖譜，根據(jù)擴增出來的條帶大小和數(shù)目進行分型。ERIC-PCR條件相對簡單，只需要簡單的PCR儀和電泳儀，而且重復(fù)性較好，此方法已由國內(nèi)外許多學(xué)者將其與PFGE、RAPD和限制性內(nèi)切酶等DNA分型技術(shù)進行比較，其分辨率與PFGE 高度一致[11]。在本研究中20株肺炎克雷伯菌被分為14個基因型，D值為0.931 6。并且可以通過菌株的流行病學(xué)信息和其他生物學(xué)信息進一步尋找各型別(尤其是優(yōu)勢型別和次優(yōu)勢型別)的特征。雖然其分型能力相對于PFGE和MLVA來說稍微遜色一點，但它只需要一條腸桿菌科細菌通用的引物，不需要針對每種不同細菌再進行引物的合成，是三者中條件設(shè)備最為簡單的方法。這在基層醫(yī)院尤為適用。

另外，從本研究的PFGE分型結(jié)果可以看到，20株耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌一共被分為18個PFGE型，其中16個帶型分別只包含1株菌。這說明這些耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌大部分都是散發(fā)存在的。但是，這其中的1號和12號、2號和7號兩組菌分別具有相同的PFGE型別，提示1號和12號、2號和7號之間可能存在流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。這四株細菌必須引起重視，它們之間可能存在克隆的關(guān)系。

綜上所述， PFGE、MLVA和ERIC-PCR對耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的分型結(jié)果均較好。MLVA、ERIC-PCR的分型結(jié)果與PFGE相近，且需要的條件設(shè)備簡單、價廉，可應(yīng)用于基層醫(yī)院進行細菌的同源性分析，有利于預(yù)防和控制耐藥菌株的擴散。